大鼠脑单侧半球重复经颅磁刺激

摘要

我们通过将一个25毫米的8字形线圈放置在双耳连线距头顶1厘米处，并将线圈倾斜45°，对大鼠脑的单侧半球施加重复经颅磁刺激（rTMS）。对于持续超过20分钟的rTMS，使用了自制的水冷系统。

摘要

以往的啮齿类动物重复经颅磁刺激（rTMS）模型采用的是全脑刺激，而非单侧半球rTMS，这与人类受试者所使用的刺激方案不同。我们报道了一种成功应用于大鼠单侧脑半球的rTMS方法。通过使用一个小型25 mm的8字形线圈，对大脑一侧实施低频（1 Hz）、高频（20 Hz）或假刺激。我们将线圈中心置于耳间线（biauricular line）上冠状缝外侧1 cm处，并将线圈与地面成45°角放置，以尽量减少rTMS对对侧皮层的直接作用。此外，我们还使用了自制的水冷系统，即使在20 Hz的刺激频率下，也能实现持续超过20分钟的重复磁刺激。rTMS后即早基因（Arc、Junb 和 Egr2）的转录水平升高程度显著高于假刺激组。连续5天、每天20分钟的1 Hz rTMS刺激后，刺激侧皮层的bdnf mRNA表达水平显著高于对侧皮层。本研究所建立的模型将有助于通过分析rTMS在双侧半球间效应的差异，阐明其分子作用机制。

引言

重复经颅磁刺激（rTMS）是一种用于无创脑刺激和神经调节的工具，已被应用于治疗多种疾病，如中枢性疼痛^1,2、抑郁症³、偏头痛⁴，甚至脑卒中^5-7。通过头部线圈的快速变化电流可在大脑皮层诱导产生电场，进而引起神经元激活。rTMS能够调节大脑皮层的兴奋性，这种效应在刺激结束后可持续超过30分钟。

rTMS后效应的可能机制包括类似长时程增强/长时程抑制效应⁸、离子平衡的短暂改变⁹以及代谢变化¹⁰。此外，Di Lazzaro et al. 提出，间歇性θ脉冲刺激会影响锥体束神经元的兴奋性突触输入，这种影响不仅存在于受刺激的大脑半球，也存在于对侧半球¹¹。

然而，显著的局限性阻碍了研究人员将实验台上的证据转化为临床应用。首先，在以往的动物研究中，重复经颅磁刺激（rTMS）被用于全脑刺激¹²。全脑刺激与人类研究中采用的刺激方案存在显著差异⁹。另一个问题与刺激持续时间有关。这至少部分归因于过去缺乏适用于小型线圈的有效冷却系统。

近年来，已有重要的研究文章发表，提出了克服小动物脑部rTMS实验中这些困难的方法。通过这些动物模型发现，大鼠大脑在低频rTMS刺激下也会产生与人类相似的皮层兴奋性变化¹³。更为重要的是，研究人员正越来越多地利用rTMS动物模型来探究rTMS的细胞与分子机制。例如，已知某一特定类型的抑制性中间神经元对间歇性theta脉冲刺激（intermittent theta burst stimulation）最为敏感¹⁴。因此，啮齿类动物的rTMS模型为探索rTMS诱导变化背后的分子机制这一备受关注的问题提供了新的研究机遇。若rTMS的小动物模型能在更多实验室中得到应用，将有望极大地加速并加强该领域的研究进展。

我们目前描述如何对大鼠脑的单侧半球应用重复经颅磁刺激（rTMS），这是此前研究¹⁵的延伸。通过微正电子发射断层扫描（PET）和mRNA微阵列技术评估刺激引起的变化，以研究rTMS对受刺激大脑皮层所诱导的改变。

方案

所有使用动物的实验程序均经首尔国立大学医院机构动物护理和使用委员会审查并批准。

1. 实验设置

1. 动物准备
   1. 让雄性Sprague-Dawley大鼠在开始实验前有1周时间适应新环境。
      注意：尽管本研究使用了8周龄大鼠，但可根据研究假设选择发育期或成年期的大脑。
2. 吸入麻醉诱导
   1. 使用溶于40%/60%和25%/75%氧气/氮气混合气体中的5%和2%异氟烷诱导并维持麻醉 通过 一个麻醉室和一个鼻罩。调整麻醉深度至足趾捏压时无足底回缩反射的水平，以确认麻醉效果适当。
      注意：使用清醒动物在转化研究中可能是更优选择，但重复经颅磁刺激（rTMS）过程中难以固定，且动物容易产生过度应激反应。
   2. 使用直肠探头监测体温，并通过恒温毯将体温维持在 37 °C。通过足底回缩反射、体温、呼吸频率和心率监测麻醉深度。
3. 转换为静脉麻醉以维持麻醉状态
   1. 用酒精棉片处理尾部。使用24号静脉导管插入侧尾静脉，以便过渡至静脉麻醉（图1A）。以丙泊酚（1 mg/[kg·min]，10 mg/ml 乳剂，静脉输注，持续10 min）给动物给药。在开始丙泊酚负荷5 min后，停止异氟烷麻醉。
   2. 在整个实验过程中，以500 - 700 µg/(kg·min)的输注速率维持丙泊酚镇静，如先前研究所述¹⁶以 0.8 L/min 的流速补充氧气 通过 鼻锥
      注意：使用丙泊酚麻醉旨在减少吸入性麻醉剂对皮层兴奋性的潜在抑制作用^17-19然而，麻醉在rTMS实验中并非必需，清醒动物也可用于实验。麻醉方法的选择应根据研究假设综合考虑。
   3. 使用兽用眼膏以防止麻醉期间眼睛干涩。
   4. 在完全过渡后10分钟施加磁刺激（参见第2节） i.v. 麻醉
4. 恢复条件
   1. 在恢复期间监测生命体征。在动物恢复足够意识以维持胸卧位之前，不得使其无人看管。若动物接受了手术，须待其完全恢复后方可放回其他动物群中。
      注意：如果进行疾病模型的手术操作，则必须进行术后镇痛管理。但本rTMS实验无需镇痛管理。

2. 重复经颅磁刺激

1. 刺激器和线圈
   1. 使用可提供双相刺激的重复刺激器进行刺激 通过 25 mm 的双圆形线圈。将线圈中心置于耳间连线距顶点外侧 0.5 cm 处，并使线圈与地面成 45° 角。
      注意：线圈的最大磁场强度为 4.0 T。磁线圈牢固安装在内置支架上。
2. 运动阈值
   1. 在耳间线上顶点外侧0.5 cm处，将线圈中心置于颅骨表面平坦的位置，确定该热点处的运动阈值（MT）。此方法与先前研究中使用的方法相同。²⁰.
      注意：将运动阈值（MT）定义为在10次连续刺激中，于对侧前爪引出5次或以上可触及肌肉收缩的最小刺激强度。需验证刺激主要引起对侧肌肉收缩，以确保为单侧刺激。
3. 重复经颅磁刺激（rTMS）的应用
   1. 在深麻醉稳定后10分钟施加rTMS。根据研究问题从大脑皮层中选择目标rTMS位点，并将线圈中心置于该位点。随后倾斜线圈，确保线圈中心与刺激点处颅骨表面直接接触。
      注意：例如，将线圈与地面成 45° 角放置，以尽量减少重复经颅磁刺激（rTMS）对对侧皮层的潜在直接作用图1B 和 1C).
   2. 对动物进行单侧半球20分钟的重复经颅磁刺激（rTMS）处理。通过软件控制台，采用低频（1 Hz）、高频（20 Hz）或假刺激方案进行rTMS，并将刺激强度设定为运动阈值（MT）的100–110%。
   3. 以1 Hz频率持续刺激，不进行休息。通过软件控制台输入 "1,200" shots for "20" 分钟）。对于20 Hz刺激，进行2秒刺激，随后休息28秒。通过软件控制台输入 "1,600" 注射 "20" 最小
   4. 假刺激时，将线圈倾斜至与颅骨垂直（旋转90°），并将线圈边缘置于距头表面2 cm处图1D）将线圈支架牢固地固定在主装置上；实验过程中无需用手持握线圈。
      注意：为了补偿声学及其他非特异性效应，不同的刺激方案应使用不同的假刺激对照方案。例如，1-Hz 假刺激可用于 1-Hz rTMS 实验。
4. 冷却线圈
   1. 使用水冷系统，以实现1 Hz和20 Hz刺激频率下持续超过20分钟的重复性磁刺激图2）。实验期间，用冰水循环冷却线圈的整个长度，以防止过热，尽管不监测线圈或刺激器的温度。
      注意：也可使用市售的冷却大鼠线圈。
   2. 如果可能，通过观察重复经颅磁刺激（rTMS）设备的加热指示器来监测线圈温度。  注意：rTMS 刺激未引起任何不良后果。然而，若在刺激线圈附近使用金属耳标识别标签，则存在潜在的灼伤风险。

3. 微型正电子发射断层扫描

1. 动物准备
   1. 采用吸入麻醉进行诱导，静脉麻醉维持（参见步骤 1.2.1 和 1.3.1）。以运动阈值（MT）的 100–110% 刺激强度对动物施加 1 Hz 的重复经颅磁刺激（rTMS），持续 10 分钟。
   2. 完成 rTMS 刺激后 5 分钟，通过尾静脉导管将 1 mCi 溶于 0.5 ml 生理盐水中的 2-[F-18]氟代脱氧葡萄糖（¹⁸FDG）静脉注射。给予 30 分钟的 ¹⁸FDG 摄取时间。注意：在整个微型 PET 实验期间，保持大鼠处于麻醉状态。
2. 图像分析
   1. 使用 PET 扫描仪进行脑部成像，以确认刺激的单侧性。采用三维迭代算法重建图像。为评估 rTMS 诱导的代谢变化，需在脑横断面图像上确定感兴趣区域（ROIs）²¹。
3. 安乐死
   1. 完成微型 PET 成像后，在充满二氧化碳的密闭容器中对处于深度麻醉状态的大鼠实施安乐死。

4. mRNA 微阵列

1. 安乐死
   1. 使用溶于40%/60%和25%/75%氧气/氮气混合气体中的5%和2%异氟烷诱导并维持麻醉 通过 一个腔室和鼻锥。在断头前，需将动物深度麻醉至足底退缩反射消失（通过夹捏脚趾确认）。
   2. 在1-Hz rTMS一次治疗结束后5分钟，处死大鼠。
2. 组织采集
   1. 按使用顺序摆放材料和手术器械，包括折叠的纸巾、骨剪、显微剪、较大的手术剪、显微镊、10号或11号手术刀片、一个装有冰的带盖10 cm玻璃培养皿，以及1.5 ml离心管。准备一个塑料袋用于处理动物尸体。
   2. 在颅骨上沿前后方向做正中线皮肤切口。使用手术剪钝性分离软组织及周围肌肉，并用咬骨钳去除颅骨骨片。迅速小心地将新鲜脑组织从颅骨中剥离，然后用显微镊子和显微剪将其置于冰上。用冰冷的生理盐水冲洗脑组织。
   3. 将脑组织立即转移至干冰上，随后置于-80 °C的离心管中保存，直至进一步处理。
   4. 在收获前将脑组织解冻。
   5. 将脑组织背侧朝上，置于冰上，使用显微镊子和显微剪刀采集刺激区域的脑组织（初级运动皮层中的热点周围）。将采集的组织放入1.5 ml离心管中。
3. RNA 提取
   1. 使用裂解试剂从组织匀浆中提取总RNA²²用DNase消化并进行纯化处理。定量RNA样品及其分装样品，于-80 °C保存备用。
   2. 为质量控制，通过变性凝胶电泳评估RNA的纯度和完整性，检测260:280的OD比值，并使用市售分析仪进行分析。
4. 标记与纯化
   1. 使用市售RNA扩增试剂盒对总RNA进行扩增和纯化，以获得生物素标记的cRNA。简而言之，使用T7寡聚(dT)引物将550 ng总RNA逆转录为cDNA，随后进行合成和纯化。 体外 转录第二条链cDNA，然后用生物素-NTP进行标记。
   2. 纯化后，使用分光光度计对cDNA进行定量。
5. 杂交与数据导出²³
   1. 使用表达谱微珠芯片进行mRNA表达分析。将标记的750 ng cDNA样本与每张大鼠-12表达微珠芯片在58 °C下杂交16–18小时。采用链霉亲和素-Cy3检测芯片信号。
   2. 使用共聚焦扫描仪扫描芯片阵列。利用商业软件进行芯片数据导出、处理与分析。

结果

为进行独立研究者间可靠性分析，共使用15只8周龄雄性Sprague-Dawley大鼠测定运动阈值（MT）。通过触诊肌肉抽动，两位独立研究人员均成功测得所有大鼠的MT值，分别为33.00 ± 4.21%最大刺激器输出（% MSO）和33.93 ± 0.88% MSO。Bland-Altman分析的偏倚为-0.93，95%一致性界限为-9.13至7.26%。

在对六只8周龄大鼠进行的微正电子发射断层扫描（micro-PET）实验中（1-Hz rTMS组n=4，假刺激rTMS组n=2），通过校准同一图像中同侧和对侧大脑皮层的放射性信号，计算各感兴趣区（ROI）的¹⁸F-FDG摄取值，以平均nCi/cc表示。以对侧区域的放射性作为参考，对同侧区域的数据进行标准化处理，并计算差异摄取率（DUR）。取连续三张横断面图像所得的平均DUR值，作为每只大鼠的DUR值。该方法与先前一项研究²¹所采用的方法一致。¹⁸

讨论

本研究的主要目的是建立一种单侧重复经颅磁刺激（rTMS）的动物模型。尽管单侧刺激是人类rTMS研究中最基本的特征之一，但许多针对小型动物的研究尚未采用该方法。然而，Rotenberg 等.¹⁵ 报道，使用外侧线圈直径为20 mm的8字形线圈、以100%运动阈值（MT）进行刺激时，仅记录到对侧的运动诱发电位（MEP）；而当刺激强度增至112.5%和133.3% MT时，则同时记录到同侧和对侧的MEP。这可能是因为较大的感应电场影响了对侧半球。因此，本研究通过将线圈位置更偏向外侧并倾斜放置，以增强单侧刺激效果，是对先前研究^15,24的进一步拓展。本研究已实现其主要目标，因为我们证实了微正电子发射断层扫描（micro-PET）显示，在rTMS刺激后，受刺激的大脑皮层局部葡萄糖代谢有所增加（图3）。

线圈的位置和角度是本实验中的关键步骤。通过将重复经颅磁刺激（rTMS）线圈的中心置于双耳间连线（biauricular line）上、颅顶外侧1 cm处，并将线圈与地面成45°角放置，可实现单侧刺激...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
带直肠探头的恒温毯	Harvard apparatus	507222F
异氟烷（Forane 溶液）	Choongwae
丙泊酚（Provive 注射液 1% 20 ml）	Claris Lifesciences
重复性磁刺激器（Magstim Rapid2）	Magstim Company Ltd
25 mm 八字形线圈	Magstim Company Ltd	1165-00
PET-CT	GE Healthcare
QIAzol 裂解试剂	Qiagen	(US Patent No. 5,346,994)
RNeasy 脂肪组织小型试剂盒	Qiagen	74804
RNeasy 小型旋转柱	Qiagen	(Mat No. 1011708)
Agilent 2100 生物分析仪	Agilent Technologies
Ambion Illumina RNA 扩增试剂盒	Ambion
Nanodrop 分光光度计	NanoDrop	ND-1000
Illumina RatRef-12 表达微珠芯片	Illumina, Inc.
Amersham fluorolink 链霉亲和素-Cy3	GE Healthcare Bio-Sciences