鲁棒戊糖发酵酵母的木质纤维素生物转化的演进技术乙醇

摘要

适应进化和隔离技术进行了描述和展示，得到了能够迅速消耗己糖和酶戊混合糖的糖化undetoxified水解和超过40克/升乙醇积聚Scheffersomyces树干毕赤酵母株的衍生物NRRL Y-7124。

摘要

木质纤维素生物质是一种丰富的可再生原料，可用于生产燃料级乙醇和其他生物产品。预处理和酶糖化过程释放出可由酵母发酵的糖分。传统的工业酵母不发酵木糖（占植物糖的 40%），也不能在浓水解物中发挥作用。需要浓缩的水解物来支持经济的乙醇回收，但它们含有预处理过程中产生的有毒副产物。虽然解毒方法可以使水解物发酵，但它们成本高昂，并且会产生废物处理责任。在这里，描述和证明适应性进化和分离技术可产生天然 Scheffersomyces stipitis 菌株 NRRL Y-7124 的衍生物，这些衍生物能够在不利的培养条件下有效地将水解物转化为经济可回收的乙醇。利用依赖于 S. stipitis 种群的自然遗传多样性和暴露于两种不同水解物（乙醇或紫外线辐射）诱导的突变的多重选择压力，改进的个体在不断发展的种群中富集。最终进化培养物采用稀释接种板以收获主要分离株，而在进化的不同阶段冷冻在甘油中的中间种群使用适当的应力梯度在选择性培养基上富集，以通过稀释接种回收最有希望的分离株。在各种水解物类型上筛选分离株，并使用一种涉及木糖摄取率和乙醇产量数据的无量纲相对性能指数 （RPI） 转换的新程序进行排名。使用 RPI 统计参数，计算总体相对性能平均值，以根据多种因素对分离株进行排名，包括培养条件（营养物质和抑制剂的变化）和动力学特征。通过应用这些技术，亲本菌株的衍生物在 pH 值为 5-6 的酶糖化水解物中具有以下改进的特性：减少生长前的初始滞后阶段，减少葡萄糖-木糖转变期间的二氧滞后，显著提高发酵速率，提高乙醇耐受性和积累至 40 g/L。

引言

预计每年1.3十亿干吨木质纤维素生物质可以支持乙醇生产和允许美国30％，以减少其石油消耗^。1虽然植物生物质的水解产量糖混合物富含葡萄糖和木糖，通过必要的化学预处理产生发酵抑制剂打破半纤维素和酶的攻击揭露纤维素。乙酸，糠醛和羟甲基糠醛（HMF）被认为是在预处理过程中形成的许多抑制剂中的关键部件。为了移动至木质纤维素乙醇工业向前，研究和程序，以允许能够存活和有效率地运作，以同时使用的己糖和戊糖在这样的抑制化合物的存在是需要的酵母菌株的演变。传统的工业的酵母菌株，例如酿酒酵母的显著附加弱点，是不能有效地fermenT IN植物生物质的水解产物中可用的木糖。

树干毕赤酵母型菌株 NRRL Y-7124（CBS 5773），最近更名Scheffersomyces赤酵母，是土生土长的戊糖发酵酵母是众所周知的木糖发酵成乙醇^。2,3株NRRL Y-7124的演变在这里追求的，因为它已经被记录在案，以具有天然酵母菌株的最大潜力来积累的经济可采乙醇量超过40克/升，很少木糖醇副产品^。4,5,6在最佳媒体，S.树干毕赤酵母菌株NRRL Y-7124在0.41±0.06克高细胞密度培养物（6克/升的细胞）/克^7,8-抗性的产率产生为70g / L的乙醇在40小时（1.75克/升/小时）到发酵抑制乙醇，糠醛和HMF也有报道^，9和S.赤酵母已被用于商业规模的乙醇生产中最有前途的天然戊糖发酵酵母位列其中n在木素纤维素^。10我们的目标是应用多样化undetoxified木质纤维素水解和乙醇选择压力以迫使进化朝向的适用于工业应用应变NRRL Y-7124的更健壮的衍生物。寻求更强大的功能键都集中在水解糖较快吸收速率，减少了对更高效的混合糖利用率diauxy，以及乙醇和抑制剂更高的公差。 S的应用树干毕赤酵母到undetoxified水解物是研究的主要焦点，以消除与水解产物解毒过程，如加灰过量相关的附加操作费用。

两个工业有前途的水解产物用于强制进化:酶糖化氨纤维膨胀预处理的玉米秸秆水解物（AFEX CSH）和稀酸预处理柳枝水解产物液体^{（PSGHL）11,12} AFEX预处理技术正在开发最小化生产发酵抑制，而稀酸预处理表示当前最低成本的技术最普遍实行以暴露纤维素生物质进行酶糖化。 PSGHL是从预处理后剩余的纤维素可分离和的特点是丰富的，从水解的半纤维素木糖，但低于葡萄糖。 AFEX CSH和PSGHL组合物，其中被利用来管理演进过程中的关键环节彼此不同。 AFEX CSH是在氨基酸和氨氮源在呋喃醛和乙酸抑制剂较低，但高于PSGHL（ 表1）相比较。 PSGHL呈现木糖是可用的主要糖额外的挑战。因此PSGHL是合适的水解产物为改善木糖利用专门充实，一个弱点防止商业用途使用的酵母。即使是本地戊糖发酵的酵母，对次优糖低聚木糖的依赖本身支持细胞生长和修复变得更因各种原因水解产物更具挑战性:营养不足，抑制造成大面积破坏细胞结构的完整性，并破坏新陈代谢由于氧化还原不平衡⁹氮的补充，尤其是在形式氨基酸，能代表一个发酵经营显著成本。氮补充对菌株的筛选和排名的影响与柳枝水解探讨。

改进个人进行了使用多个选择压力依赖的S.天然的遗传多样性在不断变化的人口丰富树干毕赤酵母的人口和突变诱导暴露两个不同的水解物，乙醇或UV辐射。选择压力在并联和串联分别适用于探索S的演化进度对能够成长和水解发酵效率所需的树干毕赤酵母衍生物（ 图1）。官能人口日益具有挑战性的水解物的重复培养物的微孔板采用系列稀释为12％的葡聚糖AFEX CSH的要不然PGSHL在20％的固体加载制备完成英寸对木糖乙醇挑战的增长，连续培养应用程序通过丰富的表型示范敏感性较低乙醇木糖利用的镇压进一步提高AFEX CSH适应人群。后者的功能是下面的葡萄糖发酵最近表现出有问题的戊糖利用的菌株NRRL Y-7124 ⁸富集的PSGHL是下探索扩大水解物的功能。

S的推定提高衍生品赤酵母 NRRL Y-7124是使用压力条件和稀释电镀下有针对性的富集，从最普遍的人群挑选的菌落演变过程的每个阶段中分离。相对量纲性能指标（RPI）提供用于基于整体性能，其中动力学行为施加不同的水解物种类和营养素补充剂评估排名的压力。虽然各种改编程序的成功，以提高S的功能树干毕赤酵母中的木质纤维素水解产物先前已被记录，菌株显示出上undetoxified水解经济乙醇生产尚未报道^。13-17使用进化过程中这里更详细地进行可视化，Slininger 等人 ¹⁸开发出了显著改善了菌株亲本菌株NRRL Y-7124，并能产生>为40g / L的乙醇在AFEX CSH和酶糖化柳枝水解产物（SGH）适当补充有氮源。这些新菌株是将来的兴趣到显影木质纤维素到乙醇工业的和作为附加基因组学的研究大厦的受试者¹⁹与以前测序株NRRL Y-11545的。在图1中可图示将阐明在开发过程中发生的前奏，进一步菌种改良研究基因变化的历史沿革的不同阶段产生的顶部菌株的基因组学研究。

方案

1.准备原料和设备的测定

1. 准备在在演变，隔离用途和排名程序预处理反应使用18至20％的初始生物质干重量水解物。见Slininger 等人 2015年¹⁸详细的方法准备AFEX CSH，PSGHL和SGH用氮气补充N1或N2在进化过程中，隔离或排名使用。请参阅表1为每个类型的水解产物组成。
   注:SGH氮工事被指定为SGH-N1或SGH-N2定义如下:SGH-N1 = SGH强化到42:1的摩尔碳 - 氮比（C:N），用氮气源，包括尿素，游离维生素氨基从酪蛋白，D，L-色氨酸，L-半胱氨酸和维生素酸从定义源（使得〜摩尔氮（N）15％是伯氨基氮（PAN）和〜氮85％是从脲）; SGH-N2 = SGH强化到37:1℃:N尿素和大豆粉为成本最低的商业来源Ø˚F氨基酸和维生素，提供〜从PAN的N 12％和88％尿素。
2. 收购母公司株的冻干培养，Scheffersomyces赤酵母 NRRL Y-7124（CBS 5773）从ARS培养物保藏中心（国家中心的农业应用研究，伊利诺伊州皮奥里亚市），准备甘油培养遵医嘱。保持母体酵母储备培养，并在-80℃下其在10％甘油的衍生物。
   1. 条纹甘油股酵母麦芽蛋白胨葡萄糖（YM）琼脂板（3克/升酵母提取物，3g / L的麦芽提取物，5g / L的蛋白胨，10克/升葡萄糖20克/升琼脂）孵育48-在^25℃。8发达板72小时可在4℃储存最多一周使用液态预培养的接种物之前。
3. 准备最优定义培养基（ODM），先前由父STR木糖的最佳转化为乙醇研制工业制剂程序²⁰相兼容的合成培养基艾因Scheffersomyces（毕赤酵母）赤酵母 NRRL ^Y-7124。7使用了发酵性能生物测定所有预培养和文化的定义中，也为乙醇的挑战，木糖，美联储连续培养进化。 ODM的组成名单表2中的参考。
4. 如前所述^，18使用cuvette-或微板读数分光光度计，酌情以测量在620nm（A _620）培养吸光度分析细胞生物质。定量糖，乙醇，糠醛，羟甲基糠醛（HMF），并使用高效液相色谱法（HPLC）或葡萄糖的机器人酶法测定和木糖为更高的吞吐量培养样品中的乙酸。

2. AFEX CSH串行传输过程中丰富强大的衍生品

1. 接种菌株NRRL Y-7124的预培养。从YM琼脂细胞转移向75ml ODM + 150 g / L的木糖保持在o增长的能力smotic压力。孵育在125ml烧瓶用硅海绵关闭预培养塞在25℃振荡（150转，1"轨道）24小时。
2. 6-12％葡聚糖AFEX CSH的解冻冷冻等分在冷水中使用。如果需要的话调节pH至5，并事先以制备系列稀释96-孔微量过滤消毒。
3. 填写微孔板每孔50微升每稀释水解8个孔，然后用每孔预培养几微升接种，使初始吸光度（620 nm）的_620≥0.1。在用湿纸巾湿度塑料盒在25℃孵育板静态24-48小时。
4. 使用最集中的水解产物稀释度明显增长到_620> 1，移1-5微升至一个新的水解产物系列稀释每口井实现最初的_620≥0.1。
5. 监视增长文化在微孔板₆₂₀分光光度计。一个未接种稀释系列SERVES作为对照组和空白。板盖被监测，以防止污染期间离开上，并且读数相应的调整。
6. 准备适应文化的甘油股定期改良品系随后分离或用于reinoculating持续水解物系列稀释使用。为了准备库存，游泳池殖民统治的最大水解物浓度的四口井（200微升）。混合1:1中的冷冻管20％的无菌甘油，在-80℃下冻结，在10％甘油的细胞。
7. 重复步骤2.3-2.6，直到12％葡聚糖AFEX CSH增长是24小时持续可见。

富集分离3.单细胞衍生的容错上AFEX CSH

1. 适应培养成YM琼脂，和使用条纹条纹选甘油股在三个微孔板（初始_620〜0.1）接种50μl的3％或6％的葡聚糖AFEX CSH（pH为5）。微孔板孵育24小时，如步骤2.3。池副本TE在与强劲的增长，并稀释板YM或6％葡聚糖AFEX CSH琼脂最高强度水解殖民井。制备后者作为一个1:过滤器的1混合灭菌12％葡聚糖AFEX CSH用温高压灭菌30g / L的琼脂溶液。
2. 从挑选后24-48小时培养的最高稀释板呈现增长5单菌落在25℃下冷冻甘油股票的培养。条纹每个殖民地到YM板。孵育24小时。用无菌环，细胞的展开条纹转移到10％甘油中的一小体积，混合悬浮细胞，并分发到2-3冷冻管在-80℃冷冻。

4.评估AFEX CSH宽容衍生物的性能相比于母公司

1. 测试在隔离简单的6％葡聚糖AFEX CSH分批培养。
   1. 从48小时板细胞转移从甘油股票挑染pH为7钾磷酸盐缓冲液（0.4毫米），与₆₂₀ = 10。使用准备细胞悬液1微升每个悬挂接种每个四口井50微升3％葡聚糖水解初始₆₂₀ = 0.2。微孔板孵育24小时，如步骤2.3。 3用无菌水:通过稀释12％葡聚糖AFEX CSH 1准备在pH值为5的3％葡聚糖AFEX CSH。
   2. 将两个24小时的微孔板接种pH值5的12％葡聚糖AFEX CSH 25ml的预培养在满50％的人使用。在25℃孵育在50毫升烧瓶用硅海绵封闭24小时预培养物，〜150rpm的（1"轨道）通过稀释水解产物1准备半强度的12％葡聚糖AFEX CSH:1用无菌水。
   3. 使用半强度水解物预培养接种类似25毫升增长的文化初始₆₂₀ = 0.1。孵育生长培养如上述（4.1.2）和每日样品（0.2ml）中。生物质的监测积累_（620）和糖和发酵制品（HPLC）浓度。
2. 另外，repitch（ 即 ，收获和Reuse）在8％葡聚糖水解产物分批培养进行测试的6％的葡聚糖AFEX CSH-生长酵母群体，如先前所描述^。18
3. 可替代地，repitched 6％葡聚糖AFEX CSH培养物的进一步试验群体通过用12％葡聚糖水解产物进料，如先前所描述^。18
4. 在测试的ODM分批培养与混合糖株diauxic滞后。
   1. 从YM甘油条纹环传递接种75毫升ODM与在125ml瓶中用硅胶海绵倒闭为150g / L木糖的预培养。孵育24小时如在步骤2.1。
   2. 用预培养物接种相似75毫升试验培养物用含75克/升葡萄糖和75克/ L木糖的ODM在pH6.5。在25℃，150rpm的摇瓶中。每天的样本。
   3. 可替代地，通过使用类似的协议测试的0-15克/升的乙酸上diauxy葡萄糖和木糖的发酵过程中的影响，除了初始pH值在试验培养设定为6.0±0.2，以保持pH为6-7杜响乙酸消耗，如前所述^。18

5.应用连续培养来选择乙醇挑战的木糖利用

1. 制备的ODM如在pH 6.3±0.2用60-100克/ L木糖，20-50克/升的乙醇连续培养料培养基。选择木糖和乙醇的组合，以模拟为150g / L木糖的部分发酵，假定约0.5克乙醇/克木糖的潜在产量，并容纳了潜在的50-70克/升的乙醇发生^。8
2. 为了制备连续培养接种物，AFEX CSH容错菌落（类似于菌落5实施例中， 图1）通过循环由一个48小时YM板传送代表75无乙醇的ODM（100克/ L木糖毫升，在这种情况下）在125ml烧瓶中。孵育在25℃，150rpm下（1"轨道）24小时。选择预培养的ODM木糖浓度以匹配初始连续培养保持体积。
3. 在pH接种ODM的连续培养保持体积6.3±0.2为100克/ L木糖+ 20克/升乙醇〜5-10 AFEX CSH耐受分离物的预培养物浓缩物的混合物（类似于菌落5， 图1 ）在最初的_620〜0.5得到100毫升维持培养保持体积（V _r），在25℃下在夹套百毫升旋转瓶中以200rpm搅拌，并用灭菌pH电极，pH调节和温度控制的循环水浴配备。
4. 起初，由于细胞的生长将是缓慢的，由于乙醇曝光，设置了进料介质使用pH致动泵剂量。设置泵喂pH值6.3的ODM用100克/ L木糖和50g / L的乙醇时培养发酵降到pH至5.4，从而停止进一步的pH值下降。维持在100毫升，流出泵连续略读培养表面的体积。因此，乙醇浓度上升与持续的代谢和喂养。
5. 测量流出和从连续培养吸取样本（1-2毫升）中每48-72小时为活细胞浓度，产物和底物的分析，如先前所描述^。18为了找到活菌浓度，使样品的串行1:10稀释在缓冲区（见4.1.1）和扩散板稀释到YM琼脂（参见1.2.1节）。基于流出物收集率（Q），计算稀释率（D）的（Q / V _R），并且，在S的例子树干毕赤酵母，它改变从0到0.01小时^-1。
6. 从缓冲样品稀释活力板隔离形成30-100殖民地代表在浓缩当时最流行的强大的殖民者保存定期甘油股票。用约5含10％甘油的洪水板，让准备重复冷冻管中。为了维护或休养生息，停止连续培养和使用最新的（耐）甘油（S）需要重新启动。
7. 要重新启动，连胜大部分甘油（S）抗性种群成YM琼脂和由循环传送24-48小时细胞无乙醇的ODM的预培养孵育如上。接种100毫升持有ODM量使用预培养酵母的浓缩物初始₆₂₀ 0.5，并允许重新开始进料介质的流量前培养生长分批到静止期。
8. 如果培养物可以稳定地在> 0.01小时^-1木糖上在> 25克/升的乙醇存在下生长，启动连续培养料（ODM + 60克/ L木糖+乙醇测距30至50克/升）在低稀释率〜0.01小时^-1到100毫升保持体积（最初的ODM + 60克/ L木糖+ 20克/升乙醇）。随着时间的推移，提高对乙醇为50g / L时Feed中的捕捉甘油股票先进群体。
   注:维持低稀释率能够形成足够高的细胞浓度，以减少氧气供应和支持发酵。
9. 任选地，适用于紫外线（UV）irradiat离子每月甘油用于reinoculate连续培养股票群体。
   1. 从甘油条纹在10毫升ODM的悬浮殖民地（如在预培养）60 g / L的木糖和池的所有股票在一个无菌瓶中。在约5×10 ^8个活细胞/ ml应用汇集的细胞悬浮液，以刚好覆盖4-5培养皿的用6毫升/板的底部。为了得到一个标准的一次性培养皿6mL的覆盖范围，免除15毫升克服表面张力，然后取出9毫升。
   2. 互揭开放的文化板块在生物安全柜的光源紫外线。调整UV曝光时间或距离以获得所需的杀灭率> 90％。这里，在从源周围56厘米暴露45分钟。
   3. 前和照射后稀释板细胞悬浮液。基于菌落形成单位估算杀灭率。对于S.赤酵母例如，杀灭率为〜97％。
   4. 传送紫外线暴露培养物（24-30毫升）的箔冠状病毒ERED 50ml烧瓶，并在25℃和150rpm下24小时孵育以允许活细胞的小的百分比，以重新填充至〜1×10 ⁸活S.树干毕赤酵母细胞/ ml。通过防止照片重新激活，而文化是培养箔盖保留突变。
   5. 使用重新填充诱变培养物接种连续培养至〜1×10 ⁷个活细胞/ ml。重新启动乙醇富集ODM + 60 g / L的木糖培养基料继续选择过程。

6.评估甘油人口和乙醇存在找出那些与改进发酵木糖

1. 条纹选定甘油储备培养成YM琼脂作为在屏幕中的乙醇存在木糖的最佳生长和发酵的第一步。
2. 转移的每个进化人口从琼脂条纹进行筛选向75ml预培养物中的ODM用150克/升葡萄糖，并在125ml烧瓶96孵化前hr作为接种试验培养使用。大型葡萄糖生长的人口将需要酶木糖利用的诱导。
   1. 为了测试诱导，收获每种培养，悬浮细胞至30毫升，初始的40 A ₆₂₀中的ODM60克/ L木糖+ 30-45克/升的乙醇，并在25°C孵育，以150rpm（1"轨道）在50毫升瓶中硅海绵倒闭。每天画出样本两次通过HPLC分析监测木糖吸收。
3. 可替代地，如在Slininger描述。等 ^，18至在乙醇存在评估在木糖上生长，由环传递至75的ODM毫升在125ml烧瓶为150g / L木糖制备各进化群体的预培养物，孵育96在25℃，150rpm下（1"轨道）小时。接种试验培养到0.1的低初始₆₂₀在25毫升的ODM + 60克/ L木糖+ 30-45克/升乙醇在125ml烧瓶中。孵育烧瓶在25℃，转速300rpm，1"轨道和样品。

7。分离单个细胞菌落，在PSGHL利用木糖当乙醇存在

1. 基于步骤6的结果，选择甘油人口呈现增长上，并在乙醇存在木糖发酵能力出众。使用这些条纹板。条纹板是用来准备的₆₂₀ = 5.然后细胞悬液被用于接种在96深孔板预培养至A ₆₂₀ = 0.5密集，缓冲细胞悬液。接种1毫升预培养物上PSGHL 1:1混合用的ODM + 50g / L的木糖（无乙醇）。孵育预培养于96孔，通风与低蒸发深孔板覆盖在25℃48小时，400转，1"的轨道。区分不同甘油人群由井空。
2. 使用每个预培养，接种161毫升文化复制到初始_620〜0.5 1:1 PSGHL:ODM + 50g / L的木糖与20，30，或40克/升乙醇，以丰富宽容的殖民者。孵育富集文化前进同样的资源来预培养。
3. 对于每一个不同的甘油，收获最高乙醇浓度使生长和木糖利用文化井。铭牌每个细胞系YM琼脂获得普遍的单菌落甘油保存。挑选每细胞系和条纹各10殖民地到YM琼脂平板甘油备料。

8. PSGHL串行传输过程中进一步丰富强大的演进菌株，为CSH AFEX

1. 制备NRRL Y-7124（父）的预培养物，AFEX CSH容错进化隔离，并连续培养进化人群在乙醇存在下使用木糖增强能力。上述用于AFEX CSH水解适配过程（步骤2.1）所描述的从甘油条纹接种75毫升ODM + 150克/ L木糖的由循环。
2. 稀释PSGHL用水以提供一系列增加浓度的。通过使用各准备96孔微板的每个三种细胞系的PSGHL稀释，以填补8井50微升。使用预培养接种系列稀释到初始_{620〜0.1-0.5}每50微升微文化。
   1. 继续酵母进化中使用相同的步骤与上述（步骤2）中详述的AFEX CSH水解适应直到培养物能够在_ΔA620的每Δtime稳定14-D的平均比在全强度水解产物生长增加PSGHL的长处串行传输是持续的额外四个月。

9.分离单个细胞的菌落使用PSGHL渐变带或不带乙醇挑战

1. 获得单细胞通过稀释电镀YM琼脂直接从充满力量PSGHL最终适应隔离板。挑为三个细胞系和杆条纹成YM板十个大菌落如前所述（步骤3.2），以制备甘油储。
2. 或者，探讨在较早的时间点通过从三个细胞系的存储甘油原液分离进化过程。
   1. 接种预培养物用于从甘油条纹由环路每个细胞系孵育上30毫升ODM + 50g / L的木糖24小时（50毫升烧瓶，25℃，150rpm下）。
   2. 通过接种在微孔板50％PSGHL的50微升至初始_620〜0.2和静态培养48小时，从预培养中生长水解细胞的挑战。
   3. 散布0.1每富集培养毫升到PSGHL梯度琼脂平板范围从0至50％的强度的水解产物（递送〜每板300-400活细胞），并挑选每细胞系10个单菌落从渐变的最高可能的水解产物浓度区²¹条纹挑殖民地YM甘油备料如步骤3.2。
   4. 作为替代步骤9.2.3，代替接种梯度琼脂平板，接种的96孔微板孔中，以初始一个_620〜0.2，磨片重新孔被设计成包含一系列水解产物的浓度为50〜100％的强度和乙醇为10〜40克/升。在这种情况下，发展微型板7​​2-96小时，并以其他方式作为在步骤2.3。从最苛刻的水解产物乙醇的组合显示出通过稀释电镀增长井隔离十唯一的殖民地，并准备甘油股票作为步骤3.2。

10.在一个主屏幕，消除通过比较和排名上PSGHL性能劣株在两种营养条件

1. 适用的PSGHL性能高通量深孔板屏幕到屏幕五套三十与NRRL Y-7124亲和AFEX CSH耐受分离物（类似于图1的演进示例的菌落5）隔离沿作为对照来选择六大顶级株（20％），从每一组传递到二次筛选电平（步骤12）。
2. 开展填补每孔1 mL和覆盖无线深孔板屏幕日不锈钢盖与黑色硅胶低蒸发密封。钳形所有板块的孵化器/摇床的董事会，并在25℃和400转（1"摇床轨道）操作。所有设计深孔板填充图案由开井，让不同菌株的分离。
3. 开始栽培接送从30制备甘油条纹细胞的珠分离得到如上述（在步骤3,7和9）以重复的ODM + 50g / L的木糖的孔中并孵育48小时。
4. 1 ODM + 10克/升葡萄糖+ 50g / L的木糖:作为预培养的菌株的一个挑战介质，由1混合PSGHL制备50％PSGHL。为了筛选的30株和两个控制株，2板，每次使用的16株2井填满，留下不同菌株之间的空井。
5. 对于挑战的文化，传递，ODM前期文化的50微升体积_{（620〜10），}每两个50％PSGHL挑战文化井每个分离的和控制，以获得initi人_620〜0.5和孵化72小时。
6. 使用不同的营养丰富的两个测试媒体筛选隔离:60％PSGHL + ODM的营养物质;和75％PSGHL + ODM + YM营养素。在强度为标准的一半加ODM营养素（不含糖）为ODM用50g / L的糖（步骤1.3）的使用。作为指定，以3克/升酵母提取物，3g / L的麦芽提取物，5g / L的蛋白胨标准强度半添加YM营养素（不含糖）。
7. 通过转移50微升72小时50％PSGHL挑战预先培养接种1000微升初始五个深水井_620〜0.5为每两个测试媒体接种试验的文化。
8. 样品每天的隔离。吸取的阱的内容传送到一个微量离心管中并离心分离（5533 xg离心，15分钟）以获得用于乙醇，葡萄糖和木糖的高通量分析上清液。测量生物量为A ₆₂₀在96孔微板（200μl/孔）用分光光度计。
9. 内的每个组的30是olates测试（5集S.树干毕赤酵母 NRRL Y-7124进化株），计算在步骤11以下描述相对性能指标（RPI），并使用基于乙醇产率（每供给初始糖累积最大乙醇）排名每种菌株和木糖吸收率两种测试介质上（每最初96小时所消耗木糖浓度）。

11.排名在隔离主PSGHL屏幕使用相对表现指数（RPI）

1. 以下主要筛选，以排列在每五个不同的实验的30株，以在屏幕上PSGHL隔离每个实验两个不同的营养配方， 即，60％PSGHL和75％PSGHL计算因次相对性能指数（RPI）。
2. 计算统计参数F表示使用中的一组在给定的实验中测试的菌株的内排名分离性能:F =（ⅩⅩ _平均 ）/秒。这里，X为性能参数，如产率（Y）的或速率（R），对于每个单独的分离观察到的，能够在X _平均和s的平均值和标准偏差，分别的X-观察所有给定的实验中分离。对于正态分布，-2
3. 对于每一个在实验中分离，计算基于率，RPI _R =（2 + F _R）相对表现×100/4，同样计算基于产量相对表现，RPI _Y =（2 + F _Y）×100/4 。 RPI的取值范围为0〜100个百分点（从最低到最高）。然后计算平均RPI为每一个给定的水解产物实验中隔离如下:RPI _平均 =（RPI _Y + RPI _R）/ 2，其中收益率和贡献给予相等的权重本应用。
   请注意，在一般情况下，产率和速率参数可如果认为在重要性不等进行加权。
4. 计算RPI _整体跨越n种测试的水解产物: _整体 RPI _{=Σi = 1，N} [（RPI _Y + RPI _R）/ 2] _I / N。考虑实验组30株和2个控制每个隔离开来。在〜150单菌落初级排名株适应木糖丰富PSGHL，RPI的_整体计算在屏幕应用及回报率在这两个PSGHL配方， 即 60％PSGHL和75％PSGHL，其中n = 2。
5. 基于_整体每个实验中的RPI，选择分离的顶部百分比传递到辅助屏幕。在这个例子中，菌株的最高的20％选择为穿过（ 即，150 30测试）。

12.在二级屏幕，比较上多完成的水解产物（> 100克/升混合糖）顶层一级屏幕表演，以显示最高正常工作的强大株

1. 比较上面PSGHL表现在6％葡聚糖AFEX CSH和SGH氮，SGH-N1和SGH-N2（组成的两个级别修正译文]在表1中），用于最终排名。筛选30株即是在PSGHL的初级深孔板屏幕顶端表演（步骤10和11）和两个对照（亲株NRRL Y-7124和AFEX CSH耐受分离物（类似于菌落5， 图1示例）。
2. 通过从甘油条纹拾取细胞的珠如前重复1毫升ODM + 50g / L的木糖的深井和在深孔板系统（步骤10.2）孵育48小时开始栽培。然后50微升ODM预培养转移到50％SGH挑战文化，并培育了深孔板系统72小时，获得_{620〜10）。} 1无糖的ODM + 50g / L的木糖（pH值为5.6）:1混合SGH制备50％的SGH。
3. 对于每个菌株，接种16毫升一份的SGH-N1或SGH-N2的来自挑战培养三个孔中的细胞沉淀（15分钟，2,711 XG），得到最初的测试培养物_620〜2.0。孵育试验培养物，在25＆＃176; C，180 RPM在25毫升瓶中用硅胶海绵封（1"轨道），每日采样瓶每PSGHL屏幕分析。
4. 同样地，屏分离如步骤12.2和12.3，但此时代替SGH-N1和SGH-N2，用6％葡聚糖AFEX CSH在pH 5.2制备的挑战培养基和试验培养基中使用。对于50％的实力挑战文化，用6％AFEX CSH稀释1:1加水，因为它是足够的氮未作修正。
5. 重复步骤12.1-12.4重复的结果。

13株排名在二级画面_整体多台完整的水解产物率使用性能使用RPI

1. 为了排名每个分离的前20％计算相对性能指标（RPI）（〜30满分150），从已经在酶的辅助屏幕进行了测试主屏幕糖化不同营养丰富的水解配方。
2. 每个分数在根据三个酶糖化的预处理水解产物的制剂进行木糖摄取率和乙醇产率的二次筛选分离物测试一式两份运行，包括AFEX CSH（ⅰ= 1和2），SGH-N1（ⅰ= 3和4）和SGH -N2（ⅰ= 5和6）。
3. _总体计算RPI每个隔离，并应用这一排名参数进一步簸优越株名单:RPI _{整体 =ΣI = 1，N} [（RPI _Y + RPI _R）/ 2] _I / n，其中n = 6 。
   注:按照在Slininger 等人的过程演示在瓶培养SGH-N2水解分离优越动力学^18。

结果

S.树干毕赤酵母 ，使用三个选择培养，其中包括AFEX CSH，PSGHL和乙醇挑战的木糖馈连续培养的组合演变而来的。 图1示出了具有分离株一起执行进化实验的示意图发现无论是最有效地执行整体，或最有效地对测试的水解物中的一个， 表3示出了这些优越菌株NRRL保藏号并总结在实现富集的群体，从每个菌株中分离的过程中施加的适应应力。有些菌株，被视为有一个或两个水解物类型相对优越的性能，但11 7株上的所有水解类型的表现不错，尽管大部分的这些暴露，并仅在进化过程中单一类型的挑战。各演变的成功办法在这里拍摄于图2展示了-图7和表4中 。

图2描绘了在其中应变NRRL Y-7124的健壮衍生物串行传输增加AFEX CSH（步骤2）的浓度中富集适应的第一阶段后见到的不同的改进。在文化上6％葡聚糖AFEX CS...

讨论

有几个步骤是对演​​化过程的成功至关重要。首先，它的关键是选择合适的选择压力，带动人口发展走向所需要的成功应用所需的表型。下面的选择性压力被选为S.树干毕赤酵母的发展，并在适当的时间施加到引导富集所需表型:12％葡聚糖AFEX CSH（这迫使生长和多样的糖发酵在乙酸和呋喃醛和其它抑制剂的低含量的存在下）增加强度;木糖喂连续培养随着乙醇浓度（这迫使木糖酶诱导减少diauxic滞后）;并增加20％的固体负载PSGHL（这迫使生长和木糖的发酵在高乙酸，呋喃，和其它抑制剂的存在下）的强度。第二，通过冷冻甘油s到保持不断变化的酵母群体是重要人口样本tocks作为浓缩过程的进行。人口的这样的快照可以被存储用于周期性功能测试记录演化进度并根据需要，以允许随后的隔离，或裂孔后重新启动演化过程。进化过程中的第三个关键步骤是通过丰富上一个方便的选择培养基选择培养种群或甘油储备的人群（如含有一个应力梯度呈现一系列水解产物和/或乙醇的浓度的琼脂或微板），以回收呈分离。然后存活殖民地中最紧张的条件下生长，可采摘后保留用于表征。可以重复这三个基本步骤，以追求每个附加所需表型的选择压力，或可选择地，多重压力在合适的单个周期。当天然亲酵母群体暴露于各...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
Cellic Ctec，含有木聚糖酶（内切-1,4-）	Novozymes	无产品编号	www.novozymes.com， 1-919-494-3000
Cellic Htec， 含有纤维素酶和新聚糖酶	Novozymes	无产品编号	www.novozymes.com， 1-919-494-3000
烤营养大豆面粉	Archer Daniels Midland Co. （ADM）	63160	ADM， 4666 Faries Parkway， Decatur， IL  1800-37-5843
Pluronic F-68 （表面活性剂）	Sigma-Aldrich	P1300	Sigma-Aldrich
Difco 维生素测定 酪蛋白氨基酸	Becton Dickinson and Company	228830	多个供应商：e.g.， Fisher Scientific， VWR， Daigger
D，L-色氨酸	Sigma-Aldrich	T3300	多家供应商：e.g.、Fisher Scientific、VWR、Daigger
L-半胱氨酸	Sigma-Aldrich	C7352	多家供应商：e.g.、Fisher Scientific、Sigma-Aldrich
Bacto Agar	Becton Dickinson and Company	214010	多家供应商：例如 、Fisher Scientific、VWR、Daigger
Bacto 麦芽提取物	Becton Dickinson and Company	218630	多家供应商：e.g.、Fisher Scientific、VWR、Daigger
Bacto 酵母提取物	Becton Dickinson and Company	212750	多家供应商：例如、Fisher Scientific、VWR、大豆
Fluka	P0521-500g	Daigger 蛋白胨 IV 型	多家供应商：例如 、Fisher Scientific、VWR、Daigger
腺嘌呤、>99% 粉末	Sigma-Aldrich	A8626	CAS 73-24-5。可以使用其他品牌。多个供应商：例如 、Sigma-Aldrich、Acros Organics、MP Biomedicals LLC
胞嘧啶、>99%	Sigma-Aldrich	C3506	CAS 71-30-7。可以使用其他品牌。多个供应商：例如 、Sigma-Aldrich、Acros Organics、MP Biomedicals LLC
鸟嘌呤、SigmaUltra	Sigma-Aldrich	G6779	CAS 73-40-5。可以使用其他品牌。多个供应商：例如 、Sigma-Aldrich、Acros Organics、MP Biomedicals LLC
胸腺嘧啶、99%	Sigma-Aldrich	T0376	CAS 65-71-4。可以使用其他品牌。多个供应商：例如 、Sigma-Aldrich、Acros Organics、MP Biomedicals LLC
尿嘧啶、99%	Sigma-Aldrich	U0750	CAS 66-22-8。可以使用其他品牌。多个供应商：例如 、Sigma-Aldrich、Acros Organics、MP Biomedicals LLC
葡萄糖（D-葡萄糖）、无水物、Certified ACS	Fisher Chemical	D16-500	CAS 50-99-7。可以使用其他品牌。多个供应商：例如 、Acros Organics、Fisher Scientific、MP Biomedicals、Sigma-Aldrich
D-木糖、检测>99%	Sigma-Aldrich	X1500	CAS 58-86-6。可以使用其他品牌。多个供应商：例如、Acros Organics、Fisher Scientific、MP Biomedicals、Sigma-Aldrich
96 孔平底板	Becton Dickinson Falcon	351172	多个供应商：例如 、Thermo-Fisher、VWR、Daigger
Wypall L40 Wiper	Kimberly-Clark 微孔板盒中的 Kimberly-Clark		毛巾，用于吸收水分进行加湿;多个供应商例如 ， 赛默飞世尔，uline，戴格
康宁刻度耐热玻璃瓶，125 ml，窄口（塞子 #5）	康宁生命科学玻璃	4980-125	多个供应商：e.g.，赛默飞世尔，VWR，戴格
Innova 42R 摇床/培养箱，2.5 cm （1"） 旋转	New Brunswick Scientific （1-800-631-5417）	M1335-0016	多个供应商：例如 、Eppendorf、Thermo-Fisher。可以使用其他投掷为 2.5 cm （1"） 的摇床/培养箱。
用于 4 个深孔 MTP 板的 Duetz 盖夹	Applikon Biotechnology	Z365001700	applikon-biotechnology.com（美国），1-650-578-1396
Duetz 系统夹心盖，用于 96 个深孔板	Applikon Biotechnology	Z365001296	applikon-biotechnology.com（美国），1-650-578-1396
Duetz 系统硅胶密封（0.8 mm 黑色低蒸发量），用于 96 个深孔板盖	Applikon Biotechnology	V0W1040027	applikon-biotechnology.com（美国），1-650-578-1396
用于 Duetz 系统夹心盖的蓝色超细纤维层	Applikon Biotechnology	V0W1040001	applikon-biotechnology.com（美国），1-650-578-1396
96 孔，2 ml 方孔金字塔底板，天然轭丙烯	Applikon Biotechnology	ZC3DXP0240	applikon-biotechnology.com（美国），1-650-578-1396
Bellco 32 mm 硅胶海绵塞盖，25 个/包，用于 125 ml 培养瓶	Bellco	1924-00032	Thomas Scientific，其目录号为 1203K27
Bellco 旋转瓶，1968 - 玻璃圆顶，可密封法兰型，100 ml 工作体积。这种设计不再生产。	Bellco	1968-00100 （原件 Cat.不。	夹套容器具有下部入口和上部出口，用于使用循环水浴进行温度控制。容器外径为 75 毫米，高度为 200 毫米。在 ~45° 处有四个侧口;angles 和一个顶部端口。端口开口尺寸适合 0 号氯丁橡胶塞子（端口内径为 21-22 mm）。
Mathis Labomat 红外干燥箱	MathisAg	Typ-NBR BFA12 215307	Werner Mathis 美国公司 usa@mathisag.com， 704-786-6157
双通道生化分析仪	YSI Life Sciences	2900D-UP	www.ysi.com，用于 96 孔微孔板格式快速糖分分析的机器人系统
PowerWave XS 微孔板分光光度计	Bio-Tek Instruments， Inc	MQX200R	www.biotek.com