使用PNA探针通过荧光原位杂交（FISH）在秀丽隐杆线虫中对端粒和重复序列进行观察与定量

摘要

我们报道了一种在秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis elegans）的生殖腺和胚胎中进行荧光原位杂交（FISH）的简明实验流程，用于观察和定量重复序列。 我们成功地观察并定量了两种不同的重复序列：端粒重复序列以及端粒替代延长模板（TALT）。

摘要

端粒是一种核糖核蛋白结构，可保护染色体末端免于异常融合和降解。端粒长度通过端粒酶或一种称为端粒替代延长（alternative lengthening of telomeres, ALT）的替代途径来维持。¹. 最近， 秀丽隐杆线虫 已成为研究端粒和替代性延长端粒（ALT）机制的多细胞模式生物²基因组中重复序列的可视化对于理解端粒生物学至关重要。尽管端粒长度可通过端粒限制性片段分析或定量PCR进行测定，但这些方法仅能提供平均端粒长度。相比之下，荧光 原位 杂交（FISH）可提供细胞中单个端粒的信息。本文提供了用于测定端粒长度的方法的实验方案及代表性结果 秀丽隐杆线虫 通过荧光 原位 杂交。该方法提供了一种简单但功能强大的 原位 一种不会对形态造成明显损伤的实验方法。通过使用荧光标记的肽核酸（PNA）和地高辛-dUTP标记的探针，我们能够同时可视化两种不同的重复序列：端粒重复序列和ALT模板（TALT） 秀丽隐杆线虫 胚胎和性腺

引言

端粒可保护染色体末端免受异常融合和降解。哺乳动物的端粒由富含G的六核苷酸重复序列TTAGGG及端粒保护蛋白复合物（shelterin complexes）组成。线虫的端粒重复序列与哺乳动物相似（TTAGGC）。大多数真核生物利用端粒酶将端粒重复序列添加至染色体末端。然而，约10%至15%的癌细胞采用不依赖端粒酶的机制维持端粒长度，该机制被称为端粒替代性延长机制（Alternative Lengthening of Telomeres, ALT）³。此前，我们报道过在克服了严重不育性后存活的端粒酶突变品系中，端粒重复序列及其相关序列（称为TALT）在端粒区域发生了扩增²。

通过定量PCR或提供端粒总平均长度的Southern印迹法测量端粒长度^4,5,6,7全基因组测序数据中端粒重复序列的读段数也是总端粒含量的一个指标⁸尽管单个端粒长度分析（STELA）能够提供单个端粒的长度，但它无法提供端粒的空间位置信息⁹. 虽然POT-1::mCherry报告蛋白可提供端粒的空间信息 体内，因此无法代表双链端粒的长度，因为POT-1是一种单链端粒结合蛋白¹⁰.

尽管上述方法可提供重复序列的平均信息，荧光 原位 荧光原位杂交（FISH）可用于观察染色体水平上特定目标序列的数....

方案

1. 通过PCR用地高辛-dUTP标记探针

1. 按照先前所述方法¹³，使用含有地高辛标记的dUTP的10倍dNTP混合物进行PCR标记。
2. 根据制造商说明书，采用离心柱纯化法纯化PCR产物。
   1. 如果探针长度短于200 bp，则应使用离心柱层析法从反应混合物中去除游离的地高辛-dUTP，而非采用离心柱纯化法。

2. 准备多聚赖氨酸包被的载玻片

注意：整个过程大约需要2小时。除干燥步骤外，大多数步骤均在室温下进行。

1. 清洗载玻片
   1. 将载玻片放入塑料容器中，用去离子水（DW）短暂冲洗。倒去水后，向容器中加入含1%玻璃清洁剂的去离子水。
   2. 在室温（RT）下以50 rpm振荡15分钟。在室温下用去离子水洗涤载玻片3次，每次5分钟。
   3. 用70%乙醇振荡洗涤15分钟。弃去70%乙醇，将载玻片置于65 °C干浴仪上，晾干15分钟。
2. 多孔玻璃载玻片的多聚赖氨酸包被
   注意：多聚赖氨酸对载玻片的包被是关键步骤，因其可在整个染色过程中确保样本的附着。包被不良的载玻片会导致样本丢失。
   1. 用去离子水将多聚赖氨酸储备液稀释至0.01%（w/v）。向洁净载玻片的各孔中加入20 µl稀释后的0.01%（w/v....

结果

先前有报道称，端粒酶缺陷型突变体trt-1(ok410)可通过低频复制内部定位的“ALT模板”（TALT）序列以维持端粒，从而产生ALT存活株²。我们使用PNA探针在解剖的性腺中实现了端粒的可视化（图2A）。在trt-1(ok410)突变体和ALT存活株中均检测到微弱的端粒信号。模糊信号仅与DAPI染色重叠，提示该信号可能并非自发荧光。在秀丽隐杆线虫（C. elegans）端粒研究中，通过TRF分析 consistently 观察到染色体内部端粒样重复序列（ITR）^4,10。考虑到PNA探针具有高特异性，这些信号很可能代表基因组中广泛分布的ITR。

在trt-1 (ok410)中，每个粗线期细胞核的端粒斑点数量约为9个。在之前的研究中，通过结合单链端粒DNA的POT-1::mCherry蛋白观察到12个焦.......

讨论

本方案的主要优势在于操作简便，且对细胞结构的形态无明显损伤。本方案针对秀丽隐杆线虫（C. elegans）的荧光原位杂交（FISH）优化了多个步骤。FISH成功的关键步骤包括探针标记、胚胎固定和组织通透。地高辛-dUTP标记法可通过PCR或缺口平移法实现，是一种易于使用的标记方法。对于较长的目标序列标记，推荐采用缺口平移法。在此情况下，应使用适当的限制性内切酶对探针进行消化，以促进其穿透能力。不推荐使用生物素-dUTP标记，因为生物素标记的探针会产生过多的细胞质背景信号。尽管市面上有内源性生物素阻断试剂，但本研究未尝试使用。

该方案利用分离的胚胎增加细胞密度，以实现高效定量。肠道细胞核的 秀丽隐杆线虫 体积较大且为多倍体，与体细胞核的其余部分相比，会产生过多数量和高强度的端粒信号点。因此，整条蠕虫不适用于端粒的定量分析 秀丽隐杆线虫相比之下，胚胎适用于端粒长度的评估，因为其提供的细胞具有同质性，且不受多倍体的影响。

本方案采用2% PFA固定液，适用于端粒FISH实验。尽管.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
PNA 探针	PANAGENE	定制订单
抗地高辛荧光素，Fab片段	罗氏	11207741910	使用 PBST 以 1:200 稀释
地高辛-dUTP	罗氏	11573152910
牛血清白蛋白	SIGMA-ALDRICH	A-7906
多聚甲醛	SIGMA-ALDRICH	P-6148	在去离子水中加入几滴 NaOH 并加热，配制 4% 多聚甲醛溶液。加入 0.1 体积的 10× PBS。
Vectashield	Vector Laboratories	H-1200
杂交溶液			3x SSC，50% 甲酰胺，10% (w/v) 硫酸葡聚糖，50 μg/ml 肝素，100 μg/ml 酵母 tRNA，100 μg/ml 超声处理的鲑鱼精子DNA
杂交洗涤液			2x SSC，50% 甲酰胺
甲酰胺	BIONEER	C-9012	有毒的
甲醇	Carlo Erba
丙酮	Carlo Erba
肝素	SIGMA-ALDRICH	H3393	配制10 mg/ml的储存液
硫酸葡聚糖	SIGMA-ALDRICH	67578
10x PBS			对于1 L去离子水：80 g NaCl，2.0 g KCl，27 g Na2HPO4•7H2O，2.4 g KH2PO
PBST			1× PBS，0.1% Tween-20
聚山梨酯20	SIGMA-ALDRICH	P-2287	商品名为Tween-20
聚-L-赖氨酸溶液（0.1% w/v）	SIGMA-ALDRICH	P-8920	使用前配制新鲜的0.01% w/v溶液
M9			3 g KH2PO4，6 g Na2HPO4，5 g NaCl，1 ml 1 M MgSO₄4，H20 到 1 L
漂白液			20% 次氯酸钠，0.5 M KOH
抗体缓冲液			1× PBST，1 mM EDTA，0.1% BSA，0.05% 叠氮化钠（有毒）
封闭液			含5%牛血清白蛋白（BSA）的抗体缓冲液
illustra Microspin G-50	GE 医疗	27-53310-01
20x SSC			配制1 L溶液需175.3 g NaCl、88.2 g 柠檬酸钠、H20至1升，调节pH至7.0
2x SSCT			2x SSC，0.1% Tween-20
10x 地高辛-dUTP 混合液			1 mM dATP，1 mM dGTP，1 mM dCTP，0.65 mM dTTP，0.35 mM DIG-11-dUTP
PCR 纯化柱	Cosmo genetech	CMR0112
玻璃清洁剂 / ULTRA CLEAN	Dukssan 纯化学品	8AV721
多孔玻璃载片	MP Biomedicals	96041205
线虫生长培养基			配制1 L培养基需3 g NaCl、17 g琼脂、2.5 g蛋白胨、H2O 至 974 ml。高压灭菌后冷却烧瓶，加入 1 ml 1 M CaCl2，1 ml 4 mg/ml 胆固醇乙醇溶液，1 ml 1 M MgSO₄4，25 ml 的 1 M KPO4.
左旋咪唑	SIGMA-ALDRICH	196142
剃刀	羽毛	11号刀片
Rnase A	Enzynomics
BSA	SIGMA-ALDRICH	A7906
共聚焦显微镜	蔡司	LSM 510	使用 EC Plan-Neofluar 100X 作为物镜。
湿盒			装有浸透去离子水纸巾的塑料盒
图像分析软件	Dr. Peter Landsdorp	TFL-telo	http://www.flintbox.com/public/project/502