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方法文章

非束缚式脑电遥测：硬膜外与深部脑内立体定位脑电电极植入

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DOI：

10.3791/54216

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2016年6月25日

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1Department of Neuropsychopharmacology, Federal Institute for Drugs and Medical Devices (Bundesinstitut für Arzneimittel und Medizinprodukte, BfArM), 2Molecular and Cellular Cognition Lab, German Center for Neurodegenerative Diseases (Deutsches Zentrum für Neurodegenerative Erkrankungen, DZNE)

本文内容

摘要

非束缚式脑电遥测技术是一种有价值的实验方法，可用于在自由活动的啮齿类动物中长期记录体内脑电图。本详细方案描述了立体定位下在不同脑区进行硬膜外和深部脑内电极植入的操作步骤，以实现对中枢神经系统节律性活动及相关行为阶段的可靠记录。

摘要

植入式脑电图遥测技术在神经精神疾病、神经退行性疾病以及癫痫的转基因小鼠模型的神经学表征中具有核心意义。该强大技术不仅能提供关于潜在病理生理机制的宝贵见解， 即，中枢神经系统相关疾病的病因和发病机制，同时也促进了新型转化医学研究的发展， 即，治疗方法。与使用夹克式记录系统或有线系统的竞争性技术因具有非生理性的束缚或半束缚特性而存在局限性不同，遥测脑电图（EEG）记录克服了这些缺点。从技术上讲，可植入式EEG遥测技术能够在多种生理和病理生理条件下，精确且高灵敏度地测量硬膜外和深部颅内EEG。首先，我们详细介绍一种直接、成功、快速且高效的硬膜外（表面）EEG记录技术，可获得高质量的皮层脑电图。其次，我们演示如何植入深部颅内EEG电极。 例如，于海马区（电海马图）。两种方法均采用计算机化的三维立体定位电极植入系统。射频发射器本身被植入小鼠和大鼠的皮下囊袋中。此外，必须特别注意实验动物术前、术中和术后的处理。文中详细描述了小鼠和大鼠的术前准备、合适的麻醉方法，以及术后护理与疼痛管理。

引言

遥测技术是一种极为重要的方法学手段，可用于测量各种体型清醒且无束缚动物的多种行为学和生理学参数，尤其适用于脑电图（EEG）、心电图（ECG）、肌电图（EMG）、血压、核心体温或活动度的监测1-7。理论上，任何物种均可采用可植入式脑电遥测技术进行分析，从小型实验啮齿类动物（如小鼠和大鼠）到猫、狗、猪以及灵长类动物均适用3,8。甚至鱼类、爬行动物和两栖类动物也可通过遥测技术进行研究9。在过去的二十年中，可植入式脑电遥测技术已被证实对于表征多种人类疾病转基因动物模型具有重要价值，例如癫痫、睡眠障碍、神经退行性疾病及神经精神疾病模型7,10-12。过去已有大量文献描述了采集小鼠和大鼠生理数据（包括生物电位）的各种方法学手段。曾受到广泛关注的技术主要包括背心式记录系统、物理束缚方法、非植入式无线发射器以及有线连接系统13,14。如今，市面上已有多种可用于遥测植入的商业化系统。然而，文献检索也显示另有29篇出版物报道了自行研制的遥测系统15-40。尽管自制系统可能成本更低且更符合用户特定需求，但商业化系统操作直接、安装相对简便，可快速完成设置。

与物理束缚法、背心式穿戴系统或有线连接等竞争性技术相比，可植入式脑电图无线遥测技术具有多项优势。后者在定义上即具有束缚性，即动物无法自由活动或其正常行为受到干扰。甚至可能需要对动物实施麻醉才能获取可靠数据。然而，现代有线系统可能束缚性较低，但这仍需科学验证。相比之下，无线遥测技术允许动物在无时空限制的情况下展现其全部行为谱，因此被认为优于束缚性方法，并且更能预测在人类中可能获得的结果1,3。已知束缚性方法会显著改变基本的生理参数，例如摄食量、核心体温、血压、心率以及身体活动等3。有线系统代表了一种至今仍被广泛使用的经典束缚性方法13,14。电极（无论是硬膜外电极还是深部电极）通常连接至一个固定于颅骨上的微型插座。该插座暴露于体表，以便连接电缆，使动物能够相对自由地移动。尽管如今的有线系统已变得极为精细且高度灵活，但其主要缺点之一仍是具有一定的半束缚性。此外，由于动物倾向于抓挠或摆弄从其身体（头部）引出的任何外部装置，电极植入部位可能存在感染风险。尽管早在20世纪60年代末已有在多种物种中应用无线遥测技术的报道，该技术已存在数十年，但直到最近才变得价格可接受、性能可靠且相对易于使用10,41,42，尤其是在小实验啮齿类动物（如小鼠和大鼠）中。目前市场上已有小型可植入式脑电图发射器出售，可用于体重超过20 g（约10周龄）的小鼠。因此，近年来对转基因小鼠模型进行电生理表征已成为可植入式脑电图无线遥测技术的主要应用领域之一。动物体型已不再是绝对的实验限制因素，而发射器电池的寿命才是。尽管电池寿命有限，但可植入式发射系统能够最大程度地减少因使用束缚系统而导致的与记录相关的潜在应激。啮齿类动物可以完整展现其生理行为谱，包括静息、运动活动（探索）和睡眠（REM睡眠、慢波睡眠）43,44。重要的是，可植入式无线遥测技术可显著减少实验动物的使用数量3。目前科学界正在热烈讨论如何限制实验动物的使用数量并减轻其痛苦。显然，动物实验及人类和动物疾病动物模型对于理解基本的病理生理机制以及推动治疗进展至关重要。此外，动物实验在药物研发过程中也具有关键作用，它们极大地促进了药物注册所需的临床前/毒理学研究，从而服务于人类和动物健康。值得注意的是，目前尚无任何可替代动物研究的方法能够揭示复杂的病理生理机制，而这些机制若不通过动物实验将无法被阐明。与此同时，欧盟和美国所倡导的“3R”原则，即替代（replacement）、减少（reduction）和优化（refinement）策略，强烈鼓励开发补充性和替代性研究方法。无线遥测技术正是成功实施3R策略的一个重要范例，因为它相比其他技术能够减少实验动物的使用数量及其所受的痛苦。

本文提供了在小鼠和大鼠中进行皮下囊袋植入射频发射器的详细且连贯的分步操作方法。在此之后，描述了立体定位硬膜外和深部脑内脑电图（EEG）电极的放置技术。特别关注了动物饲养条件、麻醉、围手术期及术后疼痛管理以及可能的抗感染治疗。重点在于采用计算机化的三维立体定位方法，以精确定位硬膜外和深部脑内结构。我们还讨论了脑电图电极植入过程中常见的实验误区，以及减少创伤和优化术后恢复期间疼痛管理的策略。最后，展示了表面和深部脑电图记录的实例。

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方案

 伦理声明：所有动物实验均按照当地及机构动物护理委员会（德国波恩大学、BfArM、LANUV）的指导原则进行。此外，所有动物实验均遵照上级法律法规执行。 例如，1986年11月24日欧洲共同体理事会指令（86/609/EEC）或各地区及国家相关立法。特别致力于尽量减少使用动物数量及其所受痛苦。

1. 实验动物

  1. 实验动物及物种的选择
    1. 在啮齿类动物中进行遥测研究， 即符合特定人类疾病在同源性、同形性和可预测性方面要求的小鼠和大鼠 7,9,45,46.
      注意：可获取的各类小鼠和大鼠品系在基本生理学和病理生理学特征上可能存在显著差异 47-49.
    2. 在进行后续电生理实验之前，应考虑或评估小鼠/大鼠品系的生理学和病理生理学特征。 例如, 对麻醉剂适用剂量的反应、睡眠结构及癫痫易感性 50,51.
    3. 在研究设计中注意性别特异性特征。动情周期可显著影响中枢节律性、其昼夜依赖性、睡眠及癫痫活动 52-54因此，进行性别特异性分析。
      注意：若经费和实验条件有限，建议仅使用雄性小鼠。
  2. 动物饲养与操作
    1. 带过滤盖的笼子或更佳的独立通气笼子中的家鼠和大鼠。
    2. 将小鼠从动物房转移至专门用于植入动物及其后续记录的特殊实验室房间内的通风柜中（图1).
    3. 运输后适应：将动物置于通风柜中，在标准条件下饲养一周以适应环境， 即21 ± 2 °C 环境温度，50 - 60% 相对湿度，以及标准的 12 小时光照/黑暗循环。
    4. 手术植入前，将3 - 4只实验小鼠共同饲养于透明聚碳酸酯II型笼具（26.7 cm x 20.7 cm x 14.0 cm，面积410 cm²）中2）与 随意摄取 可自由获取饮用水和标准颗粒饲料。使用透明聚碳酸酯III型笼具（42.5 cm × 26.6 cm × 18.5 cm，面积800 cm²）2）适用于大鼠。
    5. 此阶段不要将动物分笼或隔离饲养，因为隔离可能导致应激反应，进而影响后续实验结果。然而，在手术置入器械后，需将动物单独饲养，因为动物可能会抓挠或干扰伤口缝线或金属夹（见下文）。
    6. 避免开放式饲养条件，因为这些条件被认为不适合多种科学研究问题， 例如睡眠研究。
    7. 使用小鼠和大鼠专用的设备，以确保小鼠和大鼠无法感知彼此的存在，因为这会给动物带来额外的应激。

2. 脑电图遥测系统

注意：所述方案基于一种 commercially available telemetry systems，用于脑表面及深部脑内 EEG 记录（图2）。

  1. 使用适用于小鼠或大鼠植入的射频遥测植入装置，例如，单通道发射器或双通道发射器。
    注意：这两种发射器均可测量多种生物电位信号，即脑电图（EEG）、心电图（ECG）、肌电图（EMG），以及身体活动和体温。装置配备磁控开关机制。 发射器及传感导线均以无菌状态提供。若需重复使用发射器，请遵循制造商提供的再灭菌说明。
  2. 例如，若需进行高频γ波分析（最高达500 Hz），应选择具有较高标称采样率（f，最高达5,000 Hz）和发射器带宽（B，最高达500 Hz）的发射器。特别应注意奈奎斯特-香农采样定理，即脑电数据最多可分析至f/2的绝对上限，不可超过此限。为确保可靠的频率分析，建议频率带宽（B）设置为f/10至f/5之间。
    注意：所研究的科学问题必须符合发射器的技术规格。

3. 麻醉与疼痛管理

  1. 使用异氟烷吸入麻醉。
    1. 将动物放入一个 "诱导室" 充满4-5%异氟烷和0.8-1%氧气或碳合气（5% CO₂）2 和 95% O₂2) L/min。使用硅胶面罩维持所需的麻醉深度，通入1.5–3.0%异氟烷和0.8–1%氧气或碳合气，流量为 L/min（图 3A).
      注意：合适的异氟烷浓度因动物的体重（分布容积）、年龄、性别和遗传背景而异。如果无气体麻醉设备可供使用， 即, "诱导室"，碳合气体或氧气供应，流量计，异氟烷蒸发器，废气清除系统，参见第3.2节 由吸力系统（废气清除系统）抽出 图3A应安装该装置以避免实验人员接触异氟烷（出于演示目的，视频中未显示管道）。
  2. 当吸入性麻醉剂不可用时，可采用注射用麻醉剂进行麻醉。将盐酸艾司氯胺酮（啮齿类动物剂量100 mg/kg）与盐酸赛拉嗪（啮齿类动物剂量10 mg/kg）用0.9% NaCl配制成混合溶液，根据动物体重经腹腔注射给药。
  3. 仔细观察动物的麻醉深度，通过尾部夹捏、足部夹捏以及监测呼吸频率（小鼠：150 - 220 次/分钟；大鼠：70 - 115 次/分钟）来评估。检查是否出现可能的喘息现象。
    注意：不同的小鼠和大鼠品系对麻醉的敏感性可能存在差异，转基因小鼠模型也同样如此。
    注意：气管插管在啮齿类动物中并非必需。事实上，插管会增加气管损伤的风险。

4. 手术器械——一般方面

  1. 手术期间及术后使用循环温水毯、电热板、加热灯、强制暖风装置或暖贴等提供额外保温，以维持动物核心体温在 36.5 - 38.0 °C（98.6 - 100.4 °F）。
    注意：由于小型啮齿类动物体表面积与体积之比较高（小鼠：10.5 ×（体重 g）2/3；大鼠：10.5 ×（体重 g）2/3），易发生低体温。
  2. 在整个植入过程及早期恢复阶段，应防止角膜干燥，使用含石蜡基的人工泪液软膏或右旋泛醇覆盖眼睛（参见视频资料），直至眨眼反射完全恢复。
  3. 对手术器械（见材料表）进行高压灭菌或置于消毒剂中消毒。
    注意：一种简便快速的方法是使用基于高温玻璃珠的手术器械灭菌器。
  4. 准备双目手术放大显微镜，并配备冷光源，通过柔性或自支撑可移动导光管提供强照明。
  5. 穿戴洁净实验服、口罩、头帽及无菌手套。
    注意：最佳耗材和器械可能因实验室而异，必须符合各实验室及机构的具体要求。

5. 手术——发射器放置

  1. 使用剃毛器去除完全麻醉的小鼠/大鼠头皮上的体毛。用消毒剂清洁剃毛区域。 例如， 70% 乙醇和含碘消毒剂进行皮肤消毒。避免因过度暴露引起皮肤刺激或炎症。将动物置于加热垫上呈俯卧位，以在麻醉期间维持体温。
  2. 使用解剖刀从额部开始沿中线切开头皮，直至颈部，使前囟（bregma）颅骨解剖标志和斜方肌清晰可见。从枕部切口处开始，使用手术剪通过钝性分离沿动物体侧打开一个皮下囊袋。
  3. 在皮下囊袋内注射1 ml 0.9% NaCl。将发射器置于皮下袋内，其感应导线朝向头侧，位置位于靠近腹侧腹部区域的腰部。若发射器带有缝合标签，使用一针或多针缝合线（连续缝合）将发射器固定于背部/侧部皮肤。
    请注意，固定发射器并非必需。 特别注意防止手术部位和发射器植入物受到污染。应使用手术巾将无菌区域与非无菌区域正确隔开。
  4. 有关术后护理和疼痛管理，请参见第8节。

6. 立体定向表面电极植入

  1. 将动物置于立体定位仪上并进行麻醉，借助耳杆和鼻夹仔细固定头部，使颅骨的前囟（bregma）和后囟（lambda）解剖标志处于同一水平面图3B）。使用耳杆时避免损伤内耳，必要时可用棉球包裹耳杆。此预防措施可确保头部在立体定位仪中牢固固定。
  2. 用棉签清洁骨膜，避免损伤颞肌和枕肌。用0.3% H₂O₂预处理颅骨表面的浅薄层。2O2 小鼠颅骨和3% H2O2 用于大鼠颅骨。该操作可清晰暴露颅缝以及颅骨测量标志点，如前囟点（bregma）和后囟点（lambda）。图4B、C).
  3. 使用专为小鼠和大鼠设计的、配备齐全的立体定位装置，包括适配小鼠和大鼠头颅尺寸的耳杆和鼻夹的立体定位仪。确保该立体定位仪配备有连接异氟烷蒸发器和异氟烷废气清除模块的气体麻醉面罩。
    注意：建议使用配备专用小鼠和大鼠脑坐标软件的计算机化三维立体定位系统，该软件应包含导航用户界面和三维图谱，支持轴向、冠状和矢状视图。
  4. 将精密钻机安装在立体定位仪的垂直臂上。若无计算机化的立体定位系统，可使用固定在垂直臂上的铅笔或笔尖在颅骨顶部所选坐标位置留下微小标记。
  5. 钻孔时需谨慎操作，注意小鼠与大鼠的颅骨厚度存在显著差异。此外，需注意啮齿类动物颅骨的厚度随部位不同而有明显变化。 例如， 在小鼠中， 额骨中线切片：320–390 μm，冠状切片：300–430 μm； 顶骨中线切片：210 - 250 μm，冠状切片：200 - 210 μm； 枕骨：中线切片：600 - 730 μm，横向切片：380 - 420 μm。
  6. 以最大速度无压钻孔。
    注意：这可以避免颅骨的强直性压陷，否则可能导致钻头突然穿透并主要对皮质区域造成潜在损伤。开颅手术建议使用神经外科高速精密电动钻系统。
  7. 在选定坐标处使用直径通常为 0.3 - 0.5 mm 的钻头钻孔。
    注意：孔的直径可能因电极直径而变小。一般而言，直径越小，产生的损伤越轻。
  8. 弯曲发射器传感导联的尖端（作为硬膜外电极），并将其直接置于选定坐标位置的骨孔内硬脑膜上。或者，使用皮层螺钉并将其机械连接至发射器的传感导联图4A).
  9. 对于表面记录 例如，小鼠运动皮层 M1/M2，定位电极， 例如， 颅骨1毫米，外侧1.5毫米（左半球）。将硬膜外参考电极置于小脑皮层：前囟后6毫米，前囟外侧1毫米（左半球）或前囟后6毫米，前囟外侧1毫米（右半球）图4D).
    注意：小脑可作为参考区域，因为它是脑电图上无活动的区域。小鼠和大鼠的立体定位坐标可从标准的立体定位图谱中获得。
  10. 使用玻璃离子牙科水泥（水基）固定电极，该材料极为坚硬，且对下方的颅骨具有强效黏附性。
    注意：如果使用玻璃离子体牙科水泥，则无需锚定螺钉来固定电极。
  11. 让水泥干燥5分钟。使用不可吸收的5-0/6-0缝合材料，采用连续缝合方式闭合头皮。也可使用皮肤胶替代缝合。根据电极植入位置密切监测脑电图（EEG）记录质量。注意：钻孔处可能发生骨化，随时间推移可能将电极抬起，从而因肌电（EMG）和心电（ECG）干扰导致EEG信号质量下降，进而限制最佳记录时长。
  12. 术后护理和疼痛管理，请参见第8节。
  13. 死后验证脑电图电极位置。
    1. 安乐死时，将动物放入孵育室，并通入100%二氧化碳。以每分钟置换孵育室体积10%–30%的速度将二氧化碳注入孵育室现有空气中，此方法可使动物迅速失去意识，同时最大程度减少动物痛苦。
      注意：避免让清醒的动物突然暴露于高浓度二氧化碳中 >70%，因为已有研究表明该比例会导致痛苦。
    2. 观察每只小鼠/大鼠是否出现呼吸停止及眼球颜色变浅。维持CO2 呼吸停止后，持续供气至少1分钟。通常在2至3分钟内失去意识。
    3. 若同时观察到这两个体征，则将啮齿类动物从笼中移出；否则继续使其暴露于CO中2如果在2到3分钟内未出现意识丧失，应检查腔室填充速率。
    4. 为验证电极放置位置是否正确，死后摘取脑组织， 例如，随后进行一氧化碳2 安乐死后用4%多聚甲醛在PBS（pH 7.4）过夜。或者，使用预冷的磷酸盐缓冲液（PBS；pH 7.4）对动物进行心脏灌注，随后灌注溶于PBS中的4%多聚甲醛（PFA）溶液。
    5. 室温下用4%多聚甲醛固定脑组织2-4小时，随后在PBS中的30%蔗糖溶液中进行 cryoprotection（防冻处理），并将脑组织于4°C保存，直至后续实验处理。
    6. 使用标本包埋基质进行冰冻切片，将脑组织固定于立体定位切片块上，利用冰冻切片机切割60 µm冠状切面。将切片贴附于载玻片上，空气干燥后，采用标准尼氏蓝染色技术染色，以显示侧支导管及先前电极位置。
      注意：该方法还可揭示表面电极是否因放置过深而在皮层顶部造成轻微压迫。

7. 立体定向深部脑内脑电图电极植入

  1. 按照第6.1–6.2节所述方法对动物的头皮和颅骨进行预处理。仔细选择深部电极的类型，需考虑其材料特性，例如，直径、阻抗以及与发射器感应导线连接的可能性。
    注意：通常使用聚对二甲苯（Parylene）涂层的不锈钢或钨电极。电极特性必须符合具体的实验需求。 若电极未以无菌状态提供，使用前应在70%乙醇中孵育。由于电极为此实验目的而进行了涂层处理，因此不能采用基于加热的灭菌方法。
  2. 使用立体定位系统，按照第6节所述在选定坐标处钻孔。例如，若靶向小鼠CA1区（一个被广泛研究的脑区），则将差分电极置于以下相对于前囟的坐标：尾侧2 mm、外侧1.5 mm（右侧半球）以及背腹向（深度）2 mm。将一个硬膜外参考电极置于小脑皮层，例如，前囟后6 mm、前囟外侧1 mm（左或右半球）（图4D、E）。
    注意：小脑电极作为伪参考电极，放置于小脑的静息区域。立体定位坐标可参考标准的小鼠和大鼠立体定位图谱获得。
  3. 根据电极需插入脑内的深度，将其剪短至所需长度。通过将电极颅外部分与发射器导线的不锈钢螺旋部分弯曲成90°角，实现两者之间的连接。
  4. 通过机械方式将深部电极固定在发射器的感应导线上。应尽可能避免焊接，因为这可能在脑电图（EEG）记录中引入显著噪声。使用无菌手术刀片切除发射器导线尖端一小段外部硅胶绝缘层，以暴露其内部的不锈钢螺旋部分。
  5. 将发射器导线重新连接至深部脑电极，确保两部分之间形成合适且稳定的连接（图4F）。将已机械连接至发射器导线的植入电极固定在立体定位装置的垂直臂上。
  6. 使用玻璃离子体牙科水泥（水基）固定电极，该材料极为坚硬，并能与下方的颅骨实现牢固粘附。让水泥干燥5分钟。使用不可吸收的5-0/6-0缝合线进行连续缝合关闭头皮。 也可选用皮肤胶水替代缝合。
  7. 密切监测基于电极植入侧的脑电图记录质量。
    注意：钻孔部位可能发生骨化，随时间推移可能将电极抬升，从而因肌电（EMG）和心电（ECG）干扰导致脑电图质量下降，进而限制最佳记录时长。此问题在深部电极植入时尤为突出。
  8. 有关术后护理和疼痛管理，请参见第8节。
  9. 按照第6.13节所述方法，在动物死亡后验证脑电图电极的放置位置。

8. 术后护理与术后疼痛管理

  1. 在动物恢复足够的意识以维持胸卧位之前，不得使其无人看管。
  2. 接受手术的动物在完全恢复之前，不得放回其他动物群中。
  3. 术后镇痛应选择以下类别药物之一：麻醉性阿片类药物、阿片受体激动剂/拮抗剂、α2-激动剂、局部麻醉药以及非甾体抗炎药（NSAID）。55-60 请注意，由于手术较为严重，建议进行为期3天的镇痛治疗。
    1. 若使用丁丙诺啡，给药剂量如下：小鼠：0.05 - 0.1 mg/kg，腹腔注射（i.p.）或皮下注射（s.c.），每6 - 12小时一次；大鼠：0.01 - 0.05 mg/kg，腹腔注射或皮下注射，每8 - 12小时一次。
    2. 若使用布托啡诺，给药剂量如下：小鼠：1.0 - 5.0 mg/kg，皮下注射，每4小时一次；大鼠：2.0 - 2.5 mg/kg，皮下注射，每4小时一次。
    3. 若使用曲马多，给药剂量如下：小鼠、大鼠：10 - 30 mg/kg，腹腔注射。
    4. 若使用氟尼辛，给药剂量如下：小鼠：2.5 mg/kg，皮下注射，每12小时一次；大鼠：1.1 mg/kg，皮下注射，每12小时一次。
    5. 若使用酮洛芬，给药剂量如下：小鼠：5 mg/kg，皮下注射，每12 - 24小时一次；大鼠：5 mg/kg，皮下注射，每12 - 24小时一次。
    6. 若使用安乃近，给药剂量如下：小鼠、大鼠：100 mg/kg，腹腔注射， 每8 小时一次。
    7. 若使用美洛昔康，给药剂量如下：小鼠、大鼠：1 mg/kg，皮下注射，每24小时一次。
    8. 若使用卡洛芬，给药剂量如下：小鼠：5-10 mg/kg，皮下注射，每12 - 24小时一次；大鼠：2.5 - 5.0 mg/kg，皮下注射，每12 - 24小时一次。
    9. 若使用对乙酰氨基酚，给药剂量如下：小鼠：300 mg/kg，口服（p.o.），每4小时一次；大鼠：100 - 300 mg/kg，每4小时一次。
    10. 若使用利多卡因（作为辅助镇痛药），给药剂量如下：小鼠、大鼠：1 - 4 mg/kg，皮下注射。
  4. 若使用卡洛芬（啮齿类动物剂量为5 - 10 mg/kg，皮下注射，用0.9% NaCl稀释）进行长效术后镇痛，应在手术操作结束前10 - 15分钟进行首次注射，并在随后两天内每天重复一次。
  5. 术后应提供湿润的颗粒饲料以促进进食，并密切观察食物（约15 g/100 g/天；约5 g/24小时）和水（约15 ml/100 g/天；约5 ml/24小时）的摄入情况。
  6. 应密切监测动物是否恢复正常的姿势与行为。
    注意：通常建议系统性使用抗生素（如恩诺沙星或三甲氧苄氨嘧啶-磺胺类药物），但除非在植入部位发现脑膜炎或脑炎的炎症迹象，否则并非绝对必要。
  7. 在开始脑电图（EEG）记录以进行进一步分析之前，应给予小鼠至少额外10至14天的恢复时间。
    注意：特定实验任务可能需要更长的恢复期。
  8. 通过评估术后体重变化来随访术后恢复情况。术后第4至5天通常会出现体重最大降幅，随后在10至14天的恢复期内体重呈现轻微但稳定的回升。

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结果

本部分展示了来自皮层表面和深部脑内脑电图（EEG）记录的示例。首先需要指出的是，在进行后续记录之前，必须先在生理条件下获取基线记录。 例如， 药理学治疗。此类基线记录可为脑节律与不同行为状态或睡眠/昼夜节律之间的功能相互依赖性提供有价值的信息。本文展示了在急性给予促惊厥/精神兴奋类药物后记录到的癫痫样活动示例。如上所述，脑电图遥测技术的一个常见应用领域是癫痫研究。癫痫模型包括急性与慢性药理学模型，以及遗传性（转基因）癫痫模型。本文演示了通过腹腔注射给予 R/S-巴氯芬（20 mg/kg）和荷包牡丹碱甲溴化物（bicucullinemethobromide，10 mg/kg）诱导的急性非惊厥性失神样癫痫发作模型。药理学上，巴氯芬是一种 GABA(B) 受体激动剂，可增加 K+ 在突触前和突触后均介导细胞外流，而荷包牡丹碱是一种GABA(A)受体拮抗剂，可抑制Cl⁻ influx- 进入细胞。GABA(A)受体的激活导致丘脑皮层-皮层丘脑环路中高频振荡和超同步化的启动与维持。 图5B、C

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讨论

可植入式脑电图遥测技术具有核心意义，因为它是一种非束缚性技术，可使实验动物完成其全部行为活动1,3。该技术具有重要意义，因为遥测方法不仅能够实现自发脑电图记录，还能在认知任务和昼夜节律分析实验设置下进行记录，例如T型迷宫、放射状迷宫、水迷宫、睡眠剥夺任务，或在复杂的认知或运动活动中需要或有助于脑电图记录的任何情况。

本方案描述了在小鼠和大鼠中进行硬膜外表面及深部脑内脑电图（EEG）电极植入，并将其连接至可植入式脑电图射频发射器的操作流程。该手术过程中的关键步骤包括术前事项，例如物种与品系的选择、饲养条件、麻醉及疼痛管理。i.e., 后者在现有文献中被证实可能作为混杂因素，导致不同研究方法中出现差异性结果。例如，实验动物物种的选择，e.g., 小鼠与大鼠，甚至不同品系，均可能完全改变实验结果。性别因素亦是如此。通常情况下，强烈建议按性别进行分组和分析；若无法实现，则至少应保证性别的均衡分布。若实验条件未能严格统一或控制，则所获得的数据将无法比较，或直接无效。

本文所述的立...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

作者谨此感谢德国神经退行性疾病中心（DZNE）的Christina Ginkel博士、DZNE的Michaela Möhring博士以及DZNE的Robert Stark博士在动物繁育与动物健康护理方面提供的协助。本工作得到了德国波恩联邦药品与医疗器械研究所（Bundesinstitut für Arzneimittel und Medizinprodukte, BfArM）的经费支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
卡洛芬（Rimadyl VET - 注射液ö溶液）PfizerPZN 011020820 ml
双目手术放大显微镜 Zeiss Stemi 20000000001003877, 4355400000000, 0000001063306, 4170530000000, 4170959255000, 4551820000000, 4170959040000, 4170959050000
Bulldog 止血夹 F.S.T.18051-2828 mm
笼具（Macrolon）Techniplast1264C, 1290D
冷光源Schott KL2500 LCD9.705 202在 Th.Geyer 订购
棉签（无菌）Carl Roth EH12.1
右泛醇（Bepanthen 伤口愈合软膏）BayerPZN: 1578818
手术巾（无菌）HartmannPZN 0366787
70% 乙醇Carl Roth 9065.5
0.3%/3% 过氧化氢溶液Sigma9532130% 储存液 
手套（无菌）Unigloves1570
牙科玻璃离子水门汀KentDental /NORDENTA957 321
2% 戊二醛溶液SigmaG6257
Graefe 镊子—带齿弯头F.S.T.11052-10
Halsey 微型持针器—碳化钨F.S.T.12500-1212.5 cm
热力手术器械灭菌器F.S.T.18000-50
加热垫AEG HK5510520010在 myToolStore 订购
高速牙科钻机AdeorSI-1708
虹膜剪刀（超薄） F.S.T.14058-099 cm
吸入麻醉系统（异氟烷）Harvard Apparatus GmbH34-1352, 10-1340, 34-0422, 34-1041, 34-0401, 34-1067, 72-3044, 34-0426, 34-0387, 34-0415, 69-0230
异氟烷Baxter 250 mlPZN 6497131
氯胺酮PfizerPZN 07506004
乳酸林格氏溶液（无菌）’BraunL7502
Lexar-Baby 剪刀—直头，10 cmF.S.T.14078-1010 cm
尼氏染色液Armin BaackBAA31712159
不可吸收缝合线 5-0/6-0（无菌）SABANA (Sabafil)N-63123-45
Covidien (Sofsilk)S1172, S1173
Halsey 持针器F.S.T.12001-1313 cm
敷料垫（无菌）ReWa Krankenhausbedarf2003/01
0.9% 生理盐水（NaCl，无菌）BraunPZN:8609255
带手柄的手术刀片（无菌）propraxis2029/10
标准齿状镊F.S.T.11000-12, 11000-1412 cm 和 14.5 cm 长度
聚对二甲苯涂层钢和钨电极 FHC Inc., USA)UEWLGESEANND
立体定位仪Neurostar51730M在 Stoelting 订购
（Stereo Drive—新型电动立体定位仪）
胶带（无菌）BSN medical GmbH & Co. KG626225
TA10ETA-F20 DSI270-0042-001X射频发射器 3.9 g, 
3.9 g, 1.9 ml, 输入电压范围 ± 2.5 mV,
通道带宽 (B) 1 - 200 Hz, 
标称采样率 (f) 1,000 Hz (f = 5B)
温度工作范围 34 - 41 °C
保证电池寿命 4 个月
TL11M2-F20EET DSI270-0124-001X射频发射器 
3.9 g, 1.9 ml, 输入电压范围 ± 1.25 mV,
通道带宽 (B) 1 - 50 Hz, 
标称采样率 (f) 250 Hz (f = 5B)
温度工作范围 34 - 41 °C
保证电池寿命 1.5 个月
组织镊—1×2 齿，12 cmF.S.T.11021-1212 cm 长度
碳化钨虹膜剪刀F.S.T.14558-1111.5 cm
振动切片机 5000 MZElectron Microscopy Sciences5000-005
赛拉嗪（Rompun）BayerPZN: 1320422

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