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VacuSIP：一种改进的InEx方法 原位 活性悬浮物滤食者处理的颗粒态与溶解态化合物的测定

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DOI：

10.3791/54221

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2016年8月3日

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1Department of Marine Ecology, Centre d’Estudis Avançats de Blanes (CEAB-CSIC), 2Department of Marine Biology and Oceanography, Institut de Ciències del Mar (ICM-CSIC), 3The School of Marine Science, Ruppin Academic Center

本文内容

摘要

我们介绍一种名为VacuSIP的简单、非侵入性且可靠的水体定点取样方法，可实现洁净而精确的水样采集。该系统已开发并用于同步采集底栖悬浮物滤食生物吸入和呼出的水样 原位， 准确测量颗粒物和溶解性化合物的去除与排泄。

摘要

底栖滤食生物在海洋生态系统功能中发挥着关键作用。它们通过过滤大量海水，去除浮游生物和碎屑，并排泄颗粒态和溶解态化合物，在底栖-水层耦合过程中扮演着重要角色。准确测量滤食生物（如海绵、海鞘、多毛类、双壳类）摄取和排泄的化合物，对其生理学、代谢及摄食生态学研究至关重要，也是评估这些生物介导的营养物质通量生态意义的基础。然而，目前可用的方法学存在局限性，限制了对自然环境中滤食生物处理颗粒态和溶解态化合物速率的准确评估。本研究旨在开发一种简单、可靠且非侵入性的方法，以实现从特定位置（如底栖滤食生物的出水孔）进行洁净且受控的水样采集。 原位我们的方法通过使用安装在定制操作装置上的微细导管，并将其精确置于被测生物的排泄孔内，从而实现对研究对象吸入和呼出水分的同步采集。将连接在每根导管远端的注射器针头刺入收集容器的隔膜，可使外界压力缓慢地将样品水经由采样导管压入容器中。这种缓慢且可控的采样速率能够在整合水体固有的空间异质性的同时，确保无污染采样。我们针对不同颗粒态和溶解态物质的分析，提供了最适宜的过滤装置、收集容器及储存程序的建议。VacuSIP 系统为在自然条件下定量测定未受干扰的悬浮摄食者代谢提供了一种可靠、经济且易于学习和应用的方法，可用于评估滤食性生物在不同生态系统中的生理特征与功能作用。

引言

底栖滤食性生物在海洋生态系统功能中发挥着至关重要的作用1。通过过滤大量海水2,3，它们可去除并排泄颗粒物（浮游生物和碎屑）以及溶解性化合物1（及其中引用的文献），是实现底栖-水层耦合4,5和养分循环6,7的重要媒介。准确测量底栖滤食性生物（如海绵、被囊动物、多毛类和双壳类）所去除和排泄的颗粒物及溶解性化合物，是理解其生理学、代谢过程和摄食生态学的基础。结合泵水速率的测定，还可量化这些生物介导的养分通量，进而评估其对水质以及生态系统尺度过程的生态影响。

选择合适的方法来测定悬浮颗粒物和溶解性化合物被 滤食性悬浮生物的去除和产生速率，对于获得有关其摄食活动的可靠数据至关重要8。正如Riisgård等人所指出的，不恰当的方法会导致结果偏差，扭曲实验条件，造成对某些物质摄取和排泄量的错误估算，并可能导致对这些生物所处理的营养物质通量的错误量化。

测量滤食性生物中颗粒态和溶解态营养物质通量的两种最常用方法，分别是孵育法（间接技术）和同时采集环境水与呼出水（直接技术）。孵育法基于测定孵育水中颗粒态和溶解态营养物质浓度的变化速率，并与适当的对照组比较，从而估算其生成或去除速率8。然而，将生物体置于孵育容器中可能因其自然水流环境的改变、氧气和/或食物浓度的下降，或孵育水中排泄物的积累，而改变其摄食和泵水行为7,9（及其引用文献）。除了封闭环境和供水条件改变的影响外，孵育法的主要偏差还来源于再过滤效应（例如见10）。尽管通过采用合适体积和形状的孵育容器11，或引入原位循环钟形罩系统in situ12，部分方法学问题已得到解决，但该技术仍常低估去除和生成速率。对于溶解性化合物（如溶解性有机氮（DON）和溶解性有机碳（DOC）或无机营养盐）代谢的定量研究，已被证实尤其容易受到孵育技术所带来偏差的影响13。

20世纪60年代末至70年代初，Henry Reiswig 9,14,15 开创了应用直接技术分别采集加勒比海大型海绵吸入和呼出的水样，以量化其颗粒物去除能力的方法 原位由于在较小的悬浮摄食生物以及更复杂的水下环境中应用Reiswig的技术存在困难，该领域的大部分研究局限于实验室进行。体外采用主要是间接孵育技术 16. 耶海尔及其同事对赖斯威格的直接方法进行了改造 原位 在小规模条件下工作的技术。他们的方法称为 InEx 16，基于对未受干扰生物体吸入（In）和呼出（Ex）水样的同步水下采样。某物质在吸入与呼出水样中的浓度差异（例如，细菌）在两个样本之间（InEx）的差异可用来衡量该动物对这种物质的滞留（或产生）情况。InEx 技术采用两端开放的管子，依赖所研究生物体泵水活动产生的出流射流，被动地替换收集管中的周围水体。Yahel 及其同事已成功将该技术应用于超过 15 种不同悬浮摄食生物类群的研究中（例如, 17），该方法受限于所需的高度实践经验和操作技巧，以及微小的尺寸 一些出水口及海况条件。

为克服这些障碍，我们开发了一种替代技术，该技术基于通过微小管道（外径 < 1.6 毫米）。我们的目标是研制一种简单、可靠且低成本的装置，以实现干净且可控的 原位 从特定位置（如底栖悬浮物滤食生物的出水口）进行水样采集。为确保有效性，该方法必须具有非侵入性，以免影响周围水流环境或改变被研究生物的行为。本文介绍的装置称为 VacuSIP，它是对 Yahel 开发的 SIP 系统的简化版本。 等. (2007) 18 用于深海ROV定点采样的VacuSIP系统比原始SIP成本显著降低，并已针对SCUBA作业进行了改进。该系统的设计依据Wright和Stephens（1978年）提出并验证的原理。 19 以及 Møhlenberg 和 Riisgård (1978) 20 适用于实验室环境。

尽管VacuSIP系统是为 原位 底栖滤食性生物新陈代谢研究，也可用于实验室研究，以及任何需要受控且洁净的点源水样的场合。当需要进行较长时间（分钟至小时级）的采样整合时，该系统尤为适用。 原位 需要进行过滤。自2011年以来，Yahel实验室已成功使用VacuSIP，并已在两项关于加勒比海和地中海海绵物种介导的营养通量的近期研究中得到应用。 21 （Morganti 等. 已提交。

特定采样器的使用、较长的采样时间以及VacuSIP应用时的野外条件，导致其在收集、过滤和储存对敏感分析物的样品时，与标准海洋学操作规程存在一定偏差。为降低VacuSIP系统可能带来的污染风险，或样品采集后因细菌活动导致水样成分发生改变的风险，我们测试了多种 原位 过滤与储存步骤。为获得最适合分析溶解无机磷（PO43-，一氧化氮x-，NH4+，SiO4）以及有机化合物（DOC + DON）和超微型浮游生物（<10 µm）以及颗粒有机碳（POC + PON）的采样。为进一步降低污染风险，尤其是在野外条件下，将操作步骤减少至最少。该方法以可视化形式呈现，旨在提高可重复性，并缩短高效应用该技术所需的时间。

系统概述

取样 原位 利用呼出孔小至2 mm的悬停滤食性生物泵送海水，首先在入水口附近释放经滤过的荧光素染色海水，观察其从出水口的流动情况，以可视化每个样本的泵水活动 16 （另见图2B） 18）。随后，通过安装在定制操作器上的两根微型管或其中两根管，同时采集被试样本吸入和呼出的水（进流和出流）。 "臂" 倒置的柔性便携式三脚架图1 和 补充视频 1）。通过将一根管子的近端小心地置于受试生物的入水口内部或附近，以收集该生物吸入的水。随后，将另一根相同的管子置于排水口内。此操作需格外小心，以避免接触或干扰动物。 例如通过沉积物再悬浮进行采样。开始采样时，潜水员使用连接在每根采样管远端的注射器针头刺穿采样容器上的隔膜，使外部水压将水样经由采样管压入容器中。样品的吸入由采样瓶内预先创建的真空以及外部水体与已抽真空的采样容器之间的压力差共同驱动。

为确保收集呼出的水分干净，并避免意外吸入环境中的水 16，水样的采集速率需要保持在显著较低的水平（<10%）。吸力速率由管道的长度及其内径（ID）控制。较小的内径还可确保死体积可忽略不计（< 每米管路200 µl）。长时间（数分钟至数小时）采样可对大多数目标物质固有的空间异质性进行积分整合。为确保在长时间水下采样过程以及样品运输至实验室期间得到充分保存，需采取 原位 对于敏感分析物，建议采用过滤法。采样容器、过滤装置和管路的选择取决于研究对象生物及具体的研究问题。以下所述方案假定关注的是完整的代谢谱（综述见 图2）。然而，由于该方案具有模块化特性，因此可轻松修改以适应更简单甚至截然不同的采样方案。为了获得完整的代谢谱，采样方案应包括以下步骤：（1）水流可视化；（2）采集超微型浮游生物摄食（浮游生物 < 10 µm）；（3）采样无机营养物质的吸收与排泄（使用在线滤器）；（4）采样溶解性有机物的吸收与排泄（使用在线滤器）；（5）颗粒物摄食与排泄（使用在线滤器）；（6）重复步骤2（超微型浮游生物摄食作为质量检查）；（7）流场可视化。

在条件允许的情况下，建议将代谢特征检测与泵速测定相结合例如， 染料前沿速度法，在 16以及呼吸作用测量。这些测量最好在采样过程的开始和结束时进行。对于呼吸作用的测量，优先使用水下光学传感器或微电极。

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方案

1. 准备步骤和清洁程序

  1. 清洗液
    1. 始终佩戴防护装备，包括实验服和手套。在无尘、无烟的洁净环境中进行这些准备工作。
    2. 使用新鲜、高质量的重蒸水配制5-10%的盐酸（HCl）溶液。
    3. 使用新鲜、高质量的重蒸水配制5%高溶解性阴离子与非离子表面活性剂混合溶液（参见材料列表）。
    4. 将所有溶液储存于洁净、经酸洗的容器中。
  2. 预备步骤及实验室清洁程序
    注意：如果对磷化合物不感兴趣，可用高质量的磷酸替代盐酸洗涤步骤（HCl3PO4) 洗涤（8% H3PO4 终浓度）
    1. 始终佩戴防护装备、实验服和手套。
    2. 用大量高纯水清洗采样装置（不包括在线不锈钢Swinney滤器 holder）。将装置在5-10% HCl溶液中浸泡过夜。再次用大量高质量的重蒸水冲洗装置。
    3. 用大量高纯水清洗在线式不锈钢Swinney滤器 holder。将滤器 holder 浸泡于5%高溶解性阴离子与非离子表面活性剂混合溶液中过夜。再次用大量高质量的重蒸水冲洗。
    4. 将所有采样设备干燥后，用铝箔包裹，并存放于洁净容器中，直至使用。
  3. 吸力速率控制
    1. 通过根据计划的工作深度和水温调节进样管的长度和内径来控制采样速率。以下方程（源自用于充分发展层流管流的哈根-泊肃叶方程）可作为指导： 流体动力学；F=ΔPπr⁴/8KLη；描述管道中流动的方程；用于教学 其中，F = 流速（cm3 分钟-1)，ΔP = 压差（bar），r = 进样管内半径（cm），K = 2.417 × 10-9 秒-2），L = 管长（cm），V = 水的黏度（g·cm⁻¹·s⁻¹）-1 秒-1）。参见 表1 详情请见。
    2. 采样速率应低于被研究动物泵速的1%。
      注意：使用抽真空容器时，有时因真空度未知会带来额外的复杂性。因此，强烈建议进行现场测试。在10 m水深及约22 °C 海水（40 PSU），50 cm长、内径为 254 µm 提供约 ~ 的平均吸力速率26 µl 秒-1 (1.56 ml min-1).
  4. 采样容器
    1. 对于小体积样品（3-20 ml， 例如， 超微浮游生物流式细胞术使用预先抽真空的无菌塑料管。
      注意：预抽真空的无菌塑料管通常用于人类的标准血液检测；务必使用不含添加剂的无菌管。采集此类真空无菌塑料管时，最好使用带有偏心鲁尔接头的一次性无菌试管持架。虽然这是最安全且最高效的采样装置，但其死腔体积相较于简单的针头略大。
    2. 对于较大的水样，如营养盐和溶解性有机物，应使用符合美国环境保护署（EPA）挥发性有机物分析要求的40或60 ml玻璃小瓶。这些小瓶配有带聚四氟乙烯（PTFE）覆面硅胶隔垫的聚丙烯盖。
    3. 对于更大体积的样品，可使用带橡胶塞的青霉素瓶或真空瓶。
    4. 使用高密度聚乙烯瓶（HDPE 瓶）盛装硅样品。
    5. 为增加样品体积并降低上升过程中瓶塞脱落的风险，下潜前需使用真空泵对1.4.2–1.4.4项物品进行抽真空处理。可通过手动真空泵或用注射器抽吸空气的方式进行手动抽真空。但为获得最佳效果，建议使用性能良好的真空泵。标准冷冻干燥机可提供高真空环境。
      注意：使用大容量真空烧瓶时需格外小心，确保初始抽吸速度过快不会污染呼出的水样。
  5. 血管清洁程序
    1. 对于溶解性有机物和NH4+ 分析时，使用新的预清洗EPA小瓶。
    2. 冲洗小瓶（玻璃和高密度聚乙烯材质），用于其他营养物质的分析，步骤如下：
      1. 用高质量的双蒸水冲洗小瓶（玻璃和高密度聚乙烯材质）和聚丙烯瓶盖。安装新的硅胶隔垫。
      2. 将小瓶（玻璃和高密度聚乙烯材质）浸泡在10%盐酸中至少3天，然后用大量高质量的双蒸水冲洗。
      3. 灼烧玻璃小瓶 450 °C 4小时，随后在炉中冷却。安装盖子，并用铝箔包裹，待用。
  6. 滤光片
    1. 使用无黏合剂的玻璃纤维滤膜过滤所有溶解性有机样品（例如，DOC，DON）以及颗粒有机物的采集（例如，POC，PON）。将每片玻璃滤膜分别包裹在铝箔袋中，在高温下灼烧 400 °C 2小时内挥发有机残留物，然后储存于洁净干燥的容器中，直至使用。
    2. 使用上述无黏合剂的玻璃纤维滤膜，或 0.2 µm 用于采样无机营养物的聚碳酸酯膜例如， PO43-，一氧化氮x-，NH4+). 滤器安装至滤器 holder 后，按以下说明清洁（1.7.3）。
    3. 使用 0.2 µm 用于二氧化硅采样的聚碳酸酯膜滤膜。安装至滤膜夹具后，按以下说明（1.7.3）进行清洁。
  7. 过滤装置的制备
    1. 通过一个过滤器过滤高溶解度的阴离子与非离子表面活性剂溶液的碱性混合物以及高质量的双蒸水 0.2 µm 使用前先过滤，以清洁过滤装置。
    2. 用于去除营养盐和除硅酸盐以外的溶解性有机物的过滤装置：
      1. 将燃烧过的无粘合剂玻璃纤维滤膜置于已清洗的不锈钢Swinney在线滤器支架内。
      2. 使用经酸清洗的注射器，将100 ml 5%高溶解性阴离子与非离子表面活性剂混合溶液通过整个装置，随后再通过100 ml高质量的重蒸水。
    3. 用于SiO的过滤装置4:
      1. 将聚碳酸酯滤膜放入已清洗的聚碳酸酯滤膜 holder（PC filter holder）中。
      2. 使用经酸清洗的注射器，将30 ml 5% HCl和30 ml高质量的重蒸水通过整个装置。
  8. 系统组装
    1. 使用外径（OD）为1.6 mm、内径（ID）为1.0 mm的聚醚醚酮（PEEK）管组装水下作业系统 254 µm 或 177 µm.
    2. 使用锋利的刀片或PEEK切割器将管子切割至所需长度。
    3. 在管子的远端（样品容器侧），将带有注射器针头的雄性鲁尔接头安装到每根管上。务必遵循制造商的说明，在拧紧绿色螺母之前，将蓝色无法兰卡套的平面侧与管端对齐。
    4. 使用绝缘胶带将PEEK管连接到三脚架“臂”或定制的操纵器上。
    5. 将一次性注射器针头连接至雄性鲁尔接头。保留针头的保护帽以防止受伤。
    6. 清晰标记采样设备，并对所有吸入和呼出组件进行颜色编码例如，绿色=In，红色=Ex。
    7. 以相同颜色对采样容器进行编码，并将成对的采样容器依次编号。

2. 水下作业

  1. 工作地点准备
    1. 初步调查与样本选择
      注意：由于水下采样流程较为复杂，投入必要的时间进行准备工作将确保采样潜水的高效性。
      1. 对工作地点进行勘察，并提前完成必要的准备工作。
      2. 选择并标记易于接近的目标生物。由于并非所有生物在采样潜水时都可能处于活跃状态，因此应准备比预期采样数量更多的工作站。
    2. 安装基座支撑结构
      1. 在平坦基底上作业时：
        1. 将柔性三脚架的原装快速释放夹安装在1 kg的潜水配重上，并将其放置在目标动物旁边即可。
      2. 在垂直岩壁上作业时：
        1. 在工作地点准备阶段（2.1.1），安装VacuSIP系统的基座支撑板、附件设备的挂钩，以及用于承载收集容器托盘的挂架。
        2. 当使用柔性便携式三脚架时，使用螺栓或双组分环氧树脂将10×10 cm的PVC板固定在每个目标动物旁边。每块板需预留一个孔，用于安装柔性便携式三脚架的快速释放夹。
        3. 待树脂固化且基板牢固附着于岩壁后，将快速释放夹拧入基板中，作为VacuSIP系统柔性便携式三脚架的稳固连接点。
  2. 安装VacuSIP装置
    1. 通过在进水口附近释放过滤后的荧光素染料，检查样本是否正在泵水，并确认染料从出水口排出，方法如Yahel et al. (2005) 16 所述。
    2. 安装VacuSIP装置，将进水（IN）采样管置于进水口内或紧邻其旁（距离约5 mm以内）。确保进水管不靠近其他出水口。
    3. 小心地将出水（EX）采样管指向出水孔/出水海绵管，并极其轻柔地插入，使其位于出水孔/出水海绵管内部1–5 mm处（见图1和补充视频1）。操作时务必避免接触或干扰被采样的生物体。
    4. 在采样前及采样过程中，反复确认两根采样管的位置。
    5. 采样结束后，按照上述方法（2.2.1）再次检查样本是否仍在泵水。
      注意：由于操作三脚架一臂时可能导致另一臂移动，应先放置进水采样管，再放置出水采样管，后者需要更精确的操作。按此顺序操作，即使调整出水采样管时引起进水管轻微移动，也不会影响采样结果。
  3. 模块化水下采样流程
    注意：根据研究问题的不同，以下每个实验步骤均可独立进行。下述完整的代谢谱采样流程耗时较长，每份样本可能需要长达8小时（概览见图2和表2）。由于不同采样地点、地区和机构的潜水条件与规定各不相同，本方案未包含具体的潜水计划。然而，必须对潜水计划给予高度重视并进行周密规划，特别注意避免饱和潜水和“yo-yo”式潜水剖面。如条件允许，建议在较浅水深（< 10 m）进行此类实验。闭路循环呼吸器（closed circuit rebreathers）对于此类长时间采样非常适用。
    1. 在正式采样开始前，确保无可见的荧光素残留痕迹，且悬浮沉积物已沉降或被水流带走。 
       
    2. 超浮游生物采样（此步骤不安装滤膜！）
      1. 使用针头刺穿进水（IN，吸入）和出水（EX，呼出）真空无菌塑料管的隔膜。确认水流以预定速率滴入，并收集2–6 ml水样。
      2. 回收后，将样品置于冰盒中冷藏。在实验室中，用1%多聚甲醛 + 0.05%电镜级戊二醛（终浓度）或0.2%电镜级戊二醛固定样品。将冻存管在液氮中速冻，并于-80 °C保存至分析。
    3. 硅酸盐采样与保存
      1. 在采样管末端的针头与鲁尔公接头之间，安装预清洗的不锈钢在线PC滤器，内含0.2 µm聚碳酸酯膜。
      2. 刺穿预清洗的高密度聚乙烯瓶（HDPE瓶）的隔膜盖以开始采样。确认两个采样器均在滴水，并在每个瓶中收集15 ml水样。
      3. 将样品冷藏（4 °C）至分析。若两周内无法开始分析，则应于-20 °C保存。分析前需在50 °C下解冻至少50分钟，以溶解硅胶。
        注意：滤膜可根据需要保留用于显微镜观察或DNA分析。
    4. 溶解性无机物（PO43-、NOx-、NH4+）采样
      1. 将PC滤器组件更换为含有预灼烧玻璃滤膜的预清洗不锈钢在线滤器。
      2. 采样前，使用EPA玻璃瓶、HDPE瓶或其他真空容器启动抽吸，确保至少有20 ml海水通过整个过滤系统。在弃去前测量所收集水样的体积。
      3. 刺穿相应的EPA玻璃瓶隔膜盖以开始采样，确认两个采样器均在滴水，并为硝酸盐和磷酸盐分析各收集25–30 ml水样。
      4. 更换为新的EPA玻璃瓶进行氨分析，确认两个采样器均在滴水，并在每个瓶中收集20 ml水样。
      5. 将样品置于冰盒中冷藏，并于-20 °C保存至分析。
        注意：若仅需滤过液，可在步骤2.3.3和2.3.4中使用一次性注射器滤器。
    5. 溶解性有机物（DOC+DON）采样与保存
      注意：在整个操作过程中应尽量保持样品直立，避免样品水接触硅胶隔膜。
      1. 继续使用不锈钢滤器组件，按上述方法将20 ml海水样品收集至新的EPA玻璃瓶中。
      2. 回收后，将样品置于冰盒中冷藏。在实验室中，使用预灼烧的玻璃巴斯德移液管，加入正磷酸（向20 ml样品中加入5–6滴25%痕量金属级酸，终浓度0.04%）或盐酸（向20 ml样品中加入2滴痕量金属级浓酸，终浓度0.1%）进行固定，并保持冷藏。
      3. 将样品冷藏（4 °C）至分析。若采集后一周内未进行分析，应于-20 °C保存至分析。
    6. 颗粒有机物（POC、PON、POP）采样
      1. 继续使用不锈钢滤器组件，将至少500 ml海水过滤至一个250 ml的真空集气瓶中。必要时更换集气瓶。
      2. 回收后，使用充满空气的注射器将滤器中残余海水完全抽出，用铝箔包裹后置于冰盒中冷藏。在实验室中，将滤膜从滤器中取出，并于-20 °C保存至分析。

水下珊瑚呼吸实验装置，测量珊瑚气体交换，海洋生物学研究。
图1. VacuSIP 正确安装示例：（A）使用定制机械臂对红海亚喀巴湾的被囊动物Polycarpa mytiligera进行采样，进水样本以绿色标记，出水样本以黄色标记（照片由 Tom Shelizenger 和 Yuval Yacobi 拍摄）；（B）使用 VacuSIP 装置对西北地中海海域的海绵Agelas oroides（出水口宽度为 3 mm）进行采样，进水样本以黄色标记，出水样本以红色标记。请点击此处查看该图的放大版本。

显示过滤装置和VacuSIP安装过程的制备与取样示意图。
图2. 本方案部分所述VacuSIP技术的概览。实验室内工作以黄色框表示，野外工作以蓝色框表示。请点击此处查看该图的放大版本。

表格形式的容器类型和体积；评估真空效应对采集体积和速率的影响。
表 1. 使用不同容器和不同真空度进行水样采集时获得的平均采样速率（ml min-1）：烧瓶未抽真空（无）；EPA 玻璃小瓶和高密度聚乙烯（HDPE）小瓶抽去其一半体积的空气（½ 体积）；无菌塑料管由制造商预先抽真空。实验条件为水深 5-8 m，水温 18-22 °C，使用长度为 79 cm、内径为 25 µm 的聚醚醚酮（PEEK）管。

样品保存与分析方法图表：流式细胞术、钼酸盐比色法、高温燃烧法。
表 2. 本方案部分所述的采样容器、固定剂、在线过滤装置、储存条件及分析方法概览。所分析的化合物包括：超微型浮游生物丰度（粒径 < 10 µm 的浮游生物）、硅酸盐（SiO4）、磷酸盐（PO43-）、亚硝酸盐 + 硝酸盐（NO2- + NO3-）、溶解性有机质（DOM）、铵盐（NH4+）和颗粒性有机质（POM）。所有采样容器均配有硅胶隔垫盖，并在采样前进行抽真空处理。所用固定剂包括：多聚甲醛 + 戊二醛（Glut + Parafor）、正磷酸（H3PO4）和盐酸（HCl）。所使用的在线过滤装置包括：聚碳酸酯滤器及0.2 µm聚碳酸酯膜滤膜（PC filter holder + PC membrane），以及不锈钢滤器和无黏合剂玻璃纤维滤膜GFF。

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结果

海水采集方法的优化

收集管的选择与清洗步骤

与VacuSIP兼容的采样容器应配有隔垫，以便通过注射器针头穿刺启动取样。容器需能承受水下较高压力（典型水肺工作深度下的压力为2-3巴），并可维持真空状态。许多（但并非所有品牌）经美国环保局（EPA）批准用于挥发性有机物分析的样品瓶均符合这些要求。此外，也有专为溶解性有机碳（DOC）和溶解性有机氮（DON）分析预清洁处理的样品瓶可供使用。为测试这些样品瓶在营养盐采集与分析中的适用性，并优化其清洗程序，分别使用新购买的经酸清洗的聚丙烯管（PP管）、经酸清洗的高密度聚乙烯样品瓶（HDPE瓶）以及配有聚四氟乙烯（PFTE）隔垫盖的EPA玻璃瓶，采集了高质量的双蒸水。HDPE瓶和聚丙烯管的清洗方法如上文第1.5....

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讨论

准备步骤

用于DOM和营养盐分析的收集瓶

由于采样容器可能与溶解的微量成分发生相互作用，且采样器管壁可能成为细菌生长的基质30-34，因此测试了用于DOM和营养盐采集的不同小瓶。硼硅酸盐玻璃瓶不推荐用于硅酸盐的定量分析33,35，因为若样品未迅速冷冻，玻璃瓶可能导致硅酸盐初始浓度升高至两倍30。我们的 结果表明 ，使用预先清洗过的EPA小瓶 可获得较低浓度的 DOC、DON和无机营养盐空白值，尤其是铵盐最为显著。

DOC 的过滤与储存

过滤是海洋化学和微生物学研究中必需的分析步骤，在许多情况下也是第一步。尽管可以在实验室中采集样品后再进行过滤，但这种方法不推荐用于原位（...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

我们感谢 Manel Bolivar 在野外工作中的协助。感谢"蒙特格里自然公园、梅德斯群岛及巴伊克斯河口"对我们研究工作的支持以及采样许可。水下操作装置由 Ayelet Dadon-Pilosof 设计，并由 Pilosof 先生制作完成。本研究得到了西班牙政府 CSI-Coral 项目 [资助号 CGL2013-43106-R，授予 RC 和 MR] 以及西班牙教育、文化与体育部（MECD）"F.P.U 奖学金"对 TM 的资助。本研究也是由加泰罗尼亚政府资助的海洋生物地球化学与全球变化研究团队 [资助号 2014SGR1029]、以色列科学基金会（ISF）资助项目 1280/13 和美国-以色列双边科学基金会（BSF）资助项目 2012089 对 G. Yahel 的支持成果之一。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
原始 GorillaPodJobyGP000001柔性便携式三脚架 
无法兰套管IDEX Health & Science P-200X1/16" 蓝色包装
公螺母IDEX Health & ScienceP-205X 1/16" 绿色包装，每包10个 
雌接雌鲁尔接头IDEX Health & Science P-658
雌接雄鲁尔接头IDEX Health & Science P-655
Peek 管（内径 254 µm）IDEX Health & Science 1531外径 1/16"，内径 0.01 英寸，长度 5 英尺。可使用其他内径规格。
双组分树脂环氧胶IVEGOR9257使用前需充分混合两种组分树脂
(TOC) EPA 样品瓶Cole -Parmer03756-2040 ml 玻璃瓶。Thomas Scientific 也生产（货号 9711F09）。
HDPE 样品瓶Wheaton986701 (E78620)20 ml 高密度聚乙烯样品瓶
Vacuette Z 无添加剂采血管Greiner bio-one455001由制造商预抽真空 
隔垫样品瓶Thomas Scientific1755C01250 ml 玻璃瓶 
隔垫盖 1WheatonW240844SP (E7865R)22-400 规格，适用于 HDPE 样品瓶 
隔垫盖 2WheatonW240846 (1078-5553)24-400 规格，适用于玻璃样品瓶和瓶子。Thermo Scientific National 也生产（货号 03-377-42）。
在线不锈钢 Swinney 滤器支架Pall516-9067直径 13 mm
PTFE 密封垫圈Pall 516-8064用于不锈钢滤器支架的环形垫圈
TCLP 玻璃滤膜Pall 516-9126无粘合剂玻璃纤维滤膜，直径 13 mm，孔径 0.7 µm
聚碳酸酯滤器支架Cole -Parmer17295直径 13 mm
Isopore 膜滤器MilliporeGTTP01300直径 13 mm，孔径 0.2 µm
Contrad 70 溶液 Decon Labs1002高溶解性阴离子与非离子表面活性剂混合溶液 
无菌注射器滤器VWR International Eurolab S.L.514-0061P直径 25 mm，孔径 0.2 µm
荧光素Sigma-Aldrich(旧货号 28802) 46955-100G100 g
Holdex，一次性，无菌Greiner bio-one450263无菌，一次性试管架，偏心鲁尔接头，适用于 Vacuette
无菌针头IcoGammaPlus51600.7 mm × 30 mm
Nalgene 冻存管NalgeneV5007(目录号 5000-0020)2 ml
纸质冻存盒 RubilaborM-600145×145×55 mm，用于 1.5 ml 微管
正磷酸Sigma79617 或可选超纯盐酸，终浓度 0.1%
多聚甲醛SigmaP6148500 g
戊二醛Merck8,206,031,00025%，1 L
手动真空泵 Bürkle 5620-2181 或可选标准实验室真空泵

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