观察与端粒的定量和重复序列用荧光原位杂交（FISH）与PNA探针秀丽隐杆线虫

Summary

我们报道了秀丽隐杆线虫性腺和胚胎中荧光原位杂交 （FISH） 的简洁程序，用于观察和量化重复序列。 我们成功地观察并量化了两种不同的重复序列，端粒重复和端粒替代延长模板 （TALT）。

Abstract

Telomere 是一种核糖核蛋白结构，可保护染色体末端免受异常融合和降解。端粒长度由端粒酶或其他途径维持，称为端粒交替延长 （ALT）¹。最近，秀丽隐杆线虫已成为研究端粒和 ALT² 的多细胞模式生物。基因组中重复序列的可视化对于理解端粒的生物学特性至关重要。虽然端粒长度可以通过端粒限制性片段测定或定量 PCR 来测量，但这些方法仅提供平均端粒长度。相反，荧光原位杂交 （FISH） 可以提供细胞中单个端粒的信息。在这里，我们提供了通过荧光原位杂交确定秀丽隐杆线虫端粒长度的方法的方案和代表性结果。这种方法提供了一种简单但强大的原位程序，不会对形态造成明显的损害。通过使用荧光标记的肽核酸 （PNA） 和地高辛-dUTP 标记的探针，我们能够可视化两种不同的重复序列：秀丽隐杆线虫胚胎和性腺中的端粒重复序列和 ALT 模板 （TALT）。

Introduction

端粒可以防止异常融合和降解染色体末端。哺乳动物端粒是由G-丰富的六聚体重复，TTAGGG和shelterin复合物。线虫的端粒重复序列是相似的哺乳动物（TTAGGC）的。大多数真核生物利用端粒酶端粒重复添加到他们的染色体末端。然而，10 -癌细胞的15％利用端粒酶独立的机制，被称为端粒^（ALT）3的替代延长。此前，我们报道了端粒重复序列及其相关序列，命名为TALT，端粒酶的突变系存活的关键不育²端粒扩增。

端粒长度通过定量PCR或通过Southern印迹，其中提供总端粒^-4,5,6,7-的平均长度测量。在全基因组测序数据端粒重复的读取次数也总端粒⁸含量的指标。虽然仙GLE端粒长度分析（STELA）可以提供一个单一端粒的长度，它不能提供端粒⁹的空间信息。而POT-1 :: mCherry报告蛋白提供在体内的端粒的空间信息，它不能代表双链端粒长度为POT-1是一个单链端粒结合蛋白^10。

而上述的方法提供了重复序列的平均信息，原位杂交（FISH）荧光允许观察染色体规模的量和感兴趣的个体的序列的空间图案。代替的DNA的纯化，组织或细胞被固定到保持在FISH本地空间信息。因此，鱼为个别重复序列，如端粒重复序列的观察定量和定性的工具。

Protocol

1.标记探针与地高辛的dUTP通过PCR

1. 用含地高辛的dUTP 10X dNTP混合物，如前所述¹³进行PCR标记。
2. 根据制造商的指令用旋转柱纯化纯化PCR产物。
   1. 如果探针是短于200碱基对，除去游离的地高辛的dUTP从反应混合物自旋柱色谱法，而不是旋转柱纯化。

2.准备聚赖氨酸涂层幻灯片

注意:整个过程大约需要2小时。大多数的步骤都在室温下，除了在干燥步骤完成。

1. 清洁幻灯片
   1. 放置载玻片在一个塑料容器和漂洗载玻片简要地用蒸馏水​​（DW）。除去水和用含有1％玻璃清洁剂DW填充容器。
   2. 搅拌15分钟载玻片在室温下（RT）50的转速。用DW洗涤3幻灯片次在RT每次5分钟。
   3. 洗用70％乙醇的幻灯片搅拌15分钟。丢弃70％的乙醇，然后将玻片65℃的干燥块和风干15分钟上。
2. 多井载玻片的聚赖氨酸涂层
   注:玻璃片聚赖氨酸涂层是重要的一步，因为它提供了在整个染色过程中样品的附着力。差的涂覆的滑动将导致样品的损失。
   1. 稀释聚赖氨酸原液〜0.01％（重量/体积）在蒸馏水。添加的稀释0.01％20微升（重量/体积）聚赖氨酸到干净的载玻片上的孔中。
   2. 在室温下孵育5分钟载玻片。
   3. 放置在幻灯片的65℃的干体和空气干燥....

Results

据报道，此前ALT幸存者可以从端粒酶缺陷的突变通过复制内部本地化'ALT的模板"（TALT）的端粒维持²序列出现，TRT-1（ok410），在低频。使用PNA探针，我们能够想象在解剖性腺（ 图2A）的端粒。微弱的信号端粒检测无论是在TRT-1（ok410）和ALT幸存者。模糊信号被重叠只用DAPI，这表明它们可能不是自发荧光。间质性端粒样重复（ITR）的TRF分析一直被观察到C的研究线虫端粒^4,10。考虑PNA探针的高特异性，他们很可能要在ITR分散在整个基因组中。

端粒点的数量约为9％粗线核在TRT-1（ok410）。在以往的研究中，被POT-1 :: mCherry蛋白，结合单链DNA端粒观察¹⁰ 12重点。在野生型胚胎¹⁷中观察到的每核2.......

Discussion

我们的协议的主要优点是过程的，但无细胞结构的形态明显损坏的简单性。几个步骤C.进行了优化线虫 FISH在此协议。成功鱼的关键步骤包括探针标记，胚胎和渗透固定。地高辛的dUTP标记方法提供了通过PCR或缺口转译一个易于使用的标记方法。要标记长的靶序列，缺口平移是首选。在这种情况下，探头应用适当的限制性酶消化，以促进探针的渗透。不推荐生物素-dUTP标记，因为生物素标记的探针产生从细胞质背景信号的过量。虽然内源性生物素封闭试剂是可商购的，它不企图。

该协议使用分离的胚胎，以增加效率的定量细胞的密度。 的C肠核。线虫是体积大，是多倍体，这有助于过多的数量和端粒点的强度相比，体细胞核的其余部分。出于这个原因，整个蜗杆不适合在C端粒量化线虫 。与此相反，因为它们提供了均匀的细胞而不多倍体的效果胚胎适合端粒长度的评估。

该协议使用2％PFA固色剂的正常工作端粒鱼。尽管戊二醛被报告给导致较低的背景信号，并在RNA原位杂交更难固定，戊二.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
PNA 探针	PANAGENE	定制顺序
抗地高辛-荧光素，Fab 片段	罗氏	11207741910	使用 1：200 稀释在 PBST
中 地高辛-dUTP	罗氏	11573152910
牛血清白蛋白	SIGMA-ALDRICH	A-7906
多聚甲醛	SIGMA-ALDRICH	P-6148	通过在 DW 中加热和几滴 NaOH 制备 4% 多聚甲醛。加入 0.1 体积的 10x PBS。
Vectashield	Vector Laboratories	H-1200
杂交溶液			3x SSC，50% 甲酰胺，10% （w/v） 硫酸葡聚糖，50 μg/ml 肝素，100 μg/ml 酵母 tRNA，100 μg/ml 超声处理的鲑鱼精子 DNA
杂交洗涤液			2x SSC，50% 甲酰胺
甲酰胺	BIONEER	C-9012	有毒
甲醇	Carlo Erba
丙酮	Carlo Erba
肝素	SIGMA-ALDRICH	H3393	制备 10 mg/ml 储备溶液
硫酸葡聚糖	SIGMA-ALDRICH	67578
10x PBS			对于 1 L DW：80 g NaCl、2.0 g KCl、27 g Na2HPO4•7H2O，2.4 g KH2PO
PBST			1x PBS，0.1% 吐温-20
聚山梨醇酯 20	SIGMA-ALDRICH	P-2287	商业名称是吐温-20
聚-L-赖氨酸溶液（0.1% w/v）	SIGMA-ALDRICH	P-8920	使用前准备新鲜的 0.01% w/v 溶液
M9			3 g KH2PO4、6 g Na2HPO4、5 g NaCl、1 ml 1 M MgSO4、H2O 至 1 L
漂白溶液			20% 次氯酸钠， 0.5 M KOH
抗体缓冲液			1x PBST、1 mM EDTA、0.1% BSA、0.05% 叠氮化钠（有毒）
封闭液			含 5% 牛血清白蛋白 （BSA） 的抗体缓冲液
illustra Microspin G-50	GE 医疗保健	27-53310-01
20x SSC			制备 1 L、175.3 g NaCl、88.2 g 柠檬酸钠、H2O 至 1 L， 将 pH 值调节至 7.0
2x SSCT			2x SSC、0.1% 吐温-20
10x 地高辛-dUTP 混合物			1 mM dATP、1 mM dGTP、1 mM dCTP、0.65 mM dTTP、0.35 mM DIG-11-dUTP
PCR 纯化柱	Cosmo genetech	CMR0112
玻璃清洁剂/ULTRA CLEAN	Dukssan 纯化学品	8AV721
多孔载玻片	MP 生物医学
线虫生长培养基			制备 1 L、3 g NaCl、17 g 琼脂、2.5 g 蛋白胨、H2O 至 974 ml。高压灭菌并冷却培养瓶。加入 1 ml 1 M CaCl2、1 ml 4 mg/ml 胆固醇乙醇溶液、1 ml 1 M MgSO4、25 ml 1 M KPO4。
左旋咪唑	SIGMA-ALDRICH	196142
剃刀	羽	毛刀片 11
Rnase A	、酶组学
、SIGMA-ALDRICH	A7906
共聚焦显微镜		LSM 510	EC Plan-Neofluar 100X 用作物镜。
潮湿室			塑料盒，里面装满了浸泡在 DW 图像分析软件中的纸巾
	Peter Landsdorp 博士	TFL-telo	http://www.flintbox.com/public/project/502