方法文章

鲁棒戊糖发酵酵母的木质纤维素生物转化的演进技术乙醇

DOI：

10.3791/54227

⸱

2016年10月24日

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1Bioenergy Research Unit, National Center for Agricultural Utilization Research, 2Mycotoxin Prevention and Applied Microbiology Research Unit, National Center for Agricultural Utilization Research, 3Chemical Engineering and Material Science, Great Lakes Bioenergy Center, Michigan State University

本文内容

摘要

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适应进化和隔离技术进行了描述和展示，得到了能够迅速消耗己糖和酶戊混合糖的糖化undetoxified水解和超过40克/升乙醇积聚Scheffersomyces树干毕赤酵母株的衍生物NRRL Y-7124。

摘要

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木质纤维素生物质是一种丰富的可再生原料，可用于生产燃料级乙醇和其他生物产品。预处理和酶糖化过程释放出可由酵母发酵的糖分。传统的工业酵母不发酵木糖（占植物糖的 40%），也不能在浓水解物中发挥作用。需要浓缩的水解物来支持经济的乙醇回收，但它们含有预处理过程中产生的有毒副产物。虽然解毒方法可以使水解物发酵，但它们成本高昂，并且会产生废物处理责任。在这里，描述和证明适应性进化和分离技术可产生天然 Scheffersomyces stipitis 菌株 NRRL Y-7124 的衍生物，这些衍生物能够在不利的培养条件下有效地将水解物转化为经济可回收的乙醇。利用依赖于 S. stipitis 种群的自然遗传多样性和暴露于两种不同水解物（乙醇或紫外线辐射）诱导的突变的多重选择压力，改进的个体在不断发展的种群中富集。最终进化培养物采用稀释接种板以收获主要分离株，而在进化的不同阶段冷冻在甘油中的中间种群使用适当的应力梯度在选择性培养基上富集，以通过稀释接种回收最有希望的分离株。在各种水解物类型上筛选分离株，并使用一种涉及木糖摄取率和乙醇产量数据的无量纲相对性能指数 （RPI） 转换的新程序进行排名。使用 RPI 统计参数，计算总体相对性能平均值，以根据多种因素对分离株进行排名，包括培养条件（营养物质和抑制剂的变化）和动力学特征。通过应用这些技术，亲本菌株的衍生物在 pH 值为 5-6 的酶糖化水解物中具有以下改进的特性：减少生长前的初始滞后阶段，减少葡萄糖-木糖转变期间的二氧滞后，显著提高发酵速率，提高乙醇耐受性和积累至 40 g/L。

引言

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预计每年1.3十亿干吨木质纤维素生物质可以支持乙醇生产和允许美国30％，以减少其石油消耗。1虽然植物生物质的水解产量糖混合物富含葡萄糖和木糖，通过必要的化学预处理产生发酵抑制剂打破半纤维素和酶的攻击揭露纤维素。乙酸，糠醛和羟甲基糠醛（HMF）被认为是在预处理过程中形成的许多抑制剂中的关键部件。为了移动至木质纤维素乙醇工业向前，研究和程序，以允许能够存活和有效率地运作，以同时使用的己糖和戊糖在这样的抑制化合物的存在是需要的酵母菌株的演变。传统的工业的酵母菌株，例如酿酒酵母的显著附加弱点，是不能有效地fermenT IN植物生物质的水解产物中可用的木糖。

树干毕赤酵母型菌株 NRRL Y-7124（CBS 5773），最近更名Scheffersomyces赤酵母，是土生土长的戊糖发酵酵母是众所周知的木糖发酵成乙醇。2,3株NRRL Y-7124的演变在这里追求的，因为它已经被记录在案，以具有天然酵母菌株的最大潜力来积累的经济可采乙醇量超过40克/升，很少木糖醇副产品。4,5,6在最佳媒体，S.树干毕赤酵母菌株NRRL Y-7124在0.41±0.06克高细胞密度培养物（6克/升的细胞）/克7,8-抗性的产率产生为70g / L的乙醇在40小时（1.75克/升/小时）到发酵抑制乙醇，糠醛和HMF也有报道....

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方案

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1.准备原料和设备的测定

  1. 准备在在演变，隔离用途和排名程序预处理反应使用18至20％的初始生物质干重量水解物。见Slininger 等人 2015年18详细的方法准备AFEX CSH，PSGHL和SGH用氮气补充N1或N2在进化过程中，隔离或排名使用。请参阅表1为每个类型的水解产物组成。
    注:SGH氮工事被指定为SGH-N1或SGH-N2定义如下:SGH-N1 = SGH强化到42:1的摩尔碳 - 氮比（C:N），用氮气源，包括尿素，游离维生素氨基从酪蛋白，D，L-色氨酸，L-半胱氨酸和维生素酸从定义源（使得〜摩尔氮（N）15％是伯氨基氮（PAN）和〜氮85％是从脲）; SGH-N2 = SGH强化到37:1℃:N尿素和大豆粉为成本最低的商业来源Ø˚F氨基酸和维生素，提供〜从PAN的N 12％和88％尿素。
  2. 收购母公司株的冻干培养，Scheffersomyces赤酵母 NRRL Y-7124（CBS 5773）从ARS培养物保藏中心（国家中心的农业应用研究，伊利诺伊州皮奥里亚市），准备甘油培养遵医嘱。保持母体酵母储备培养，并在-80℃下其在10％甘油的衍生物。
    1. 条纹甘油股酵母麦芽蛋白胨葡萄糖（YM）琼脂板（3克/升酵母提取物，3g / L的麦芽提取物，5g / L的蛋白胨，10克/升葡萄糖20克/升琼脂）孵育48-在25℃。8发达板72小时可在4℃储存最....

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结果

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S.树干毕赤酵母 ，使用三个选择培养，其中包括AFEX CSH，PSGHL和乙醇挑战的木糖馈连续培养的组合演变而来的。 图1示出了具有分离株一起执行进化实验的示意图发现无论是最有效地执行整体，或最有效地对测试的水解物中的一个， 表3示出了这些优越菌株NRRL保藏号并总结在实现富集的群体，从每个菌株中分离的过程中施加的适应应力。有些菌株，被视为有一个或两个水解物类型相对优越的性能，但11 7株上的所有水解类型的表现不错，尽管大部分的这些暴露，并仅在进化过程中单一类型的挑战。各演变的成功办法在这里拍摄于图2展示了-图7和表4中 。

图2描绘了在其中应变NRRL Y-7124的健壮衍生物串行传输增加AFEX CSH（步骤2）的浓度中富集适应的第一阶段后见到的不同的改进。在文化上6％葡聚糖AFEX CS.......

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讨论

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有几个步骤是对演​​化过程的成功至关重要。首先，它的关键是选择合适的选择压力，带动人口发展走向所需要的成功应用所需的表型。下面的选择性压力被选为S.树干毕赤酵母的发展，并在适当的时间施加到引导富集所需表型:12％葡聚糖AFEX CSH（这迫使生长和多样的糖发酵在乙酸和呋喃醛和其它抑制剂的低含量的存在下）增加强度;木糖喂连续培养随着乙醇浓度（这迫使木糖酶诱导减少diauxic滞后）;并增加20％的固体负载PSGHL（这迫使生长和木糖的发酵在高乙酸，呋喃，和其它抑制剂的存在下）的强度。第二，通过冷冻甘油s到保持不断变化的酵母群体是重要人口样本tocks作为浓缩过程的进行。人口的这样的快照可以被存储用于周期性功能测试记录演化进度并根据需要，以允许随后的隔离，或裂孔后重新启动演化过程。进化过程中的第三个关键步骤是通过丰富上一个方便的选择培养基选择培养种群或甘油储备的人群（如含有一个应力梯度呈现一系列水解产物和/或乙醇的浓度的琼脂或微板），以回收呈分离。然后存活殖民地中最紧张的条件下生长，可采摘后保留用于表征。可以重复这三个基本步骤，以追求每个附加所需表型的选择压力，或可选择地，多重压力在合适的单个周期。当天然亲酵母群体暴露于各.......

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披露

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作者没有什么可透露的。

致谢

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我们要衷心感谢内布拉斯加州林肯市农业研究服务部谷物、饲料和生物能源研究部的 Kenneth Vogel、Robert Mitchell 和 Gautam Sarath 博士为该项目提供的柳枝稷。我们还感谢美国能源部通过美国能源部五大湖生物能源研究中心 （GLBRC） 拨款 DE-FC02-07ER64494 向 VB 提供资金。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
Cellic Ctec，含有木聚糖酶（内切-1,4-）Novozymes无产品编号www.novozymes.com， 1-919-494-3000
Cellic Htec， 含有纤维素酶和新聚糖酶Novozymes无产品编号www.novozymes.com， 1-919-494-3000
烤营养大豆面粉Archer Daniels Midland Co. （ADM）63160ADM， 4666 Faries Parkway， Decatur， IL  1800-37-5843
Pluronic F-68 （表面活性剂）Sigma-AldrichP1300Sigma-Aldrich
Difco 维生素测定 酪蛋白氨基酸Becton Dickinson and Company228830多个供应商：e.g.， Fisher Scientific， VWR， Daigger
D，L-色氨酸 Sigma-AldrichT3300多家供应商：e.g.、Fisher Scientific、VWR、Daigger
L-半胱氨酸 Sigma-AldrichC7352多家供应商：e.g.、Fisher Scientific、Sigma-Aldrich
Bacto AgarBecton Dickinson and Company214010多家供应商：例如 、Fisher Scientific、VWR、Daigger
Bacto 麦芽提取物Becton Dickinson and Company218630多家供应商：e.g.、Fisher Scientific、VWR、Daigger
Bacto 酵母提取物Becton Dickinson and Company212750多家供应商：例如、Fisher Scientific、VWR、大豆
FlukaP0521-500gDaigger 蛋白胨 IV 型多家供应商：例如 、Fisher Scientific、VWR、Daigger
腺嘌呤、>99% 粉末Sigma-AldrichA8626CAS 73-24-5。可以使用其他品牌。多个供应商：例如 、Sigma-Aldrich、Acros Organics、MP Biomedicals LLC
胞嘧啶、>99%Sigma-AldrichC3506CAS 71-30-7。可以使用其他品牌。多个供应商：例如 、Sigma-Aldrich、Acros Organics、MP Biomedicals LLC
鸟嘌呤、SigmaUltraSigma-AldrichG6779CAS 73-40-5。可以使用其他品牌。多个供应商：例如 、Sigma-Aldrich、Acros Organics、MP Biomedicals LLC
胸腺嘧啶、99%Sigma-AldrichT0376CAS 65-71-4。可以使用其他品牌。多个供应商：例如 、Sigma-Aldrich、Acros Organics、MP Biomedicals LLC
尿嘧啶、99%Sigma-AldrichU0750CAS 66-22-8。可以使用其他品牌。多个供应商：例如 、Sigma-Aldrich、Acros Organics、MP Biomedicals LLC
葡萄糖（D-葡萄糖）、无水物、Certified ACSFisher ChemicalD16-500CAS 50-99-7。可以使用其他品牌。多个供应商：例如 、Acros Organics、Fisher Scientific、MP Biomedicals、Sigma-Aldrich
D-木糖、检测>99%Sigma-AldrichX1500CAS 58-86-6。可以使用其他品牌。多个供应商：例如、Acros Organics、Fisher Scientific、MP Biomedicals、Sigma-Aldrich
96 孔平底板Becton Dickinson Falcon351172多个供应商：例如 、Thermo-Fisher、VWR、Daigger
Wypall L40 WiperKimberly-Clark 微孔板盒中的 Kimberly-Clark毛巾，用于吸收水分进行加湿;多个供应商例如 ， 赛默飞世尔，uline，戴格
康宁刻度耐热玻璃瓶，125 ml，窄口（塞子 #5）康宁生命科学玻璃4980-125多个供应商：e.g.，赛默飞世尔，VWR，戴格
Innova 42R 摇床/培养箱，2.5 cm （1"） 旋转New Brunswick Scientific （1-800-631-5417）M1335-0016多个供应商：例如 、Eppendorf、Thermo-Fisher。可以使用其他投掷为 2.5 cm （1"） 的摇床/培养箱。
用于 4 个深孔 MTP 板的 Duetz 盖夹Applikon BiotechnologyZ365001700applikon-biotechnology.com（美国），1-650-578-1396
Duetz 系统夹心盖，用于 96 个深孔板Applikon BiotechnologyZ365001296applikon-biotechnology.com（美国），1-650-578-1396
Duetz 系统硅胶密封（0.8 mm 黑色低蒸发量），用于 96 个深孔板盖Applikon BiotechnologyV0W1040027applikon-biotechnology.com（美国），1-650-578-1396
用于 Duetz 系统夹心盖的蓝色超细纤维层Applikon BiotechnologyV0W1040001applikon-biotechnology.com（美国），1-650-578-1396
96 孔，2 ml 方孔金字塔底板，天然轭丙烯Applikon BiotechnologyZC3DXP0240applikon-biotechnology.com（美国），1-650-578-1396
Bellco 32 mm 硅胶海绵塞盖，25 个/包，用于 125 ml 培养瓶Bellco1924-00032Thomas Scientific，其目录号为 1203K27
Bellco 旋转瓶，1968 - 玻璃圆顶，可密封法兰型，100 ml 工作体积。这种设计不再生产。Bellco1968-00100 （原件 Cat.不。夹套容器具有下部入口和上部出口，用于使用循环水浴进行温度控制。容器外径为 75 毫米，高度为 200 毫米。在 ~45° 处有四个侧口;angles 和一个顶部端口。端口开口尺寸适合 0 号氯丁橡胶塞子（端口内径为 21-22 mm）。
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PowerWave XS 微孔板分光光度计Bio-Tek Instruments， IncMQX200Rwww.biotek.com
的

参考文献

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Perlack, R. D., Stokes, B. J. US Department of Energy. Billion-Ton Update: Biomass Supply for a Bioenergy and Bioproducts Industry. , Department of Energy. Oak Ridge National Laboratory, Oak Ridge, TN. (2011).
  2. Prior, B. A., Kilian, S. G., duPreez, J. C. Fermentation of D-xylose by the yeas....

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