活体斑马鱼胚胎中观察有丝分裂及其动态过程

摘要

有丝分裂对每一种生物都至关重要，其缺陷常导致癌症和发育障碍。利用本成像方案并以斑马鱼作为模型系统，研究人员可以在活体脊椎动物中观察有丝分裂过程，以及当有丝分裂过程出现异常时所产生的多种缺陷。

摘要

有丝分裂对生物体的生长和分化至关重要。该过程高度动态，需在较短时间内有序完成染色质凝缩、微管-动粒连接、染色体分离以及胞质分裂等一系列事件。这一精细过程中的任何错误均可能导致人类疾病，包括出生缺陷和癌症。传统研究人类有丝分裂相关疾病的方法通常依赖细胞培养系统，而此类系统缺乏研究人类疾病时所需的真实生理环境及发育或组织特异性背景。本实验方案通过提供一种在脊椎动物系统——斑马鱼（zebrafish）中高分辨率可视化染色体动态行为的方法，克服了诸多技术障碍。本方案将详细阐述一种可用于获取分裂细胞动态图像的技术流程，包括： 体外 转录、斑马鱼繁殖与收集、胚胎包埋以及延时成像。本方案的优化与改进方法也进行了探讨。利用注射了H2A.F/Z-EGFP（标记染色质）和mCherry-CAAX（标记细胞膜）mRNA的胚胎，对AB野生型中的有丝分裂进行观察， auroraB^hi1045, 和 ESCO2^hi2865 突变型斑马鱼被可视化。在斑马鱼中进行高分辨率活体成像，可观察到多次有丝分裂，从而在统计学上量化有丝分裂缺陷及有丝分裂进程的时间。此外，还可观察定义异常有丝分裂过程的定性特征（即， 染色体排列缺陷，染色体错误分离 等等。）以及染色体异常结果（即， 非整倍性，多倍性，微核， 等等。可观察到上述现象。该检测方法可用于观察组织分化/发育过程，并适用于突变型斑马鱼及药理学试剂的研究。通过可视化有丝分裂缺陷如何导致癌症和发育障碍，将极大增进对疾病发病机制的理解。

引言

有丝分裂是生物体生长、分化和再生过程中至关重要的细胞过程。在间期完成DNA的精确准备和复制后，细胞即进入分裂状态。有丝分裂的第一阶段为前期，由细胞周期蛋白B/Cdk1的激活启动。前期的特征是染色质材料凝缩形成染色体。核膜破裂发生在前期与前中期之间的过渡阶段。在前中期，作为纺锤体形成成核中心的中心体开始向细胞两极迁移，同时延伸微管以寻找动粒附着位点。一旦附着成功，微管转变为末端附着模式，并通过张力作用使染色体排列在赤道板上¹。当所有染色体均正确附着后，纺锤体组装检查点被满足，连接姐妹染色单体的黏连蛋白环被切割，微管缩短，将姐妹染色单体在后期拉向细胞两极^2,3。最后一个阶段为末期，细胞伸长，两个新细胞核周围重新形成核膜。胞质分裂则通过分割两个子细胞的细胞质，完成整个分裂过程^4-6。关键有丝分裂通路（例如，纺锤体组装检查点、中心体复制、姐妹染色单体黏连等）的异常可导致中期停滞、染色体错误分离以及基因组不稳定^7-10。最终，调控有丝分裂的通路缺陷可能引发发育障碍和癌症，因此有必要在活体、脊椎动物、多细胞生物中可视化观察有丝分裂及其缺陷^10-16。

斑马鱼胚胎因其组织透明、易于显微注射以及发育迅速，是活体成像研究的理想模式生物。本论文的总体目标是利用斑马鱼描述一种活体5D（空间维度X、Y、Z，时间及波长）有丝分裂成像方法¹⁷

方案

1. 体外 转录

1. 使用 NotI 限制性内切酶消化 pCS2-H2A.F/Z-EGFP 和/或 pCS2-mCherry-CAAX 载体以进行线性化³¹。根据制造商说明书，利用 RNA 体外转录试剂盒，从每个模板生成 5' 加帽的 mRNA 产物。
2. 使用纯化试剂盒对加帽的 mRNA 进行纯化，遵循制造商的操作说明。用无 RNase 的 H₂O 洗脱。
3. 使用分光光度计在 260 nm 处测定 RNA 的浓度（OD₂₆₀ × 稀释倍数 × 40 µg/ml）。
4. 用无 RNase 的 H₂O 将 H2A.F/Z-EGFP 和 mCherry-CAAX 的 RNA 分别稀释至 100 ng/µl。若 RNA 浓度过低，则荧光信号会减弱或无法检测；较强的荧光信号可降低对光毒性和光漂白的担忧。然而，过量的 RNA 可能具有细胞毒性，和/或导致脱靶效应。
   注意：将剩余的纯化 mRNA 储存在 -80 °C 冰箱中。

2. 斑马鱼繁殖、胚胎收集和 mRNA 显微注射 ^36-38

1. 组装繁殖用鱼缸，使用隔板将鱼缸分隔为两个区域，并用斑马鱼养殖设施中使用的循环水系统水注满每个繁殖鱼缸。
2. 为防止过早繁殖....

结果

图2展示了利用宽视野观察AB野生型斑马鱼尾部多个细胞分裂的能力。在14分钟的时间范围内成像了超过7个有丝分裂细胞（视频1）。在连续两小时的时间序列中，共捕获了超过40次有丝分裂事件。平均而言，在AB胚胎中观察到50个分裂细胞，而在aurB^m/m胚胎中观察到30个分裂细胞（图2B）。为校正成像细胞数量的影响，计算了有丝分裂细胞数与成像细胞总数的比值（图2C）。这些数据表明，aurB^m/m胚胎中并非经历有丝分裂的细胞数量更少（图2B），而是成像的细胞总数较少。能够获取此类具有统计学意义的事件数量，将有助于提高统计效能。

图3 扩展了该技术，以.......

讨论

使用该方法可推断核膜破裂、微管-动粒连接形成的中期板，以及姐妹染色单体的分离，从而在体内以时间依赖性方式形成两个新细胞。in vivo 观察斑马鱼的有丝分裂相较于固定样本和细胞培养系统具有优势，因为细胞处于自然生理环境中，组织透明便于使用荧光蛋白，且其发育相对较快，可进行活体延时成像。由于成年斑马鱼组织较厚（非皮肤或眼睛部位），成像的Z轴深度受限，因此本方案不适用于成年斑马鱼。尽管可使用表达 H2A.F/Z-EGFP 和 mCherry-CAAX 的转基因动物实现相同目的，但将 mRNA 注射到不同突变型斑马鱼中的方法更具灵活性和操作简便性，优于遗传杂交。当需要对受精后三天（dpf）或更晚时期的胚胎进行有丝分裂分析时，由于该快速发育生物体内 RNA 的半衰期较短，必须使用转基因动物。

其他用于观察有丝分裂的荧光蛋白也适用于本方案。例如，H2B-GFP mRNA 可作为染色质标记物，替代 H2A.F/Z-EGFP，并提供相似的标记效果。该技术还可使用其他荧光标记蛋白，包括 POM121、centrin、Eb1、Hec1 和 EMTB，分别可用于胚胎内活体成像核膜、中.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
pCS2 载体	由 K. Kwan 惠赠		用于目的质粒
NotI-HF 限制性内切酶	New England BioLabs	R3189S	用于质粒的限制性酶切
mMessage SP6 试剂盒	Life Technologies	AM1340	用于体外转录
RNeasy Mini 试剂盒	Qiagen	74104	用于纯化 mRNA
100 × 15 mm 培养皿	Fisher Scientific	FB0875712	用于饲养胚胎
显微注射模具	自制		用于在显微注射过程中固定胚胎
琼脂糖 II	Amresco	0815-25G	用于包埋胚胎
三卡因（Tricaine）	Sigma-Aldrich	E10521-10G	用于麻醉胚胎
氯化钠	Sigma-Aldrich	S9888	用于胚胎培养液（E3 蓝液），溶于超纯 H2O
氯化钾	Sigma-Aldrich	P3911	用于胚胎培养液（E3 蓝液），溶于超纯 H2O
二水合氯化钙	Sigma-Aldrich	C8106	用于胚胎培养液（E3 蓝液），溶于超纯 H2O
硫酸镁	Fisher Scientific	M7506	用于胚胎培养液（E3 蓝液），溶于超纯 H2O
亚甲蓝水合物	Sigma-Aldrich	MB1	用于胚胎培养液（E3 蓝液），溶于超纯 H2O
100 mm 培养管	Fisher Scientific	50-819-812	用于盛装熔化的琼脂
35 mm 玻璃底培养皿（盖玻片底）	MatTek Corp	P35G-0-20-C	0 号，20 mm 玻璃，用于包埋胚胎
#5 镊子	Dumont	72701-D	用于去除胚胎的绒毛膜
21 G 1 1/2 规针头	Becton Dickinson	305167	用于在琼脂中定位胚胎
体视显微镜	Nikon AZ100		用于胚胎筛选和包埋，任何体视显微镜均可
共聚焦显微镜	Nikon A1+		用于延时成像
共聚焦显微镜软件	NIS Elements AR 4.13.00		用于图像采集与处理