描述并演示了适应性进化和分离技术，以获得能够快速消耗酶解未经脱毒的水解物中混合的己糖和戊糖，并积累超过40 g/L乙醇的Scheffersomyces stipitis菌株NRRL Y-7124的衍生菌株。
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本文内容
摘要
摘要
木质纤维素生物质是一种丰富且可再生的原料，可用于生产燃料级乙醇及其他生物产品。预处理和酶解糖化过程可释放出可被酵母发酵的糖类。传统的工业酵母无法发酵木糖（可占植物糖类含量的40%），并且不能在浓缩水解物中正常发挥作用。虽然浓缩水解物对于实现经济可行的乙醇回收至关重要，但其中含有大量在预处理过程中产生的有毒副产物。尽管脱毒方法可使水解物变得可发酵，但这些方法成本高昂，并会产生废物处理负担。本文介绍并演示了利用适应性进化与分离技术，获得源自天然 Scheffersomyces stipitis 菌株 NRRL Y-7124 的衍生菌株，这些菌株能够在不利培养条件下高效地将水解物转化为经济可回收的乙醇。通过利用 S. stipitis 种群的天然遗传多样性以及暴露于两种不同水解物、乙醇或紫外辐射所诱导的突变，结合多种选择压力，在进化种群中富集性能更优的个体。最终的进化培养物通过稀释涂布法分离出优势菌株；而在进化过程的不同阶段以甘油冷冻保存的中间种群，则在选择性培养基上利用适当的压力梯度进行富集，再通过稀释涂布法回收最具潜力的菌株。菌株在多种类型的水解物上进行筛选，并采用一种新颖的方法进行排序，该方法基于对木糖摄取速率和乙醇产率数据进行无量纲相对性能指数（RPI）转换。利用RPI统计参数，计算出综合相对性能平均值，以根据多个因素（包括培养条件（营养和抑制物水平不同）以及动力学特征）对菌株进行排序。通过应用这些技术，亲本菌株的衍生菌株在pH为5–6的酶解糖化水解物中表现出以下改进特性：生长前的初始滞后期缩短，葡萄糖-木糖转换期间的双相生长滞后期减少，发酵速率显著提高，乙醇耐受性增强，并可积累至40 g/L。
引言
据估计，每年约有13亿吨干重的木质纤维素生物质可用于支持乙醇生产，使美国减少30%的石油消耗。1 尽管植物生物质水解可产生富含葡萄糖和木糖的糖混合物，但为降解半纤维素并暴露纤维素以供酶解而进行的化学预处理过程会生成发酵抑制物。乙酸、糠醛和羟甲基糠醛（HMF）被认为是预处理过程中产生的多种抑制物中的关键成分。为了推动木质纤维素乙醇产业的发展，亟需开展相关研究并建立相应方法，以促进酵母菌株的进化，使其能够在抑制物存在条件下存活，并高效利用己糖和戊糖。传统工业酵母菌株（如Saccharomyces cerevisiae）的一个显著缺陷是无法有效发酵植物生物质水解物中丰富的木糖。
Pichia stipitis 标准菌株 NRRL Y-7124（CBS 5773），最近被重新命名为 Scheffersomyces stipitis，是一种天然的戊糖发酵酵母，以能够将木糖发酵为乙醇而广为人知。2,3 本研究选择 NRRL Y-7124 菌株进行进化，是因为已有文献报道该菌株在所有天然酵母菌株中最具潜力积累经济可回收水平的乙醇（超过 40 g/L），且副产物木糖醇极少。4,5,6 在最优培养基中，S. stipitis 菌株 NRRL Y-7124 在高细胞密度培养（6 g/L 细胞）条件下，40 小时内可产生 70 g/L 的乙醇（....
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方案
1. 准备测定所需的起始材料和设备
- 在预处理反应中使用18%至20%的初始生物质干重制备水解物，用于进化、分离和排序实验。有关制备用于进化、分离或排序实验的AFEX CSH、PSGHL和添加氮补充剂N1或N2的SGH的详细方法，请参见Slininger et al. 201518。各种水解物类型的组成见表1。
注意：SGH的氮强化形式定义如下：SGH-N1 = 以尿素、无维生素的酪蛋白氨基酸、D,L-色氨酸、L-半胱氨酸以及特定来源的维生素强化至摩尔碳氮比（C:N）为42:1的SGH（其中约15%的摩尔氮为伯氨基氮（PAN），约85%的氮来自尿ine）；SGH-N2 = 以尿素和豆粕作为最低成本的商品化氨基酸与维生素来源，强化至C:N为37:1的SGH，提供约12%的PAN氮和88%的尿素氮。 - 从美国农业研究服务局菌种保藏中心（ARS Culture Collection，美国伊利诺伊州皮奥里亚农业利用研究中心）获取亲本菌株Scheffersomyces stipitis NRRL Y-7124（CBS 5773）的冻干培养物，并按说明制备甘油保存菌种。将亲本酵母及其衍生菌株的保存菌种以10%甘油溶液形式保存于-80 °C。
- 将甘油保存菌种划线接种至酵母麦芽蛋白胨葡萄糖（YM）琼脂平板（3 g/L酵母提取物，3 g/L麦芽提取物，5 g/L蛋白胨，10 g/L....
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结果
S. stipitis 通过三种选择性培养环境的组合进行进化，这些培养环境包括 AFEX CSH、PSGHL 以及乙醇胁迫下的木糖连续培养。 图 1 展示了所进行的进化实验的示意图，以及筛选出的在所有测试水解物中总体表现最优或在某一种水解物上表现最佳的菌株。 表 3 列出了这些优良菌株的 NRRL 登录编号，并总结了在获得各菌株所来源的富集群体过程中施加的适应性胁迫条件。部分菌株在一种或两种水解物上表现出相对更优的性能，但 11 个菌株中有 7 个在所有类型的水解物上均表现良好，尽管其中大多数菌株在进化过程中仅暴露并经受过单一类型水解物的胁迫。本研究所采用的不同进化策略的成功结果体现在 图 2–7 和 表 4 中。
图2展示了在适应性进化的第一阶段后所观察到的显著改进，该阶段通过连续传代将菌株NRR.......
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讨论
进化过程的成功依赖于多个关键步骤。首先，选择适当的选择压力至关重要，以驱动种群向实现成功应用所需的理想表型方向进化。S. stipitis 的进化过程中选择了以下选择压力，并在适当的时间施加以引导目标表型的富集：逐步增强的12%葡聚糖AFEX预处理玉米秸秆水解液（CSH），该条件迫使微生物在乙酸及低浓度呋喃醛类和其他抑制物存在下生长并发酵多种糖类；在连续培养中以木糖为碳源并逐步提高乙醇浓度，以促进木糖代谢酶的诱导，从而缩短双相生长滞后期；逐步增强的20%固体含量的PSGHL水解液，该条件迫使微生物在高浓度乙酸、呋喃类及其他抑制物存在下生长并发酵木糖。其次，在富集过程中通过冷冻保存种群样品的甘油菌种，以维持正在进化的酵母种群，这一点非常重要。这些种群的阶段性快照可长期保存，用于定期功能检测以记录进化进展，也可用于后续按需分离菌株，或在中断后重新启动进化过程。进化的第三个关键步骤是通过在便捷的选择性培养基（例如含有胁迫梯度的琼脂平板或微孔板，梯度中包含一系列水解液和/或乙醇浓度）上富集选择培养物或甘油保存的种群，从而分离出表现优异的单菌落。随后可挑选在最严苛条件下仍能生长的存活菌落，并保存以供后续表征。上述三个基本步骤可重.......
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
我们衷心感谢美国内布拉斯加州林肯市农业研究局牧草、饲料和生物能源研究组的 Kenneth Vogel 博士、Robert Mitchell 博士和 Gautam Sarath 博士为本项目慷慨提供柳枝稷材料。同时，我们感谢美国能源部通过能源部大湖生物能源研究中心（GLBRC）授予 VB 的资助（项目编号：DE-FC02-07ER64494）。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| Cellic Ctec，含有木聚糖酶（内切-1,4-） | 诺维信 | 无产品编号 | www.novozymes.com，1-919-494-3000 |
| Cellic Htec，含有纤维素酶和木聚糖酶 | 诺维信 | 无产品编号 | www.novozymes.com，1-919-494-3000 |
| 烘烤大豆粉 | 阿彻丹尼尔斯米德兰公司（ADM） | 63160 | ADM，费里斯公园路4666号，迪凯特，伊利诺伊州 1800-37-5843 |
| Pluronic F-68（表面活性剂） | Sigma-Aldrich | P1300 | Sigma-Aldrich |
| Difco 维生素测定用酪蛋白氨基酸 | 贝克顿·迪金森公司 | 228830 | 多家供应商： 例如、Fisher Scientific、VWR、Daigger |
| D,L-色氨酸 | Sigma-Aldrich | T3300 | 多家供应商 例如、Fisher Scientific、VWR、Daigger |
| L-半胱氨酸 | Sigma-Aldrich | C7352 | 多个供应商： 例如，Fisher Scientific，Sigma-Aldrich |
| Bacto 琼脂 | 贝克顿·迪金森公司 | 214010 | 多个供应商： 例如、Fisher Scientific、VWR、Daigger |
| 麦芽提取物 | Becton Dickinson and Company | 218630 | 多个供应商： 例如、Fisher Scientific、VWR、Daigger |
| 酵母提取物 | Becton Dickinson and Company | 212750 | 多家供应商： 例如、Fisher Scientific、VWR、Daigger |
| 大豆蛋白胨 IV 型 | Fluka | P0521-500g | 多家供应商 例如，Fisher Scientific，VWR，Daigger |
| 腺嘌呤, >99% 粉末 | Sigma-Aldrich | A8626 | CAS 73-24-5。可使用其他品牌。多家供应商： 例如Sigma-Aldrich、Acros Organics、MP Biomedicals LLC |
| 胞嘧啶, >99% | Sigma-Aldrich | C3506 | CAS 71-30-7。可使用其他品牌。多家供应商： 例如西格玛奥德里奇，Acros Organics，MP Biomedicals LLC |
| 鸟嘌呤，SigmaUltra | Sigma-Aldrich | G6779 | CAS 73-40-5。可使用其他品牌。多家供应商： 例如，Sigma-Aldrich，Acros Organics，MP Biomedicals LLC |
| 胸腺嘧啶，99% | Sigma-Aldrich | T0376 | CAS 65-71-4。可使用其他品牌。多家供应商： 例如，Sigma-Aldrich，Acros Organics，MP Biomedicals LLC |
| 尿嘧啶，99% | Sigma-Aldrich | U0750 | CAS 66-22-8。可使用其他品牌。多家供应商： 例如，Sigma-Aldrich，Acros Organics，MP Biomedicals LLC |
| 无水右旋糖（D-葡萄糖），分析纯（符合美国化学会标准） | Fisher Chemical | D16-500 | CAS 50-99-7。可使用其他品牌。多家供应商： 例如Acros Organics、Fisher Scientific、MP Biomedicals、Sigma-Aldrich |
| D-木糖，检测 >99% | Sigma-Aldrich | X1500 | CAS 58-86-6。可使用其他品牌。多家供应商： 例如Acros Organics、Fisher Scientific、MP Biomedicals、Sigma-Aldrich |
| 96孔平底板 | Becton Dickinson Falcon | 351172 | 多家供应商： 例如赛默飞世尔科技，VWR，戴杰 |
| Wypall L40 擦拭布 | Kimberly-Clark | 在微孔板盒中放置毛巾以吸收水分实现加湿；多家供应商 例如赛默飞世尔科技，Uline，戴杰工业 | |
| 康宁刻度耐热玻璃烧瓶，125 ml，窄口（5号塞） | 康宁生命科学玻璃 | 4980-125 | 多个供应商： 例如赛默飞世尔，VWR，戴杰 |
| Innova 42R 摇床/培养箱，2.5 cm（1"旋转 | 新不伦瑞克科学公司（1-800-631-5417） | M1335-0016 | 多个供应商： 例如，Eppendorf，Thermo-Fisher。其他具有2.5 cm（1") 可使用投掷法。 |
| 用于4块深孔MTP板的Duetz盖板夹具 | Applikon Biotechnology | Z365001700 | applikon-biotechnology.com（美国），1-650-578-1396 |
| 用于96孔深孔板的Duetz系统三明治盖 | Applikon Biotechnology | Z365001296 | applikon-biotechnology.com（美国），1-650-578-1396 |
| Duetz系统硅胶密封垫（0.8 mm黑色低蒸发），用于96深孔板盖 | Applikon Biotechnology | V0W1040027 | applikon-biotechnology.com（美国），1-650-578-1396 |
| Duetz 系统三明治盖蓝色超细纤维层 | Applikon Biotechnology | V0W1040001 | applikon-biotechnology.com（美国），1-650-578-1396 |
| 96孔，2 ml方形井锥底板，天然聚丙烯 | Applikon Biotechnology | ZC3DXP0240 | applikon-biotechnology.com（美国），1-650-578-1396 |
| Bellco 32 mm 硅胶海绵塞盖，每包25个，适用于125 ml 培养瓶 | Bellco | 1924-00032 | Thomas Scientific，其目录编号为 1203K27 |
| Bellco 旋转烧瓶，1968-玻璃罩，可密封法兰型，工作体积100 ml。此型号已停产。 | Bellco | 1968-00100（原始货号） | 夹套容器的入口较低 & 用于通过循环水浴进行温度控制的上出口端口。容器外径为75 mm，高度为200 mm。在约45°位置设有四个侧端口° 角度和一个顶部接口。接口开口尺寸适合0号氯丁橡胶塞（接口内径21-22 mm）。 |
| Mathis Labomat IR 烘干 oven | MathisAg | 型号 BFA12 215307 | Werner Mathis U.S.A. Inc. usa@mathisag.com, 704-786-6157 |
| 双通道生化分析仪 | YSI生命科学 | 2900D-UP | www.ysi.com，用于96孔微孔板格式快速糖类检测的机器人系统 |
| PowerWave XS 微孔板分光光度计 | Bio-Tek Instruments, Inc | MQX200R | www.biotek.com |
参考文献
- Perlack, R. D., Stokes, B. J. US Department of Energy. Billion-Ton Update: Biomass Supply for a Bioenergy and Bioproducts Industry. , Department of Energy. Oak Ridge National Laboratory, Oak Ridge, TN. (2011).
- Prior, B. A., Kilian, S. G., duPreez, J. C. Fermentation of D-xylose by the yeas....
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