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方法文章

用于木质纤维素生物转化乙醇的耐受性戊糖发酵酵母的进化技术

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DOI：

10.3791/54227

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2016年10月24日

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Bioenergy Research Unit, National Center for Agricultural Utilization Research, 2Mycotoxin Prevention and Applied Microbiology Research Unit, National Center for Agricultural Utilization Research, 3Chemical Engineering and Material Science, Great Lakes Bioenergy Center, Michigan State University

本文内容

摘要

描述并演示了适应性进化和分离技术，以获得能够快速消耗酶解未经脱毒的水解物中混合的己糖和戊糖，并积累超过40 g/L乙醇的Scheffersomyces stipitis菌株NRRL Y-7124的衍生菌株。

摘要

木质纤维素生物质是一种丰富且可再生的原料，可用于生产燃料级乙醇及其他生物产品。预处理和酶解糖化过程可释放出可被酵母发酵的糖类。传统的工业酵母无法发酵木糖（可占植物糖类含量的40%），并且不能在浓缩水解物中正常发挥作用。虽然浓缩水解物对于实现经济可行的乙醇回收至关重要，但其中含有大量在预处理过程中产生的有毒副产物。尽管脱毒方法可使水解物变得可发酵，但这些方法成本高昂，并会产生废物处理负担。本文介绍并演示了利用适应性进化与分离技术，获得源自天然 Scheffersomyces stipitis 菌株 NRRL Y-7124 的衍生菌株，这些菌株能够在不利培养条件下高效地将水解物转化为经济可回收的乙醇。通过利用 S. stipitis 种群的天然遗传多样性以及暴露于两种不同水解物、乙醇或紫外辐射所诱导的突变，结合多种选择压力，在进化种群中富集性能更优的个体。最终的进化培养物通过稀释涂布法分离出优势菌株；而在进化过程的不同阶段以甘油冷冻保存的中间种群，则在选择性培养基上利用适当的压力梯度进行富集，再通过稀释涂布法回收最具潜力的菌株。菌株在多种类型的水解物上进行筛选，并采用一种新颖的方法进行排序，该方法基于对木糖摄取速率和乙醇产率数据进行无量纲相对性能指数（RPI）转换。利用RPI统计参数，计算出综合相对性能平均值，以根据多个因素（包括培养条件（营养和抑制物水平不同）以及动力学特征）对菌株进行排序。通过应用这些技术，亲本菌株的衍生菌株在pH为5–6的酶解糖化水解物中表现出以下改进特性：生长前的初始滞后期缩短，葡萄糖-木糖转换期间的双相生长滞后期减少，发酵速率显著提高，乙醇耐受性增强，并可积累至40 g/L。

引言

据估计，每年约有13亿吨干重的木质纤维素生物质可用于支持乙醇生产，使美国减少30%的石油消耗。1 尽管植物生物质水解可产生富含葡萄糖和木糖的糖混合物，但为降解半纤维素并暴露纤维素以供酶解而进行的化学预处理过程会生成发酵抑制物。乙酸、糠醛和羟甲基糠醛（HMF）被认为是预处理过程中产生的多种抑制物中的关键成分。为了推动木质纤维素乙醇产业的发展，亟需开展相关研究并建立相应方法，以促进酵母菌株的进化，使其能够在抑制物存在条件下存活，并高效利用己糖和戊糖。传统工业酵母菌株（如Saccharomyces cerevisiae）的一个显著缺陷是无法有效发酵植物生物质水解物中丰富的木糖。

Pichia stipitis 标准菌株 NRRL Y-7124（CBS 5773），最近被重新命名为 Scheffersomyces stipitis，是一种天然的戊糖发酵酵母，以能够将木糖发酵为乙醇而广为人知。2,3 本研究选择 NRRL Y-7124 菌株进行进化，是因为已有文献报道该菌株在所有天然酵母菌株中最具潜力积累经济可回收水平的乙醇（超过 40 g/L），且副产物木糖醇极少。4,5,6 在最优培养基中，S. stipitis 菌株 NRRL Y-7124 在高细胞密度培养（6 g/L 细胞）条件下，40 小时内可产生 70 g/L 的乙醇（速率为 1.75 g/L/hr），产率为 0.41 ± 0.06 g/g。7,8 该菌株对发酵抑制物乙醇、糠醛和 HMF 的耐受性也已有报道，9 并且 S. stipitis 被认为是目前可用于木质纤维素原料规模化生产乙醇的最有前景的天然戊糖发酵酵母之一。10 本研究的目标是利用多种未经脱毒处理的木质纤维素水解物并施加乙醇选择压力，推动菌株向更稳健的 NRRL Y-7124 衍生菌株进化，以适用于工业应用。期望获得的关键改良特性包括：在高浓度水解物中更快的糖摄取速率、减少双相生长以实现更高效的混合糖利用，以及对乙醇和抑制物更高的耐受性。本研究特别关注将 S. stipitis 应用于未经脱毒的水解物，旨在消除与水解物脱毒工艺（如过碱化处理）相关的额外运行成本。

两种具有工业应用前景的水解产物被用于驱动进化：酶解氨纤维膨胀预处理玉米秸秆水解物（AFEX CSH）和稀酸预处理柳枝稷水解液（PSGHL）。11,12 AFEX预处理技术正在发展以最小化发酵抑制物的生成，而稀酸预处理则代表了目前成本最低且最常用的处理技术，用于暴露纤维素生物质以便进行酶解糖化。PSGHL可在预处理后与残留的纤维素分离，其特征是富含来自半纤维素水解的木糖，但葡萄糖含量较低。AFEX CSH与PSGHL在多个关键组分上存在差异，这些差异被用于调控进化过程。与PSGHL相比，AFEX CSH中的呋喃醛类和乙酸等抑制物含量较低，但氨基酸和氨态氮源含量较高（表1）。PSGHL的另一个挑战在于其主要可利用糖为木糖。因此，PSGHL适用于特异性富集能够改善木糖利用能力的菌株，而木糖利用能力不足正是限制现有酵母商业化应用的薄弱环节。即使在天然能够发酵戊糖的酵母中，依赖非最优糖类——木糖——来支持细胞生长与修复的过程，在水解产物环境中会因多种因素而变得更加困难：营养缺乏、抑制物广泛破坏细胞结构完整性，以及由于氧化还原失衡导致的代谢紊乱。9 氮源补充，特别是以氨基酸形式添加，可能显著增加发酵过程的操作成本。本研究利用柳枝稷水解液探讨了氮源补充对分离菌株筛选与排序的影响。

通过利用 S. stipitis 群体的天然遗传多样性以及暴露于两种不同水解物、乙醇或紫外辐射所诱导的突变，结合多种选择压力，在进化种群中富集了性能改善的个体。这些选择压力被平行或串联施加，以探究 S. stipitis 向能够在水解物中高效生长和发酵的理想衍生物进化的进程（图1）。通过在微孔板中对功能种群进行连续传代培养，并逐步提高水解物的严苛程度，实现了这一进化过程；所用水解物为12%葡聚糖含量的AFEX CSH或20%固含量制备的PGSHL，采用梯度稀释方式处理。在连续培养条件下，进一步施加以木糖为碳源并含乙醇胁迫的生长选择，从而富集那些在木糖利用方面对乙醇抑制作用不敏感的表型，进而提升已适应AFEX CSH的种群性能。最近研究显示，在葡萄糖发酵后，菌株NRRL Y-7124的戊糖利用能力会受到此类抑制作用的影响。8 随后探索了在PSGHL上的富集，以拓展菌株对不同类型水解物的功能适应性。

通过在胁迫条件下进行靶向富集，并结合稀释涂布法从最优势的菌群中挑选菌落，从 S. stipitis NRRL Y-7124 进化过程的各个阶段分离出潜在的改良衍生菌株。采用无量纲的相对性能指数（RPI）对菌株进行综合性能排序，其中在不同类型的水解液及添加的营养补充物条件下评估其动力学行为。尽管此前已有文献报道多种适应性驯化方法成功提升了 S. stipitis 在木质纤维素水解液中的功能表现，但尚未有菌株被报道可在未经解毒处理的水解液中实现具有经济可行性的乙醇生产。13-17 通过本文将更详细展示的进化方法，Slininger 等18 获得了相较于亲本菌株 NRRL Y-7124 显著改良的菌株，能够在适当补充氮源的AFEX CSH和酶解柳枝稷水解液（SGH）中产生 >40 g/L 的乙醇。这些新型菌株对未来木质纤维素制乙醇产业的发展以及基于已测序菌株 NRRL Y-11545 的进一步基因组学研究具有重要意义。19 对 图1 所示进化各阶段产生的优势菌株进行基因组学研究，将阐明在菌株发育过程中发生的遗传变异历史，为后续的菌株改良研究奠定基础。

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方案

1. 准备测定所需的起始材料和设备

  1. 在预处理反应中使用18%至20%的初始生物质干重制备水解物，用于进化、分离和排序实验。有关制备用于进化、分离或排序实验的AFEX CSH、PSGHL和添加氮补充剂N1或N2的SGH的详细方法，请参见Slininger et al. 201518。各种水解物类型的组成见表1。
    注意：SGH的氮强化形式定义如下：SGH-N1 = 以尿素、无维生素的酪蛋白氨基酸、D,L-色氨酸、L-半胱氨酸以及特定来源的维生素强化至摩尔碳氮比（C:N）为42:1的SGH（其中约15%的摩尔氮为伯氨基氮（PAN），约85%的氮来自尿ine）；SGH-N2 = 以尿素和豆粕作为最低成本的商品化氨基酸与维生素来源，强化至C:N为37:1的SGH，提供约12%的PAN氮和88%的尿素氮。
  2. 从美国农业研究服务局菌种保藏中心（ARS Culture Collection，美国伊利诺伊州皮奥里亚农业利用研究中心）获取亲本菌株Scheffersomyces stipitis NRRL Y-7124（CBS 5773）的冻干培养物，并按说明制备甘油保存菌种。将亲本酵母及其衍生菌株的保存菌种以10%甘油溶液形式保存于-80 °C。
    1. 将甘油保存菌种划线接种至酵母麦芽蛋白胨葡萄糖（YM）琼脂平板（3 g/L酵母提取物，3 g/L麦芽提取物，5 g/L蛋白胨，10 g/L葡萄糖，20 g/L琼脂），于25 °C培养48–72小时8。培养完成的平板可在4 °C保存最多一周，用于后续液体预培养接种。
  3. 制备最优定义培养基（ODM），该合成培养基与工业配制工艺兼容20，此前已为亲本菌株Scheffersomyces (Pichia) stipitis NRRL Y-7124高效转化木糖为乙醇而开发7。在所有预培养及发酵性能生物测定实验中，以及乙醇胁迫、木糖供给的连续培养进化实验中，均使用该定义培养基。ODM的组成列于表2以供参考。
  4. 如先前所述18，根据需要使用比色皿或微孔板读数分光光度计测定培养物在620 nm处的吸光度（A620），以分析细胞生物量。采用高效液相色谱法（HPLC）或高通量的机器人酶法测定培养样品中的糖类、乙醇、糠醛、5-羟甲基糠醛（HMF）和乙酸。

2. 在 AFEX CSH 上连续传代期间富集强健的衍生菌株

  1. 接种菌株 NRRL Y-7124 的预培养物。将 YM 琼脂上的细胞转移至含有 150 g/L 木糖的 75 ml ODM 培养基中，以维持其在渗透压胁迫条件下生长的能力。将预培养物置于 125 ml 三角瓶中，瓶口用硅胶海绵塞封闭，在 25 °C、150 rpm（1" 轨道）条件下振荡培养 24 小时。
  2. 用冷水解冻 6–12% 葡聚糖含量的 AFEX CSH 冻存样品以供使用。如需要，调节 pH 至 5，并在 96 孔微孔板中进行系列稀释前进行过滤除菌。
  3. 在微孔板中每孔加入 50 µl 溶液，每种水解物稀释液设 8 个孔，然后每孔接种少量预培养物（几微升），使初始吸光度（620 nm）A620 ≥ 0.1。将微孔板置于塑料盒中，盒内放置湿润的纸巾以维持湿度，在 25 °C 静置培养 24–48 小时。
  4. 选择在显微镜下可见生长且 A620 > 1 的最高浓度水解物稀释液，从中转移 1–5 µl 至新的水解物系列稀释孔中，使初始 A620 ≥ 0.1。
  5. 使用分光光度计监测微孔板中培养物的 A620 值。未接种的稀释系列作为对照和空白。监测过程中保持微孔板盖在位，以防污染，并相应调整读数。
  6. 定期制备适应性培养物的甘油冻存液，用于后续优良菌株的分离或用于继续接种水解物稀释系列。制备冻存液时，合并已定植的最高水解物浓度下的四个孔（共 200 µl）的培养物，与等体积 20% 无菌甘油混合，分装至冻存管中，使终浓度为 10% 甘油，于 -80 °C 冻存。
  7. 重复步骤 2.3–2.6，直至在接种后 24 小时内可稳定观察到菌株在 12% 葡聚糖 AFEX CSH 中的生长。

3. 在 AFEX CSH 上富集后分离单细胞耐受衍生物

  1. 将适应性培养物的甘油菌种划线接种至YM琼脂平板，并用划线菌落接种3个微孔板孔中的50 µl 3%或6%葡聚糖AFEX CSH（pH 5）培养基（初始A620 ~0.1）。按照步骤2.3的条件孵育微孔板24小时。选取在最高水解物浓度下生长良好的重复孔中的菌液进行混合，然后进行梯度稀释并涂布于YM琼脂或6%葡聚糖AFEX CSH琼脂平板。后者配制方法为：将过滤除菌的12%葡聚糖AFEX CSH与温热的已灭菌30 g/L琼脂溶液按1:1比例混合。
  2. 从25 °C孵育24–48小时后显示生长的最高稀释度平板上挑取5个单菌落，制备为甘油冷冻保藏菌种。将每个菌落划线接种至YM平板，孵育24小时。用无菌接种环取生长良好的菌苔，转移至少量10%甘油溶液中，混匀使细胞悬浮，分装至2–3个冻存管，于-80 °C冻存。

4. 评估 AFEX CSH 耐受性衍生菌株相较于亲本菌株的性能

  1. 在简单6%葡聚糖AFEX CSH批次培养物中测试分离株。
    1. 将来自甘油菌种保存管划线接种后培养48小时的平板上的细胞转移至pH 7的磷酸钾缓冲液（0.4 mM）中，制备细胞悬液，使其A620 10. 取每种悬液各1 µl，分别接种到4个含有50 µl 3%葡聚糖水解物的孔中，使初始A620 = 0.2。将微孔板按步骤2.3所述孵育24小时。通过将12%葡聚糖AFEX CSH与无菌水按1:3比例稀释，制备pH 5的3%葡聚糖AFEX CSH。
    2. 将两个24小时的微孔板孔中的培养物转移，用于接种25 ml的50%全浓度pH 5、含12%葡聚糖的AFEX CSH预培养液。将预培养液置于50 ml锥形瓶中，使用硅胶海绵密封，在25 °C、约150 rpm条件下振荡培养24小时" 轨道）。通过将水解物与无菌水按1:1比例稀释，制备半强度12%葡聚糖AFEX浓缩悬浮液（CSH）。
    3. 使用半浓度水解物预培养物接种至类似的25 ml生长培养基中，初始A620 = 0.1。将生长培养物按上述方法（4.1.2）培养，并每日取样（0.2 ml）。监测生物量积累（A620) 以及糖类和发酵产物的浓度（HPLC）。
  2. 或者，重新接种（即，收获并重复利用在6%葡聚糖AFEX CSH培养基中培养的酵母，用于8%葡聚糖水解物分批发酵培养的测试，方法如前所述。18
  3. 或者，按照之前所述方法，通过添加12%葡聚糖水解物，进一步测试复接种的6%葡聚糖AFEX玉米秸秆水解培养物的种群。18
  4. 在含混合糖的ODM分批培养物中检测分离株的二次生长延迟现象。
    1. 在125 ml带硅胶海绵封口的三角瓶中，用接种环从YM甘油斜面转移菌种，接种含150 g/L木糖的75 ml ODM预培养液。按步骤2.1条件培养24小时。
    2. 使用预培养物接种含有75 g/L葡萄糖和75 g/L木糖、pH为6.5的ODM培养基中的类似75 ml测试培养物。在25 °C、150 rpm条件下振荡培养。每日取样。
    3. 或者，采用类似方案测试0-15 g/L乙酸对葡萄糖和木糖共发酵过程中双相生长（diauxy）的影响，但试验培养物的初始pH设定为6.0 ± 0.2，以在乙酸消耗期间维持pH在6-7范围内，具体操作如前所述。18

5. 应用连续培养筛选耐受乙醇的木糖利用菌株

  1. 使用含 60–100 g/L 木糖、20–50 g/L 乙醇、pH 为 6.3 ± 0.2 的 ODM 作为连续培养的补料培养基。选择木糖和乙醇的不同组合，以模拟 150 g/L 木糖部分发酵的情况（假设乙醇潜在产率为 ~0.5 g/g 木糖），并适应可能出现 50–70 g/L 乙醇的条件。8
  2. 为制备连续培养的接种物，用接种环从培养 48 小时的 YM 平板上挑取一个具有代表性的耐 AFEX CSH 的菌落（例如，类似于 图 1 中的菌落 5），转移至装有 75 ml 无乙醇 ODM（本例中含 100 g/L 木糖）的 125 ml 三角瓶中。在 25 °C、150 rpm（1" 轨道）条件下培养 24 小时。选择与初始连续培养持留体积中木糖浓度相匹配的预培养 ODM 木糖浓度。
  3. 将耐 AFEX CSH 的分离株（例如，类似于菌落 5，图 1）的预培养浓缩液约 5–10 ml 接种至 pH 为 6.3 ± 0.2、含 100 g/L 木糖和 20 g/L 乙醇的 ODM 持留体积中，使初始体积为 100 ml，A620 约为 0.5。将培养物体积（VR）维持在 100 ml，在带夹套的 100 ml 搅拌烧瓶中于 25 °C 培养，搅拌速度为 200 rpm，并配备可灭菌的 pH 电极、pH 控制器和温度控制的循环水浴装置。
  4. 由于乙醇的存在会抑制细胞生长，初始阶段生长较慢，因此设置补料培养基通过 pH 触发泵进行补料。当培养物发酵导致 pH 下降至 5.4 时，启动泵向培养体系补充 pH 6.3、含 100 g/L 木糖和 50 g/L 乙醇的 ODM，以阻止 pH 进一步下降。通过持续从培养液表面移除流出液的排液泵维持培养体积为 100 ml。因此，随着代谢和补料的持续进行，乙醇浓度逐渐升高。
  5. 每 48–72 小时收集流出液并从连续培养物中取样（1–2 ml），用于分析活细胞浓度、产物和底物，方法如前所述。18 为测定活细胞浓度，将样品在缓冲液中（见 4.1.1）进行连续 10 倍系列稀释，并将稀释液涂布于 YM 琼脂平板（见 1.2.1）。根据流出液收集速率（Q），计算稀释率（D）（Q/VR）；以 S. stipitis 为例，其稀释率范围为 0 至 0.01 hr-1。
  6. 定期保存甘油菌种：从缓冲液稀释样品的活菌平板上挑取形成 30–100 个菌落的菌株，代表当前富集过程中最优势且生长良好的菌群。向平板中加入约 5 ml 10% 甘油，制备两份冷冻管。如需维持或暂停连续培养，可停止培养，并在需要时使用最新获得的（抗性最强的）甘油菌种重新启动培养。
  7. 重启时，将抗性最强菌群的甘油菌种划线接种至 YM 琼脂平板，用接种环挑取培养 24–48 小时的菌体，转移至无乙醇 ODM 预培养液中，按上述条件进行培养。使用预培养酵母的浓缩液接种 100 ml ODM 持留体积，使初始 A620 达到 0.5，并在重新启动补料前，使培养物以分批方式生长至稳定期。
  8. 若培养物在含 >25 g/L 乙醇的条件下，能够在木糖上以 >0.01 hr-1 的速率稳定生长，则以较低稀释率（约 0.01 hr-1）开始向 100 ml 持留体积（初始为含 60 g/L 木糖和 20 g/L 乙醇的 ODM）补加培养基（ODM + 60 g/L 木糖 + 30–50 g/L 乙醇）。随着时间推移，逐步提高补料中乙醇浓度至 50 g/L。将进化程度更高的菌群保存至甘油菌种中。
    注：维持较低稀释率有助于形成足够高的细胞浓度，从而降低氧可用性，促进发酵进行。
  9. 可选：每月对用于重新接种连续培养的甘油菌种群体进行紫外线（UV）照射处理。
    1. 将甘油菌种划线后长出的菌落重悬于 10 ml 含 60 g/L 木糖的 ODM 中（同预培养条件），并将所有菌种合并至一个无菌三角瓶中。将混合后的细胞悬液调整至约 5 × 108 活细胞/ml，取 6 ml/皿均匀覆盖 4–5 个培养皿底部。为使标准一次性培养皿底部完全覆盖 6 ml 液体，需先加入 15 ml 以克服表面张力，再吸出 9 ml。
    2. 在生物安全柜内，将打开的培养皿暴露于紫外光源下。调节 UV 照射时间或距离，以达到所需杀灭率 >90%。本例中，在距光源约 56 cm 处照射 45 分钟。
    3. 照射前后分别对细胞悬液进行稀释涂布，根据菌落形成单位估算杀灭率。以 S. stipitis 为例，杀灭率约为 97%。
    4. 将经 UV 处理的培养物（24–30 ml）转移至用铝箔包裹的 50 ml 三角瓶中，在 25 °C、150 rpm 条件下培养 24 小时，使少量存活细胞重新增殖至约 1 × 108 活 S. stipitis 细胞/ml。铝箔覆盖可防止光复活，从而在培养过程中保留诱导的突变。
    5. 使用重新增殖的诱变后培养物接种连续培养体系，使活细胞浓度达到约 1 × 107 个/ml。重新启动含乙醇的 ODM + 60 g/L 木糖培养基补料，继续筛选过程。

6. 评估甘油菌种群体并鉴定在乙醇存在条件下木糖发酵能力提高的菌株

  1. 将筛选出的甘油菌种划线接种至YM琼脂平板，作为筛选在乙醇存在条件下木糖最佳生长和发酵能力的第一步。
  2. 将每个待筛选的进化菌群从琼脂划线培养物转移至含150 g/L葡萄糖的75 ml ODM培养基中进行预培养，并在125 ml三角瓶中培养96小时，作为测试培养物的接种物。这些在葡萄糖中大量生长的菌群需要诱导产生利用木糖的酶。
    1. 为检测诱导效果，收获各培养物，将细胞重悬于30 ml ODM培养基中，初始A620调至40，培养基于含60 g/L木糖和30–45 g/L乙醇的ODM，于25 °C、150 rpm（1"轨道）条件下，在50 ml三角瓶中使用硅胶海绵封口培养。每天取样两次，通过HPLC分析监测木糖消耗情况。
  3. 或者，如Slininger et al.18所述，为评估在乙醇存在下利用木糖的生长能力，可通过环状接种将每个进化菌群接种至125 ml三角瓶中含150 g/L木糖的75 ml ODM培养基中进行预培养，并在25 °C、150 rpm（1"轨道）条件下培养96小时。将测试培养物以较低初始A620值0.1接种于125 ml三角瓶中含25 ml ODM、60 g/L木糖和30–45 g/L乙醇的培养基中。将三角瓶置于25 °C、300 rpm、1"轨道条件下培养并取样。

7. 在乙醇存在下，从PSGHL中分离利用木糖的单细胞克隆

  1. 根据步骤6的结果，选择在乙醇存在条件下对木糖具有较强生长和发酵能力的甘油菌种群体。用这些菌种划线接种平板。通过划线平板制备高密度缓冲细胞悬液，使其A620 = 5。  然后用该细胞悬液接种96深孔板中的预培养物，使初始A620 = 0.5。在1 ml预培养物中使用PSGHL与ODM + 50 g/L木糖按1:1混合的培养基（不含乙醇）。将预培养物置于带通气低蒸发盖的96深孔板中，在25 °C、400 rpm、1" 摇径条件下培养48小时。不同甘油菌种群体之间用空孔隔开。
  2. 利用每个预培养物，分别接种十六个1 ml的重复培养物，初始A620 ~0.5，培养基于PSGHL与ODM + 50 g/L木糖按1:1混合，并分别添加20、30或40 g/L乙醇，以富集耐受性菌株。富集培养物的培养条件与预培养物相同。
  3. 针对每个不同的甘油菌种，收集能够支持生长并利用木糖的最高乙醇浓度下的培养孔。将每种细胞系涂布于YM琼脂平板，获得优势单菌落，并保存于甘油中。每种细胞系挑选十个菌落，分别划线接种至YM琼脂平板，用于制备甘油菌种。

8. 在PSGHL上通过连续传代进一步富集强健的进化菌株，方法与AFEX CSH相同

  1. 准备NRRL Y-7124（亲本）、AFEX CSH耐受性进化分离株以及在乙醇存在下利用木糖能力增强的连续培养进化群体的预培养物。如上文步骤2.1所述，用接种环从甘油保存管中取菌接种至75 ml ODM + 150 g/L木糖培养基中，用于AFEX CSH水解液适应过程。
  2. 用水稀释PSGHL，配制一系列浓度递增的溶液。为三种细胞系分别准备96孔微孔板，将每种PSGHL稀释液加入8个孔中，每孔50 µl。用预培养物接种每种稀释度的50 µl微培养体系，使初始A620达到约0.1–0.5。
    1. 采用与上述AFEX CSH水解液适应相同的方法（步骤2），在PSGHL浓度逐步提高的条件下继续酵母的进化，直至培养物能够在全浓度水解液中稳定生长，且在连续传代四个月后，ΔA620/Δtime的14天平均比值保持稳定。

9. 使用 PSGHL 梯度（含或不含乙醇处理）分离单细胞克隆

  1. 通过将YM琼脂进行稀释涂布，直接从全浓度PSGHL最终适应平板中获得单细胞分离物。针对每种细胞系挑选十个较大的菌落，并划线接种至YM平板，以制备甘油保存菌种，方法如前所述（步骤3.2）。
  2. 可选地，通过从三种细胞系的保存甘油菌种中分离，探索进化过程中的较早时间点。
    1. 用接种环从甘油保存菌种的划线培养物中接种预培养物，于含50 g/L木糖的30 ml ODM培养基中（50 ml摇瓶，25 °C，150 rpm）培养24小时。
    2. 将预培养物中的细胞接种至微孔板孔中，每孔加入50 µl 50% PSGHL，初始A620约为0.2，静置培养48小时，以进行水解液生长挑战实验。
    3. 将每种富集培养物0.1 ml涂布于PSGHL梯度琼脂平板上，梯度范围为0至50%浓度的水解液（每板接种约300–400个可存活细胞），并从梯度中水解液浓度最高的区域中每种细胞系挑选10个单菌落21。将挑取的菌落划线接种至YM培养基，用于制备甘油保存菌种，方法同步骤3.2。
    4. 作为步骤9.2.3的替代方法，不接种梯度琼脂平板，而是将细胞接种至96孔微孔板的孔中，初始A620约为0.2，微孔板中各孔设计为含有50%至100%浓度的水解液以及10至40 g/L的乙醇。在此情况下，将微孔板培养72–96小时，其余操作同步骤2.3。通过稀释涂布法，从表现出生长的最严苛水解液-乙醇组合孔中分离十个单菌落，并按步骤3.2制备甘油保存菌种。

10. 在初筛中，通过比较和排序菌株在两种营养条件下于PSGHL培养基上的表现来剔除表现较差的分离株

  1. 采用高通量深孔板筛选PSGHL性能，对五组各三十个分离株进行筛选，同时以NRRL Y-7124亲本株和AFEX CSH耐受分离株（类似于图1进化示例中的Colony 5）作为对照，从每组中选出表现最佳的六个菌株（前20%）进入次级筛选阶段（步骤12）。
  2. 在深孔板中进行筛选，每孔加入1 ml培养液，并用带有黑色硅胶低蒸发密封圈的不锈钢盖密封。将所有深孔板固定在摇床/培养箱的托板上，在25 °C、400 rpm（1" 摇床振幅）条件下培养。设计深孔板加样模式时，应确保不同分离株之间通过空孔隔开。
  3. 开始培养时，从上述步骤（步骤3、7和9）获得的30个分离株的甘油划线平板上挑取单个菌落，接种至含ODM + 50 g/L木糖的双孔中，培养48小时。
  4. 以50% PSGHL作为预培养挑战培养基，将PSGHL与ODM + 10 g/L葡萄糖 + 50 g/L木糖按1:1体积比混合制备。为筛选30个分离株及两个对照菌株，准备两块深孔板，每块板为16个分离株各设两个孔，不同分离株之间保留空孔以避免交叉污染。
  5. 进行挑战培养时，将ODM预培养物（A620 ~10）各取50 µl转移至每个分离株及对照株的两个50% PSGHL挑战培养孔中，使初始A620 ~0.5，随后培养72小时。
  6. 使用两种营养丰富度不同的测试培养基对分离株进行筛选：60% PSGHL + ODM营养成分；以及75% PSGHL + ODM + YM营养成分。ODM营养成分（不含糖类）按标准ODM培养基（含50 g/L糖）的一半浓度添加。如指定，YM营养成分（不含糖类）也按标准浓度的一半添加，即1.5 g/L酵母提取物、1.5 g/L麦芽提取物、2.5 g/L蛋白胨。
  7. 将72小时的50% PSGHL挑战预培养物各取50 µl，分别接种至两种测试培养基的五个深孔中，每孔总体积为1,000 µl，初始A620 ~0.5，用于测试培养。
  8. 每天对每个分离株取样。用移液器将孔内培养物转移至微量离心管中，离心（5,533 × g，15分钟），收集上清液用于乙醇、葡萄糖和木糖的高通量分析。使用分光光度计在96孔微孔板中测定生物量（每孔200 µl），以A620值表示。
  9. 在每组测试的30个分离株中（共五组，对应S. stipitis NRRL Y-7124进化菌株），按如下步骤11所述计算相对性能指数（RPI），并据此在两种测试培养基上根据乙醇产率（每单位初始糖所积累的最大乙醇量）和木糖消耗速率（96小时内每单位初始木糖浓度的消耗量）对各菌株进行排序。

11. 使用相对性能指数（RPI）对初级PSGHL筛选中的分离株进行排序

  1. 在初步筛选后，计算无量纲的相对性能指数（RPI），以对每个实验中在含有两种不同营养配方的PSGHL培养基上进行筛选的30个分离株按性能排序，共五个不同实验。 即， 60% PSGHL 和 75% PSGHL
  2. 计算用于对特定实验中一组分离株内各分离株性能进行排序的统计参数 F：F = (X - X平均值)/s。其中，X 表示针对每个单个分离株观测到的性能参数，例如产量（Y）或速率（R），而 X平均值 和 s 分别表示在给定实验中所有分离株观测到的 X 的平均值和标准差。对于正态分布，-2 < F < 2.
  3. 针对实验中的每个分离株，根据速率计算相对性能指数（RPI）R = (2+FR) × 100/4，并以产量为基础类似地计算相对性能指数（RPI）Y = (2+FY) × 100/4。RPI 的取值范围约为 0 至 100 百分位数（从最低到最高）。随后按以下方法计算在特定水解物实验中每个分离株的 RPI 平均值：RPI平均值 = (RPIY +RPIR)/2，其中在本应用中，产率和速率的贡献被赋予相等的权重。
    请注意，如果认为产率和速率参数的重要性不相等，可对其进行加权处理。
  4. 计算 RPI总体 在所测试的 n 种水解物中：RPI总体 = Σi=1,n[(RPIY +RPIR)/2]i/ n. 考虑包含30个分离株和2个对照的实验组中的每一个分离株。在对约150个适应木糖富集PSGHL的单菌落分离株进行初步排序时，RPI总体 在筛选中应用的两种PSGHL配方的反应速率和产率进行计算， 即， 60% PSGHL 和 75% PSGHL，其中 n = 2。
  5. 根据 RPI总体 在每次实验中，选择表现最佳的一定百分比的分离株进入次级筛选。在此示例中，选择表现最优的20%菌株进入下一轮筛选（即， 150 个测试样本中的 30 个。

12. 在二次筛选中，通过多种完全水解物（>100 g/L 混合糖）比较初筛表现最优的菌株，以确定功能最强的稳健菌株

  1. 在6%葡聚糖AFEX CSH以及两种氮水平（SGH-N1和SGH-N2，成分见表1）条件下，比较PSGHL表现最优的菌株，以进行最终排名。筛选在PSGHL初筛深孔板实验（步骤10和11）中表现最佳的30个分离株，以及两个对照菌株（亲本菌株NRRL Y-7124和AFEX CSH耐受性分离株（类似于Colony 5，图1示例））。
  2. 从甘油斜面挑取细胞接种至含1 ml ODM + 50 g/L木糖的深孔板中，进行平行培养，按前述方法在深孔板系统中培养48小时（步骤10.2）。随后将50 µl ODM预培养物转移至50% SGH挑战培养基中，在深孔板系统中继续培养72小时，使A620 达到约10。通过将SGH与无糖ODM + 50 g/L木糖（pH 5.6）按1:1混合制备50% SGH培养基。
  3. 对于每个分离株，取三孔挑战培养物的细胞沉淀（15分钟，2,711 × g离心）接种至16 ml SGH-N1或SGH-N2培养基中，使初始测试培养物的A620约为2.0。将测试培养物置于25 ml锥形瓶中，使用硅胶海绵封口，在25 °C、180 rpm（1"轨道）条件下培养。每日取样，并按PSGHL筛选方法进行分析。
  4. 类似地，按照步骤12.2和12.3进行分离株筛选，但此次使用pH 5.2的6%葡聚糖AFEX CSH替代SGH-N1和SGH-N2，用于制备挑战培养基和测试培养基。对于50%浓度的挑战培养基，将6% AFEX CSH与水按1:1稀释即可，因其本身氮源充足，无需额外添加。
  5. 重复步骤12.1–12.4以验证实验结果。

13. 使用 RPIoverall 对二次筛选中分离株在多种完全水解物利用上的表现进行排序

  1. 计算相对性能指数（RPI），以对初筛中表现最佳的前20%菌株（约150株中的30株）在次级筛选中测试的不同营养丰富度的酶解糖化水解物配方上的表现进行排序。
  2. 根据在三种酶解糖化预处理水解物配方上以双重复进行的木糖摄取速率和乙醇产率，对次级筛选中测试的每株菌株进行评分，包括AFEX CSH（i = 1 和 2）、SGH-N1（i = 3  和 4）以及SGH-N2（i = 5 和 6）。
  3. 计算每株菌株的RPIoverall，并应用该排序参数进一步筛选出性能优异的菌株：RPIoverall = Σi=1,n[(RPIY + RPIR)/2]i/n，其中n = 6。
    注：通过参照Slininger et al.18中的方法，在锥形瓶培养中验证优异菌株在SGH-N2水解物中的动力学表现。

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结果

S. stipitis 通过三种选择性培养环境的组合进行进化，这些培养环境包括 AFEX CSH、PSGHL 以及乙醇胁迫下的木糖连续培养。 图 1 展示了所进行的进化实验的示意图，以及筛选出的在所有测试水解物中总体表现最优或在某一种水解物上表现最佳的菌株。 表 3 列出了这些优良菌株的 NRRL 登录编号，并总结了在获得各菌株所来源的富集群体过程中施加的适应性胁迫条件。部分菌株在一种或两种水解物上表现出相对更优的性能，但 11 个菌株中有 7 个在所有类型的水解物上均表现良好，尽管其中大多数菌株在进化过程中仅暴露并经受过单一类型水解物的胁迫。本研究所采用的不同进化策略的成功结果体现在 图 2–7 和 表 4 中。

图2展示了在适应性进化的第一阶段后所观察到的显著改进，该阶段通过连续传代将菌株NRR...

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讨论

进化过程的成功依赖于多个关键步骤。首先，选择适当的选择压力至关重要，以驱动种群向实现成功应用所需的理想表型方向进化。S. stipitis 的进化过程中选择了以下选择压力，并在适当的时间施加以引导目标表型的富集：逐步增强的12%葡聚糖AFEX预处理玉米秸秆水解液（CSH），该条件迫使微生物在乙酸及低浓度呋喃醛类和其他抑制物存在下生长并发酵多种糖类；在连续培养中以木糖为碳源并逐步提高乙醇浓度，以促进木糖代谢酶的诱导，从而缩短双相生长滞后期；逐步增强的20%固体含量的PSGHL水解液，该条件迫使微生物在高浓度乙酸、呋喃类及其他抑制物存在下生长并发酵木糖。其次，在富集过程中通过冷冻保存种群样品的甘油菌种，以维持正在进化的酵母种群，这一点非常重要。这些种群的阶段性快照可长期保存，用于定期功能检测以记录进化进展，也可用于后续按需分离菌株，或在中断后重新启动进化过程。进化的第三个关键步骤是通过在便捷的选择性培养基（例如含有胁迫梯度的琼脂平板或微孔板，梯度中包含一系列水解液和/或乙醇浓度）上富集选择培养物或甘油保存的种群，从而分离出表现优异的单菌落。随后可挑选在最严苛条件下仍能生长的存活菌落，并保存以供后续表征。上述三个基本步骤可重...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

我们衷心感谢美国内布拉斯加州林肯市农业研究局牧草、饲料和生物能源研究组的 Kenneth Vogel 博士、Robert Mitchell 博士和 Gautam Sarath 博士为本项目慷慨提供柳枝稷材料。同时，我们感谢美国能源部通过能源部大湖生物能源研究中心（GLBRC）授予 VB 的资助（项目编号：DE-FC02-07ER64494）。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
Cellic Ctec，含有木聚糖酶（内切-1,4-）诺维信无产品编号www.novozymes.com，1-919-494-3000
Cellic Htec，含有纤维素酶和木聚糖酶诺维信无产品编号www.novozymes.com，1-919-494-3000
烘烤大豆粉阿彻丹尼尔斯米德兰公司（ADM）63160ADM，费里斯公园路4666号，迪凯特，伊利诺伊州  1800-37-5843
Pluronic F-68（表面活性剂）Sigma-AldrichP1300Sigma-Aldrich
Difco 维生素测定用酪蛋白氨基酸贝克顿·迪金森公司228830多家供应商： 例如、Fisher Scientific、VWR、Daigger
D,L-色氨酸 Sigma-AldrichT3300多家供应商 例如、Fisher Scientific、VWR、Daigger
L-半胱氨酸 Sigma-AldrichC7352多个供应商： 例如，Fisher Scientific，Sigma-Aldrich
Bacto 琼脂贝克顿·迪金森公司214010多个供应商： 例如、Fisher Scientific、VWR、Daigger
麦芽提取物Becton Dickinson and Company218630多个供应商： 例如、Fisher Scientific、VWR、Daigger
酵母提取物Becton Dickinson and Company212750多家供应商： 例如、Fisher Scientific、VWR、Daigger
大豆蛋白胨 IV 型FlukaP0521-500g多家供应商 例如，Fisher Scientific，VWR，Daigger
腺嘌呤, >99% 粉末Sigma-AldrichA8626CAS 73-24-5。可使用其他品牌。多家供应商： 例如Sigma-Aldrich、Acros Organics、MP Biomedicals LLC
胞嘧啶, >99%Sigma-AldrichC3506CAS 71-30-7。可使用其他品牌。多家供应商： 例如西格玛奥德里奇，Acros Organics，MP Biomedicals LLC
鸟嘌呤，SigmaUltraSigma-AldrichG6779CAS 73-40-5。可使用其他品牌。多家供应商： 例如，Sigma-Aldrich，Acros Organics，MP Biomedicals LLC
胸腺嘧啶，99%Sigma-AldrichT0376CAS 65-71-4。可使用其他品牌。多家供应商： 例如，Sigma-Aldrich，Acros Organics，MP Biomedicals LLC
尿嘧啶，99%Sigma-AldrichU0750CAS 66-22-8。可使用其他品牌。多家供应商： 例如，Sigma-Aldrich，Acros Organics，MP Biomedicals LLC
无水右旋糖（D-葡萄糖），分析纯（符合美国化学会标准）Fisher ChemicalD16-500CAS 50-99-7。可使用其他品牌。多家供应商： 例如Acros Organics、Fisher Scientific、MP Biomedicals、Sigma-Aldrich
D-木糖，检测 >99%Sigma-AldrichX1500CAS 58-86-6。可使用其他品牌。多家供应商： 例如Acros Organics、Fisher Scientific、MP Biomedicals、Sigma-Aldrich
96孔平底板Becton Dickinson Falcon351172多家供应商： 例如赛默飞世尔科技，VWR，戴杰
Wypall L40 擦拭布Kimberly-Clark在微孔板盒中放置毛巾以吸收水分实现加湿；多家供应商 例如赛默飞世尔科技，Uline，戴杰工业
康宁刻度耐热玻璃烧瓶，125 ml，窄口（5号塞）康宁生命科学玻璃4980-125多个供应商： 例如赛默飞世尔，VWR，戴杰
Innova 42R 摇床/培养箱，2.5 cm（1"旋转新不伦瑞克科学公司（1-800-631-5417）M1335-0016多个供应商： 例如，Eppendorf，Thermo-Fisher。其他具有2.5 cm（1") 可使用投掷法。
用于4块深孔MTP板的Duetz盖板夹具Applikon BiotechnologyZ365001700applikon-biotechnology.com（美国），1-650-578-1396
用于96孔深孔板的Duetz系统三明治盖Applikon BiotechnologyZ365001296applikon-biotechnology.com（美国），1-650-578-1396
Duetz系统硅胶密封垫（0.8 mm黑色低蒸发），用于96深孔板盖Applikon BiotechnologyV0W1040027applikon-biotechnology.com（美国），1-650-578-1396
Duetz 系统三明治盖蓝色超细纤维层Applikon BiotechnologyV0W1040001applikon-biotechnology.com（美国），1-650-578-1396
96孔，2 ml方形井锥底板，天然聚丙烯Applikon BiotechnologyZC3DXP0240applikon-biotechnology.com（美国），1-650-578-1396
Bellco 32 mm 硅胶海绵塞盖，每包25个，适用于125 ml 培养瓶Bellco1924-00032Thomas Scientific，其目录编号为 1203K27
Bellco 旋转烧瓶，1968-玻璃罩，可密封法兰型，工作体积100 ml。此型号已停产。Bellco1968-00100（原始货号）夹套容器的入口较低 & 用于通过循环水浴进行温度控制的上出口端口。容器外径为75 mm，高度为200 mm。在约45°位置设有四个侧端口° 角度和一个顶部接口。接口开口尺寸适合0号氯丁橡胶塞（接口内径21-22 mm）。
Mathis Labomat IR 烘干 ovenMathisAg型号 BFA12 215307Werner Mathis U.S.A. Inc. usa@mathisag.com, 704-786-6157
双通道生化分析仪YSI生命科学2900D-UPwww.ysi.com，用于96孔微孔板格式快速糖类检测的机器人系统
PowerWave XS 微孔板分光光度计Bio-Tek Instruments, IncMQX200Rwww.biotek.com

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适应性进化酵母菌株改良木糖发酵水解液耐受性乙醇生产甘油菌种制备梯度稀释涂布相对性能指数连续培养筛选Scheffersomyces stipitis
用于木质纤维素生物转化乙醇的耐受性戊糖发酵酵母的进化技术
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