VacuSIP：一种改进的InEx方法 原位 活性悬浮物滤食者处理的颗粒态与溶解态化合物的测定

摘要

我们介绍一种名为VacuSIP的简单、非侵入性且可靠的水体定点取样方法，可实现洁净而精确的水样采集。该系统已开发并用于同步采集底栖悬浮物滤食生物吸入和呼出的水样 原位， 准确测量颗粒物和溶解性化合物的去除与排泄。

摘要

底栖滤食生物在海洋生态系统功能中发挥着关键作用。它们通过过滤大量海水，去除浮游生物和碎屑，并排泄颗粒态和溶解态化合物，在底栖-水层耦合过程中扮演着重要角色。准确测量滤食生物（如海绵、海鞘、多毛类、双壳类）摄取和排泄的化合物，对其生理学、代谢及摄食生态学研究至关重要，也是评估这些生物介导的营养物质通量生态意义的基础。然而，目前可用的方法学存在局限性，限制了对自然环境中滤食生物处理颗粒态和溶解态化合物速率的准确评估。本研究旨在开发一种简单、可靠且非侵入性的方法，以实现从特定位置（如底栖滤食生物的出水孔）进行洁净且受控的水样采集。 原位我们的方法通过使用安装在定制操作装置上的微细导管，并将其精确置于被测生物的排泄孔内，从而实现对研究对象吸入和呼出水分的同步采集。将连接在每根导管远端的注射器针头刺入收集容器的隔膜，可使外界压力缓慢地将样品水经由采样导管压入容器中。这种缓慢且可控的采样速率能够在整合水体固有的空间异质性的同时，确保无污染采样。我们针对不同颗粒态和溶解态物质的分析，提供了最适宜的过滤装置、收集容器及储存程序的建议。VacuSIP 系统为在自然条件下定量测定未受干扰的悬浮摄食者代谢提供了一种可靠、经济且易于学习和应用的方法，可用于评估滤食性生物在不同生态系统中的生理特征与功能作用。

引言

底栖滤食性生物在海洋生态系统功能中发挥着至关重要的作用¹。通过过滤大量海水^2,3，它们可去除并排泄颗粒物（浮游生物和碎屑）以及溶解性化合物¹（及其中引用的文献），是实现底栖-水层耦合^4,5和养分循环^6,7的重要媒介。准确测量底栖滤食性生物（如海绵、被囊动物、多毛类和双壳类）所去除和排泄的颗粒物及溶解性化合物，是理解其生理学、代谢过程和摄食生态学的基础。结合泵水速率的测定，还可量化这些生物介导的养分通量，进而评估其对水质以及生态系统尺度过程的生态影响。

选择合适的方法来测定悬浮颗粒物和溶解性化合物被 滤食性悬浮生物的去除和产生速率，对于获得有关其摄食活动的可靠数据至关重要⁸。正如Riisgård等人所指出的，不恰当的方法会导致结果偏差，扭曲实验条件，造成对某些物质摄取和排泄量的错误估算，并可能导致对这些生物所处理的营养物质通量的错误量化。

测量滤食性生物中颗粒态和溶解态营养物质通量的两种最常用方法，分别是孵育法（间接技术）和同时采集环境水与呼出水（直接技术）。孵育法基于测定孵育水中颗粒态和溶解态营养物质浓度的变化速率，并与适当的对照组比较，从而估算其生成或去除速率⁸。然而，将生物体置于孵育容器中可能因其自然水流环境的改变、氧气和/或食物浓度的下降，或孵育水中排泄....

方案

1. 准备步骤和清洁程序

1. 清洗液
   1. 始终佩戴防护装备，包括实验服和手套。在无尘、无烟的洁净环境中进行这些准备工作。
   2. 使用新鲜、高质量的重蒸水配制5-10%的盐酸（HCl）溶液。
   3. 使用新鲜、高质量的重蒸水配制5%高溶解性阴离子与非离子表面活性剂混合溶液（参见材料列表）。
   4. 将所有溶液储存于洁净、经酸洗的容器中。
2. 预备步骤及实验室清洁程序
   注意：如果对磷化合物不感兴趣，可用高质量的磷酸替代盐酸洗涤步骤（HCl₃PO₄) 洗涤（8% H₃PO₄ 终浓度）
   1. 始终佩戴防护装备、实验服和手套。
   2. 用大量高纯水清洗采样装置（不包括在线不锈钢Swinney滤器 holder）。将装置在5-10% HCl溶液中浸泡过夜。再次用大量高质量的重蒸水冲洗装置。
   3. 用大量高纯水清洗在线式不锈钢Swinney滤器 holder。将滤器 holder 浸泡于5%高溶解性阴离子与非离子表面活性剂混合溶液中过夜。再次用大量高质量的重蒸水冲洗。
   4. 将所有采样设备干燥后，用铝箔包裹，并存放于洁净容器中，直至使用。
....

结果

海水采集方法的优化

收集管的选择与清洗步骤

与VacuSIP兼容的采样容器应配有隔垫，以便通过注射器针头穿刺启动取样。容器需能承受水下较高压力（典型水肺工作深度下的压力为2-3巴），并可维持真空状态。许多（但并非所有品牌）经美国环保局（EPA）批准用于挥发性有机物分析的样品瓶均符合这些要求。此外，也有专为溶解性有机碳（DOC）和溶解性有机氮（DON）分析预清洁处理的样品瓶可供使用。为测试这些样品瓶在营养盐采集与分析中的适用性，并优化其清洗程序，分别使用新购买的经酸清洗的聚丙烯管（PP管）、经酸清洗的高密度聚乙烯样品瓶（HDPE瓶）以及配有聚四氟乙烯（PFTE）隔垫盖的EPA玻璃瓶，采集了高质量的双蒸水。HDPE瓶和聚丙烯管的清洗方法如上文第1.5........

讨论

准备步骤

用于DOM和营养盐分析的收集瓶

由于采样容器可能与溶解的微量成分发生相互作用，且采样器管壁可能成为细菌生长的基质^30-34，因此测试了用于DOM和营养盐采集的不同小瓶。硼硅酸盐玻璃瓶不推荐用于硅酸盐的定量分析^33,35，因为若样品未迅速冷冻，玻璃瓶可能导致硅酸盐初始浓度升高至两倍³⁰。我们的 结果表明 ，使用预先清洗过的EPA小瓶 可获得较低浓度的 DOC、DON和无机营养盐空白值，尤其是铵盐最为显著。

DOC 的过滤与储存

过滤是海洋化学和微生物学研究中必需的分析步骤，在许多情况下也是第一步。尽管可以在实验室中采集样品后再进行过滤，但这种方法不推荐用于原位（.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
原始 GorillaPod	Joby	GP000001	柔性便携式三脚架
无法兰套管	IDEX Health & Science	P-200X	1/16" 蓝色包装
公螺母	IDEX Health & Science	P-205X	1/16" 绿色包装，每包10个
雌接雌鲁尔接头	IDEX Health & Science	P-658
雌接雄鲁尔接头	IDEX Health & Science	P-655
Peek 管（内径 254 µm）	IDEX Health & Science	1531	外径 1/16"，内径 0.01 英寸，长度 5 英尺。可使用其他内径规格。
双组分树脂环氧胶	IVEGOR	9257	使用前需充分混合两种组分树脂
(TOC) EPA 样品瓶	Cole -Parmer	03756-20	40 ml 玻璃瓶。Thomas Scientific 也生产（货号 9711F09）。
HDPE 样品瓶	Wheaton	986701 (E78620)	20 ml 高密度聚乙烯样品瓶
Vacuette Z 无添加剂采血管	Greiner bio-one	455001	由制造商预抽真空
隔垫样品瓶	Thomas Scientific	1755C01	250 ml 玻璃瓶
隔垫盖 1	Wheaton	W240844SP (E7865R)	22-400 规格，适用于 HDPE 样品瓶
隔垫盖 2	Wheaton	W240846 (1078-5553)	24-400 规格，适用于玻璃样品瓶和瓶子。Thermo Scientific National 也生产（货号 03-377-42）。
在线不锈钢 Swinney 滤器支架	Pall	516-9067	直径 13 mm
PTFE 密封垫圈	Pall	516-8064	用于不锈钢滤器支架的环形垫圈
TCLP 玻璃滤膜	Pall	516-9126	无粘合剂玻璃纤维滤膜，直径 13 mm，孔径 0.7 µm
聚碳酸酯滤器支架	Cole -Parmer	17295	直径 13 mm
Isopore 膜滤器	Millipore	GTTP01300	直径 13 mm，孔径 0.2 µm
Contrad 70 溶液	Decon Labs	1002	高溶解性阴离子与非离子表面活性剂混合溶液
无菌注射器滤器	VWR International Eurolab S.L.	514-0061P	直径 25 mm，孔径 0.2 µm
荧光素	Sigma-Aldrich	(旧货号 28802) 46955-100G	100 g
Holdex，一次性，无菌	Greiner bio-one	450263	无菌，一次性试管架，偏心鲁尔接头，适用于 Vacuette
无菌针头	IcoGammaPlus	5160	0.7 mm × 30 mm
Nalgene 冻存管	Nalgene	V5007(目录号 5000-0020)	2 ml
纸质冻存盒	Rubilabor	M-600	145×145×55 mm，用于 1.5 ml 微管
正磷酸	Sigma	79617 或可选超纯盐酸，终浓度 0.1%
多聚甲醛	Sigma	P6148	500 g
戊二醛	Merck	8,206,031,000	25%，1 L
手动真空泵	Bürkle	5620-2181 或可选标准实验室真空泵