我们通过将一个25毫米的8字形线圈放置在双耳连线距头顶1厘米处，并将线圈倾斜45°，对大鼠脑的单侧半球施加重复经颅磁刺激（rTMS）。对于持续超过20分钟的rTMS，使用了自制的水冷系统。
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摘要
摘要
以往的啮齿类动物重复经颅磁刺激（rTMS）模型采用的是全脑刺激，而非单侧半球rTMS，这与人类受试者所使用的刺激方案不同。我们报道了一种成功应用于大鼠单侧脑半球的rTMS方法。通过使用一个小型25 mm的8字形线圈，对大脑一侧实施低频（1 Hz）、高频（20 Hz）或假刺激。我们将线圈中心置于耳间线（biauricular line）上冠状缝外侧1 cm处，并将线圈与地面成45°角放置，以尽量减少rTMS对对侧皮层的直接作用。此外，我们还使用了自制的水冷系统，即使在20 Hz的刺激频率下，也能实现持续超过20分钟的重复磁刺激。rTMS后即早基因（Arc、Junb 和 Egr2）的转录水平升高程度显著高于假刺激组。连续5天、每天20分钟的1 Hz rTMS刺激后，刺激侧皮层的bdnf mRNA表达水平显著高于对侧皮层。本研究所建立的模型将有助于通过分析rTMS在双侧半球间效应的差异，阐明其分子作用机制。
引言
重复经颅磁刺激（rTMS）是一种用于无创脑刺激和神经调节的工具，已被应用于治疗多种疾病，如中枢性疼痛1,2、抑郁症3、偏头痛4，甚至脑卒中5-7。通过头部线圈的快速变化电流可在大脑皮层诱导产生电场，进而引起神经元激活。rTMS能够调节大脑皮层的兴奋性，这种效应在刺激结束后可持续超过30分钟。
rTMS后效应的可能机制包括类似长时程增强/长时程抑制效应8、离子平衡的短暂改变9以及代谢变化10。此外，Di Lazzaro et al. 提出，间歇性θ脉冲刺激会影响锥体束神经元的兴奋性突触输入，这种影响不仅存在于受刺激的大脑半球，也存在于对侧半球11。
然而，显著的局限性阻碍了研究人员将实验台上的证据转化为临床应用。首先，在以往的动物研究中，重复经颅磁刺激（rTMS）被用于全脑刺激12。全脑刺激与人类研究中采用的刺激方案存在显著差异9。另一个问题与刺激持续时间有关。这至少部分归因于过去缺乏适用于小型线圈的有效冷却系统。
近年来，已有重要的研究文章发表，提出了克服小动物脑部rTMS实验中这些困难的方法。通过这些动物模型发现，大鼠大脑在低频r....
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方案
所有使用动物的实验程序均经首尔国立大学医院机构动物护理和使用委员会审查并批准。
1. 实验设置
- 动物准备
- 让雄性Sprague-Dawley大鼠在开始实验前有1周时间适应新环境。
注意：尽管本研究使用了8周龄大鼠，但可根据研究假设选择发育期或成年期的大脑。
- 让雄性Sprague-Dawley大鼠在开始实验前有1周时间适应新环境。
- 吸入麻醉诱导
- 使用溶于40%/60%和25%/75%氧气/氮气混合气体中的5%和2%异氟烷诱导并维持麻醉 通过 一个麻醉室和一个鼻罩。调整麻醉深度至足趾捏压时无足底回缩反射的水平，以确认麻醉效果适当。
注意：使用清醒动物在转化研究中可能是更优选择，但重复经颅磁刺激（rTMS）过程中难以固定，且动物容易产生过度应激反应。 - 使用直肠探头监测体温，并通过恒温毯将体温维持在 37 °C。通过足底回缩反射、体温、呼吸频率和心率监测麻醉深度。
- 使用溶于40%/60%和25%/75%氧气/氮气混合气体中的5%和2%异氟烷诱导并维持麻醉 通过 一个麻醉室和一个鼻罩。调整麻醉深度至足趾捏压时无足底回缩反射的水平，以确认麻醉效果适当。
- 转换为静脉麻醉以维持麻醉状态
- 用酒精棉片处理尾部。使用24号静脉导管插入侧尾静脉，以便过渡至静脉麻醉（图1A）。以丙泊酚（1 mg/[kg·min]，10 mg/ml 乳剂，静脉输注，持续10 min）给动物给药。在开始丙泊酚负荷5 min后，停止异氟烷麻醉。
- 在整个实验过程中，以500 - 700 µg/(kg·min)....
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结果
为进行独立评估者间信度分析，共使用了15只8周龄雄性Sprague-Dawley大鼠以确定运动阈值（MT）。通过触诊肌肉抽动，两位独立研究人员均成功测得所有大鼠的运动阈值，分别为最大刺激器输出（% MSO）的33.00 ± 4.21%和33.93 ± 0.88% MSO。Bland-Altman分析的偏倚为-0.93，95%一致性界限为-9.13至7.26%。
在对六只8周龄大鼠进行的微正电子发射断层扫描（micro-PET）实验中（1-Hz rTMS组n=4，假刺激rTMS组n=2），通过在同一图像中对同侧和对侧大脑皮层进行校准后，计算各感兴趣区域（ROIs）的18F-FDG摄取值，以平均nCi/cc表示。以对侧区域的放射性作为参考，对同侧区域的数据进行标准化处理，并计算差异摄取率（DUR）。取连续三张横断面图像所得的平均DUR值，作为每只大鼠的DUR值。该方法与先前一项研究21所采用的方法相同。.......
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讨论
本研究的主要目的是建立一种单侧重复经颅磁刺激（rTMS）的动物模型。尽管单侧刺激是人类rTMS研究中最基本的特征之一，但许多针对小型动物的研究尚未采用该方法。然而，Rotenberg 等.15 报道，使用外侧线圈直径为20 mm的8字形线圈、以100%运动阈值（MT）进行刺激时，仅记录到对侧的运动诱发电位（MEP）；而当刺激强度增至112.5%和133.3% MT时，则同时记录到同侧和对侧的MEP。这可能是因为较大的感应电场影响了对侧半球。因此，本研究通过将线圈位置更偏向外侧并倾斜放置，以增强单侧刺激效果，是对先前研究15,24的进一步拓展。本研究已实现其主要目标，因为我们证实了微正电子发射断层扫描（micro-PET）显示，在rTMS刺激后，受刺激的大脑皮层局部葡萄糖代谢有所增加（图3）。
线圈的位置和角度是本实验中的关键步骤。通过将重复经颅磁刺激（rTMS）线圈的中心置于双耳间连线（biauricular line）上、颅顶外侧1 cm处，并将线圈与地面成45°角放置，可实现单侧刺激.......
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披露
作者声明无利益冲突。
致谢
本工作由韩国政府资助的韩国研究基金会拨款（KRF-2008-313-E00458）支持。作者感谢李珍柱提供的技术支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 带直肠探头的恒温毯 | Harvard apparatus | 507222F | |
| 异氟烷（Forane 溶液） | Choongwae | ||
| 丙泊酚（Provive 注射液 1% 20 ml） | Claris Lifesciences | ||
| 重复性磁刺激器（Magstim Rapid2） | Magstim Company Ltd | ||
| 25 mm 八字形线圈 | Magstim Company Ltd | 1165-00 | |
| PET-CT | GE Healthcare | ||
| QIAzol 裂解试剂 | Qiagen | (US Patent No. 5,346,994) | |
| RNeasy 脂肪组织小型试剂盒 | Qiagen | 74804 | |
| RNeasy 小型旋转柱 | Qiagen | (Mat No. 1011708) | |
| Agilent 2100 生物分析仪 | Agilent Technologies | ||
| Ambion Illumina RNA 扩增试剂盒 | Ambion | ||
| Nanodrop 分光光度计 | NanoDrop | ND-1000 | |
| Illumina RatRef-12 表达微珠芯片 | Illumina, Inc. | ||
| Amersham fluorolink 链霉亲和素-Cy3 | GE Healthcare Bio-Sciences |
参考文献
- Lefaucheur, J. P., et al. Neurogenic pain relief by repetitive transcranial magnetic cortical stimulation depends on the origin and the site of pain. J Neurol Neurosurg Psychiatry. 75 (4), 612-616 (2004).
- Hirayama, A., et al.
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重印与许可
