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方法文章

使用PNA探针通过荧光原位杂交（FISH）在秀丽隐杆线虫中对端粒和重复序列进行观察与定量

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DOI：

10.3791/54224

⸱

2016年8月4日

 , 
1Institute of Molecular Biology and Genetics (IMBG), Seoul National University, 2Department of Biological Sciences, Seoul National University, 3Department of Biophysics and Chemical Biology, Seoul National University

本文内容

摘要

我们报道了一种在秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis elegans）的生殖腺和胚胎中进行荧光原位杂交（FISH）的简明实验流程，用于观察和定量重复序列。 我们成功地观察并定量了两种不同的重复序列：端粒重复序列以及端粒替代延长模板（TALT）。

摘要

端粒是一种核糖核蛋白结构，可保护染色体末端免于异常融合和降解。端粒长度通过端粒酶或一种称为端粒替代延长（alternative lengthening of telomeres, ALT）的替代途径来维持。1. 最近， 秀丽隐杆线虫 已成为研究端粒和替代性延长端粒（ALT）机制的多细胞模式生物2基因组中重复序列的可视化对于理解端粒生物学至关重要。尽管端粒长度可通过端粒限制性片段分析或定量PCR进行测定，但这些方法仅能提供平均端粒长度。相比之下，荧光 原位 杂交（FISH）可提供细胞中单个端粒的信息。本文提供了用于测定端粒长度的方法的实验方案及代表性结果 秀丽隐杆线虫 通过荧光 原位 杂交。该方法提供了一种简单但功能强大的 原位 一种不会对形态造成明显损伤的实验方法。通过使用荧光标记的肽核酸（PNA）和地高辛-dUTP标记的探针，我们能够同时可视化两种不同的重复序列：端粒重复序列和ALT模板（TALT） 秀丽隐杆线虫 胚胎和性腺

引言

端粒可保护染色体末端免受异常融合和降解。哺乳动物的端粒由富含G的六核苷酸重复序列TTAGGG及端粒保护蛋白复合物（shelterin complexes）组成。线虫的端粒重复序列与哺乳动物相似（TTAGGC）。大多数真核生物利用端粒酶将端粒重复序列添加至染色体末端。然而，约10%至15%的癌细胞采用不依赖端粒酶的机制维持端粒长度，该机制被称为端粒替代性延长机制（Alternative Lengthening of Telomeres, ALT）3。此前，我们报道过在克服了严重不育性后存活的端粒酶突变品系中，端粒重复序列及其相关序列（称为TALT）在端粒区域发生了扩增2。

通过定量PCR或提供端粒总平均长度的Southern印迹法测量端粒长度4,5,6,7全基因组测序数据中端粒重复序列的读段数也是总端粒含量的一个指标8尽管单个端粒长度分析（STELA）能够提供单个端粒的长度，但它无法提供端粒的空间位置信息9. 虽然POT-1::mCherry报告蛋白可提供端粒的空间信息 体内，因此无法代表双链端粒的长度，因为POT-1是一种单链端粒结合蛋白10.

尽管上述方法可提供重复序列的平均信息，荧光 原位 荧光原位杂交（FISH）可用于观察染色体水平上特定目标序列的数量及其空间分布模式。FISH无需纯化DNA，而是通过固定组织或细胞以保存其原有的空间信息。因此，FISH是一种兼具定量与定性功能的工具，可用于观察端粒重复序列等个别重复序列。

本方案基于先前描述的方法11,12进行了改进，提供了一种同时检测端粒和其他重复序列的高效方法。C. elegans的幼虫或成虫是具有高度分化细胞的多细胞生物。细胞的异质性阻碍了对大量端粒信号点进行定量分析。为了最大化分析的细胞数量，需分离胚胎并将其铺展在多聚赖氨酸包被的载玻片上进行荧光原位杂交（FISH）。此外，本方案还可与免疫荧光技术联合使用。

为验证该实验方案的有效性，我们展示了可同时观察并定量两种不同重复序列的结果。通过简单的PCR反应掺入地高辛-dUTP，制备针对TALT1的DNA探针。随后，将该TALT1探针与荧光标记的端粒PNA探针同时进行杂交。接着，采用经典的免疫荧光方法检测地高辛信号。本文展示了在trt-1存活细胞中TALT1与端粒共定位的代表性图像。

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方案

1. 通过PCR用地高辛-dUTP标记探针

  1. 按照先前所述方法13，使用含有地高辛标记的dUTP的10倍dNTP混合物进行PCR标记。
  2. 根据制造商说明书，采用离心柱纯化法纯化PCR产物。
    1. 如果探针长度短于200 bp，则应使用离心柱层析法从反应混合物中去除游离的地高辛-dUTP，而非采用离心柱纯化法。

2. 准备多聚赖氨酸包被的载玻片

注意：整个过程大约需要2小时。除干燥步骤外，大多数步骤均在室温下进行。

  1. 清洗载玻片
    1. 将载玻片放入塑料容器中，用去离子水（DW）短暂冲洗。倒去水后，向容器中加入含1%玻璃清洁剂的去离子水。
    2. 在室温（RT）下以50 rpm振荡15分钟。在室温下用去离子水洗涤载玻片3次，每次5分钟。
    3. 用70%乙醇振荡洗涤15分钟。弃去70%乙醇，将载玻片置于65 °C干浴仪上，晾干15分钟。
  2. 多孔玻璃载玻片的多聚赖氨酸包被
    注意：多聚赖氨酸对载玻片的包被是关键步骤，因其可在整个染色过程中确保样本的附着。包被不良的载玻片会导致样本丢失。
    1. 用去离子水将多聚赖氨酸储备液稀释至0.01%（w/v）。向洁净载玻片的各孔中加入20 µl稀释后的0.01%（w/v）多聚赖氨酸溶液。
    2. 在室温下孵育玻璃载玻片5分钟。
    3. 将载玻片置于65 °C干浴仪上，晾干1小时。
    4. 将多聚赖氨酸包被的载玻片保存在无尘盒中。

3. 将线虫固定在载玻片上（图1）

  1. 为FISH准备胚胎
    注意：在显微镜下观察培养基，于细菌食物被完全消耗前收获线虫。饥饿会降低成虫线虫的产卵量并增加卵的孵化率。详细方法见文献14,15。
    1. 按照标准方法在50 mm培养皿中培养线虫14。
    2. 当细菌食物被完全消耗后，用刮铲将琼脂培养基切成四等份。切割前对刮铲进行灭菌，以防止污染。
    3. 将所有琼脂块转移至100 mm线虫生长培养基（NGM）平板上。将琼脂块翻转，使线虫能够接触到新鲜的细菌食物。
    4. 48至72小时后，用M9缓冲液收集线虫。在NGM平板上加入3–5 ml M9缓冲液，用移液器吹打NGM表面以冲洗线虫。
    5. 收集含有线虫的液体，并转移至15 ml离心管中。
      注意：若收获后存在琼脂碎片，可将线虫在30%蔗糖溶液中离心。碎片会形成沉淀，而线虫则浮于表面。
    6. 加入M9缓冲液至总体积为15 ml。在300 × g条件下离心3分钟以沉淀线虫，去除大部分M9缓冲液。重复此步骤2次。
      注意：若离心后线虫仍漂浮，将离心机刹车档位设为1。
    7. 吸除M9缓冲液。向线虫中加入漂白液。每0.5 ml线虫样品，加入6.5 ml去离子水（DW）、2 ml次氯酸钠和1 ml 5 M KOH。
    8. 在室温下以50 rpm振荡孵育3分钟。涡旋15秒，以机械剪切线虫并释放卵。
    9. 在解剖显微镜下观察离心管中的反应过程。确保线虫被切断且卵已释放。当大部分成虫组织溶解后，加入M9缓冲液至总体积为15 ml。
    10. 在300 × g条件下离心3分钟。吸除大部分M9缓冲液，加入新鲜M9缓冲液至总体积为15 ml。重复洗涤3次。
      注意：避免使用过多线虫，因其会阻碍漂白过程。从开始漂白至洗涤前的总反应时间应少于8分钟。过度漂白的卵会产生强烈的自发荧光。
    11. 加入含聚山梨酯-20的磷酸盐缓冲盐水（PBST）至200 µl，再加入200 µl 4%多聚甲醛（PFA），配制成2% PFA溶液。
      警告：PFA具有致癌性，使用前请穿戴防护服、手套和护目镜。
    12. 取40 µl含卵的2% PFA溶液，滴加至经多聚赖氨酸包被的载玻片的孔中。
    13. 将载玻片置于湿盒中，在室温下孵育15分钟。放置载玻片后立即关闭湿盒。
      注意：卵在固定过程中会沉降至载玻片底部。
  2. 为FISH准备解剖的性腺
    1. 用移液器吸取1 ml M9缓冲液，从50 mm NGM平板上收获成虫线虫。在细菌食物耗尽前进行收获。
    2. 用M9缓冲液清洗线虫以去除残留细菌，清洗2次。
      注意：残留细菌可能干扰解剖后的性腺粘附至多聚赖氨酸包被的载玻片。
    3. 在300 × g条件下离心沉淀线虫。吸除M9缓冲液，用微量移液器将线虫转移至空白NGM平板上。
    4. 在经多聚赖氨酸处理的载玻片的孔中加入30 µl含2 mM左旋咪唑的M9缓冲液。
    5. 在1 ml离心管中加入500 µl M9缓冲液。用此缓冲液通过口吸移液管转移线虫。
    6. 将毛细管插入含M9缓冲液的1 ml离心管中，使口吸移液管尖端充满M9缓冲液。
    7. 在解剖显微镜下，将口吸移液管尖端置于成虫线虫头部前方，缓慢拖动移液管，使线虫头部进入尖端。一旦头部进入，整个虫体将被吸入尖端内。
    8. 使用口吸移液管将线虫转移至多聚赖氨酸包被的载玻片上。
    9. 使用刀片在载玻片上切断线虫的头部或尾部尖端。当线虫被切断时，性腺将弹出并粘附在载玻片上。
      1. 每个孔中至少准备30条线虫。可使用更多孔来处理另外30条线虫。
    10. 将载玻片放入湿盒中，用口吸移液管吸除M9缓冲液。
    11. 在湿盒中，加入20 µl 2% PFA，在室温下固定15分钟。

4. 固定与通透处理

  1. 将铝块置于干冰上，并存放在超低温冰箱（-80 °C）中。甲醇和丙酮储存于 -20 °C。
  2. 在 PFA 固定步骤 3.1.15 或 3.2.11 之后，使用微量移液器去除固定液，保留约 5 µl 固定液。
  3. 将另一张多聚赖氨酸包被的载玻片盖在样本载玻片上。若液体过多，可用纸巾吸除。载玻片一旦贴合，切勿移动。
  4. 将载玻片置于铝块上冷冻至少 15 分钟。
    注意：样本可至少保存 2–3 天。
  5. 在载玻片冷冻的同时，将装有预冷甲醇和丙酮的染色缸置于冰上。
  6. 取出载玻片，轻轻扭转以进行冷冻裂解。弃去上层载玻片。立即将载玻片浸入冰冻甲醇中，浸泡 5 分钟。
  7. 将载玻片转移至冰冻丙酮中，浸泡 5 分钟。
  8. 用 PBST 洗涤载玻片 3 次，每次 5 分钟，以去除残留固定液。随后进行下一步操作，或将载玻片置于 100% 乙醇中，4 °C 保存。
    注意：样本可至少保存 2–3 天。

5. 固定细胞的杂交

  1. 加入 20 µl RNase 溶液（含 10 µg/ml RNase A 的 PBST）。将载玻片置于湿盒中，37 °C 孵育 1 小时。
  2. 用 2× 含 polysorbate-20 的氯化钠-柠檬酸钠缓冲液（2× SSCT）洗涤载玻片两次，每次 15 分钟。
  3. 加入 20 µl 杂交溶液，并将湿盒放入 37 °C 培养箱中。1 小时后，用移液器吸除杂交溶液。
  4. 在去除杂交溶液前，准备探针。若探针为双链 DNA，需在干式加热块中 95 °C 加热 5 分钟以变性探针。加热后，立即将探针置于冰上短暂冷却。
  5. 向样本中加入含探针的 10 µl 杂交溶液。对于 PNA 探针，使用 1:2,000 的浓度比例；对于地高辛标记探针，使用 1:200 的浓度比例。用盖玻片覆盖样本。
  6. 将浸湿的纸巾置于加热块（80 °C）上。将塑料盒盖放在加热块上，以维持湿度和温度。
  7. 待加热块温度稳定至 80 °C 后，将样本载玻片放置于加热的湿纸巾上，并用塑料盒盖覆盖样本。变性样本 3 分钟。
  8. 将载玻片置于湿盒中，37 °C 过夜孵育。

6. 洗涤与免疫荧光染色

  1. 将杂交洗涤液（2x SSC，50% 甲酰胺）预热至 37 °C。
  2. 在室温下用 PBST 洗涤样品两次，每次 5 分钟。移除盖玻片。
  3. 在 37 °C 下用杂交洗涤液洗涤样品 30 分钟。
  4. 在室温下用 PBST 洗涤载玻片样品 3 次。注意：后续所有步骤均需在室温下的湿盒中进行。
  5. 加入 20 µl 封闭液，在湿盒中室温孵育 1 小时。
  6. 移除封闭液，加入 FITC 标记的抗地高辛抗体溶液（1:200），室温孵育 3 小时或 4 °C 过夜。

7. 封片与观察

  1. 用 PBST 清洗样本载玻片，每次 15 分钟，共洗两次。
  2. 加入 10 µl 含 DAPI 的封片液。盖上盖玻片并轻轻按压，用纸巾吸去多余液体。
  3. 为防止封片液蒸发，用指甲油密封盖玻片边缘。
  4. 在共聚焦显微镜下观察，排除背景荧光过高的胚胎，选择含有 4 - 20 个细胞核的视野进行观察。
  5. 按照仪器制造商的操作说明，使用 100X 物镜采集图像。
    注意：使用 405 nm 激光激发 DAPI，555 nm 激光激发 cy3，488 nm 激光激发 FITC。

8. 端粒信号的定量分析

注意：定量分析按照先前所述方法进行16。所有需要比较的图像应使用相同的设置拍摄，包括曝光时间和光源。

  1. 以 .tif 格式导出图像。
  2. 下载并安装图像分析软件。
  3. 运行图像分析软件，点击“同意”按钮。
  4. 点击“打开”按钮，通过双击图像文件打开端粒 FISH 图像。
  5. 点击 [编辑] - [选择处理区域]，通过左键单击并拖动选择感兴趣区域，排除所有非特异性染色部分。
  6. 点击 [测量] - [斑点光密度]，选择含有端粒信号的通道，并输入文件名以将结果保存为 .txt 文件。
    注意：结果列的顺序如下：斑点荧光强度、斑点背景强度、斑点面积。
  7. 复制数值，将斑点荧光强度减去斑点背景强度，所得数值即可进行统计分析。

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结果

先前有报道称，端粒酶缺陷型突变体trt-1(ok410)可通过低频复制内部定位的“ALT模板”（TALT）序列以维持端粒，从而产生ALT存活株2。我们使用PNA探针在解剖的性腺中实现了端粒的可视化（图2A）。在trt-1(ok410)突变体和ALT存活株中均检测到微弱的端粒信号。模糊信号仅与DAPI染色重叠，提示该信号可能并非自发荧光。在秀丽隐杆线虫（C. elegans）端粒研究中，通过TRF分析 consistently 观察到染色体内部端粒样重复序列（ITR）4,10。考虑到PNA探针具有高特异性，这些信号很可能代表基因组中广泛分布的ITR。

在trt-1 (ok410)中，每个粗线期细胞核的端粒斑点数量约为9个。在之前的研究中，通过结合单链端粒DNA的POT-1::mCherry蛋白观察到12个焦...

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讨论

本方案的主要优势在于操作简便，且对细胞结构的形态无明显损伤。本方案针对秀丽隐杆线虫（C. elegans）的荧光原位杂交（FISH）优化了多个步骤。FISH成功的关键步骤包括探针标记、胚胎固定和组织通透。地高辛-dUTP标记法可通过PCR或缺口平移法实现，是一种易于使用的标记方法。对于较长的目标序列标记，推荐采用缺口平移法。在此情况下，应使用适当的限制性内切酶对探针进行消化，以促进其穿透能力。不推荐使用生物素-dUTP标记，因为生物素标记的探针会产生过多的细胞质背景信号。尽管市面上有内源性生物素阻断试剂，但本研究未尝试使用。

该方案利用分离的胚胎增加细胞密度，以实现高效定量。肠道细胞核的 秀丽隐杆线虫 体积较大且为多倍体，与体细胞核的其余部分相比，会产生过多数量和高强度的端粒信号点。因此，整条蠕虫不适用于端粒的定量分析 秀丽隐杆线虫相比之下，胚胎适用于端粒长度的评估，因为其提供的细胞具有同质性，且不受多倍体的影响。

本方案采用2% PFA固定液，适用于端粒FISH实验。尽管...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

突变线虫品系由秀丽隐杆线虫遗传学中心（Caenorhabditis Genetics Center）惠赠。本研究得到了韩国卫生科技研发项目（Korea Health Technology R&通过韩国保健产业振兴院（KHIDI）由韩国保健福祉部资助的D项目 & 韩国保健福祉部（资助编号：HI14C1277）

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
PNA 探针PANAGENE定制订单
抗地高辛荧光素，Fab片段罗氏11207741910使用 PBST 以 1:200 稀释
地高辛-dUTP罗氏11573152910
牛血清白蛋白SIGMA-ALDRICHA-7906
多聚甲醛SIGMA-ALDRICHP-6148在去离子水中加入几滴 NaOH 并加热，配制 4% 多聚甲醛溶液。加入 0.1 体积的 10× PBS。
VectashieldVector LaboratoriesH-1200
杂交溶液3x SSC，50% 甲酰胺，10% (w/v) 硫酸葡聚糖，50 μg/ml 肝素，100 μg/ml 酵母 tRNA，100 μg/ml 超声处理的鲑鱼精子DNA
杂交洗涤液2x SSC，50% 甲酰胺
甲酰胺BIONEERC-9012有毒的
甲醇Carlo Erba
丙酮Carlo Erba
肝素SIGMA-ALDRICHH3393配制10 mg/ml的储存液
硫酸葡聚糖SIGMA-ALDRICH67578
10x PBS对于1 L去离子水：80 g NaCl，2.0 g KCl，27 g Na2HPO4•7H2O，2.4 g KH2PO
PBST1× PBS，0.1% Tween-20
聚山梨酯20SIGMA-ALDRICHP-2287商品名为Tween-20
聚-L-赖氨酸溶液（0.1% w/v）SIGMA-ALDRICHP-8920使用前配制新鲜的0.01% w/v溶液
M93 g KH2PO4，6 g Na2HPO4，5 g NaCl，1 ml 1 M MgSO₄4，H20 到 1 L
漂白液20% 次氯酸钠，0.5 M KOH
抗体缓冲液1× PBST，1 mM EDTA，0.1% BSA，0.05% 叠氮化钠（有毒）
封闭液含5%牛血清白蛋白（BSA）的抗体缓冲液
illustra Microspin G-50GE 医疗27-53310-01
20x SSC配制1 L溶液需175.3 g NaCl、88.2 g 柠檬酸钠、H20至1升，调节pH至7.0
2x SSCT2x SSC，0.1% Tween-20
10x 地高辛-dUTP 混合液1 mM dATP，1 mM dGTP，1 mM dCTP，0.65 mM dTTP，0.35 mM DIG-11-dUTP
PCR 纯化柱Cosmo genetechCMR0112
玻璃清洁剂 / ULTRA CLEANDukssan 纯化学品8AV721
多孔玻璃载片MP Biomedicals96041205
线虫生长培养基配制1 L培养基需3 g NaCl、17 g琼脂、2.5 g蛋白胨、H2O 至 974 ml。高压灭菌后冷却烧瓶，加入 1 ml 1 M CaCl2，1 ml 4 mg/ml 胆固醇乙醇溶液，1 ml 1 M MgSO₄4，25 ml 的 1 M KPO4.
左旋咪唑SIGMA-ALDRICH196142
剃刀羽毛11号刀片
Rnase AEnzynomics
BSASIGMA-ALDRICHA7906
共聚焦显微镜蔡司LSM 510使用 EC Plan-Neofluar 100X 作为物镜。
湿盒装有浸透去离子水纸巾的塑料盒
图像分析软件 Dr. Peter LandsdorpTFL-telohttp://www.flintbox.com/public/project/502

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端粒FISH秀丽隐杆线虫端粒长度端粒替代性延长端粒定量荧光显微镜探针杂交抗体染色
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