人原代滋养层细胞培养模型研究褪黑素对缺氧/复氧诱导损伤的保护作用

摘要

本文介绍了一种独特的 体外 低氧/复氧条件下培养的免疫纯化人绒毛细胞滋养层细胞模型。该模型适用于研究潜在治疗方法（如褪黑素）对与氧化应激增加及胎盘功能异常相关的妊娠并发症的保护作用。

摘要

本方案描述了通过连续的酶消化、密度梯度离心、培养基梯度分离以及免疫磁珠纯化，从足月胎盘中分离绒毛细胞滋养层细胞的方法。如观察所示 体内，原代培养的单核绒毛细胞滋养层细胞在72小时后分化为多核合体滋养层细胞。与常氧（8% O₂）相比₂），经历缺氧/复氧（0.5% / 8% O₂）的绒毛细胞滋养层细胞₂) 经历增加的氧化应激和内在凋亡，类似于所观察到的现象 体内 在子痫前期、早产和胎儿宫内生长受限等妊娠并发症中，原代培养的绒毛滋养层细胞在缺氧/复氧条件下构成了一种独特的实验体系，有助于深入理解人类胎盘中发生改变的机制与信号通路，并推动寻找可有效防治特定妊娠疾病药物的研究。人类绒毛滋养层细胞能够合成褪黑素，并表达其合成酶及受体。由于褪黑素具有保护性的抗氧化作用，已被提出作为子痫前期和胎儿宫内生长受限的潜在治疗手段。在本文所述的原代绒毛细胞滋养层细胞模型中，褪黑素在常氧状态下对滋养层细胞无明显影响，但可恢复因缺氧/复氧而破坏的合体滋养层细胞的氧化还原平衡。因此，原代培养的人类绒毛滋养层细胞是研究褪黑素在缺氧/复氧条件下对胎盘功能保护作用机制的理想模型。

引言

在整个妊娠过程中，胎盘的细胞滋养层细胞（即单核干细胞）会迅速增殖并分化为绒毛或绒毛外细胞滋养层细胞。绒毛外细胞滋养层细胞侵入并重塑子宫壁的螺旋动脉。而绒毛细胞滋养层细胞则继续增殖、分化并融合，形成多核的合体滋养层（合胞体）¹。维持绒毛滋养层的稳态对胎儿健康和正常妊娠至关重要。事实上，绒毛滋养层介导母体与胎儿之间的氧气和营养物质交换，并产生妊娠所必需的激素。此外，合体滋养层是唯一直接与母体血液循环接触的细胞类型，提供重要的物理和免疫屏障。因此，合体滋养层必须经历凋亡并被更新，以维持稳态，防止胎盘发生病理变化^2-5。

Kliman 开发的技术 等⁶ 1986年，从人胎盘中分离原代绒毛细胞滋养层细胞的技术引发了胎盘研究领域的革命，使得研究者能够深入探讨绒毛滋养层细胞分化过程中涉及的分子机制。这一经典技术基于连续使用胰蛋白酶和DNase进行酶消化，随后通过密度梯度离心介质（聚乙烯吡咯烷酮包被的胶体二氧化硅颗粒，即Percoll）实现细胞分离，现已被公认为分离绒毛细胞滋养层细胞的金标准。该技术可通过磁性免疫纯化进一步优化，此方法依据不同类型细胞表面特定抗原表达的差异，将绒毛细胞滋养层细胞与非滋养层细胞分离开来。我们选择人类白细胞抗原ABC（HLA-ABC）作为标记物，因其在滋养层细胞膜上不表达^7,8.

胎盘是一种在妊娠期间经历....

方案

胎盘取自加拿大魁北克省蒙特利尔市CHUM-St-Luc医院无并发症妊娠的自然阴道分娩后立即获取，所有样本均在患者知情同意及伦理委员会批准（CHUM-St-Luc医院和加拿大魁北克省拉瓦尔市INRS-Institut Armand-Frappier）的情况下进行。

1. 绒毛细胞滋养层细胞的分离与纯化

1. 溶液与培养基
   1. 通过在高糖杜氏改良伊格尔培养基（DMEM-HG）中添加1% 体积比体积 抗生素（10,000 单位/毫升青霉素 G，100 毫克/毫升硫酸链霉素），4 °C 保存。
   2. 通过在DMEM-HG中添加10% 体积比体积 胎牛血清（FBS），25 mM 4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸（HEPES），1% 体积/体积 抗生素（10,000 单位/毫升青霉素 G，100 毫克/毫升硫酸链霉素），4 °C 保存。使用前将培养基预热至 37 °C。
   3. 配制 4 升生理盐水溶液（0.9% 质量/体积氯化钠）。
   4. 通过向1×HBSS（pH 7.4）中加入25 mM HEPES，制备改良型Hank's平衡盐溶液（HBSS）。
   5. 准备新鲜的消化液四瓶，每瓶含改良HBSS（按1.1.4制备）、硫酸镁（MgSO₄）、氯化钙（CaCl₂）、胶原酶II和透明质酸酶，现配现用。₄），氯化钙（CaCl₂），胰蛋白酶，....

结果

通过阴道分娩获得的正常足月胎盘中分离并免疫纯化出绒毛细胞滋养层细胞，获得 1 × 10⁸ 个活细胞。胎盘重 350 g，直径 19 cm，高 4 cm，呈盘状，胎膜透明。未发现小叶畸形。脐带为偏心附着，长度为 56 cm。通过波形蛋白（vimentin）和细胞角蛋白-7（cytokeratin-7）标记物的流式细胞术评估纯度。超过 98% 的细胞波形蛋白阴性、细胞角蛋白-7 阳性，证实了免疫纯化所得绒毛滋养层细胞的高纯度。将绒毛细胞滋养层细胞接种于 96 孔培养板中，在常氧条件下培养，并设置添加或不添加 1 mM 褪黑素的组别。通过检测 β-人绒毛膜促性腺激素（β-hCG）的分泌水平来监测绒毛细胞滋养层细胞的生化分化，方法如先前所述^1,7,20,21。通过免疫荧光染色抗桥粒斑蛋白（desmoplakin）和抗半胱天冬酶切割的细胞角蛋白 18 中间丝抗体评估细胞的形态学分化和凋亡情况^7,22。收集从第 1 天（主要为绒毛细胞滋养层细胞）至第 4 天（主要为合体滋养层细胞）的细胞培养上清液，离心后测定上清中 β.......

讨论

在哺乳动物中，胎儿发育直接依赖于胎盘功能的正常发挥。健康障碍的发育起源假说认为，成年后所表现出的疾病病因可追溯至早期发育阶段，且胎盘在胎儿程序化过程中具有机制性作用。^30-32胎盘是胎儿生长发育的关键中介器官：它调节营养物质的转运，保护胎儿免受有害暴露的影响，并具有重要的内分泌功能。该方法由 Kliman 建立 等 一种可重复的分离活体初级细胞滋养层细胞技术的建立，是研究正常与异常胎盘功能的重要里程碑⁶许多研究人员已采用此技术来重现特定条件 体外 了解胎盘生理学^18,20,33,34如Petroff所述 等，许多步骤对于确保获得高纯度且活力良好的分离细胞滋养层细胞至关重要¹⁸例如，自1988年该技术建立以来，消化步骤已进行了多项改进，包括增加消化次数和消化时间，以及调整消化酶的种类和用量，从而获得了更大量具有活性的分离细胞滋养层细胞¹⁸本方案目前具有三个主要优势：冷冻保存，使得后续继续进行实验成为可能；免疫磁珠纯化，可提高细胞滋养层细胞的纯度；以及使用预包被微孔板，以增强细胞.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
弯头梅岑鲍姆剪刀	Shandon	9212	外科手术器械（细胞分离）（2 件）
精细分裂镊 41/2 英寸	Fisherbrand	13-812-42	外科手术器械（细胞分离）（2 件）
4.5 英寸解剖剪	Fisherbrand	08-940	外科手术器械（细胞分离）（2 件）
纱布海绵 10 cm x 10 cm	Cardinal Health	361020733
长方形玻璃烤盘	Pyrex	1105397	玻璃器皿（2.8 L）
布赫纳漏斗	Coorstek Inc	10-356E	玻璃器皿（114 mm 直径）
表面皿	派热克斯	9985100EMD	玻璃器皿
中性缓冲甲醛溶液，10%	Sigma-Aldrich	HT501128-4L	组织学组织固定液
胰酶消化培养瓶	Wheaton	355395	玻璃器皿（1 个）
一次性培养管	Kimble	73750-13100	玻璃器皿
硼硅酸盐玻璃巴斯德吸管（22.8 cm）	Fisherbrand	K63B1367820C	玻璃器皿
250 ml 玻璃烧杯	Fisherbrand	KFS14005250	玻璃器皿
带盖玻璃培养基瓶	Fisherbrand	KFS14395250	玻璃器皿（8 件）
50 ml Corex 管	康宁	8422-A	（1单位）
15 ml 聚苯乙烯离心管	康宁	430791
50 ml 聚苯乙烯离心管	康宁	430829
10 ml 血清移液管	康宁	11415038
细胞筛 100 μm 尼龙	康宁	431752
吸水垫层	科学工具	1199918
500 毫升瓶 顶部滤器	康宁		孔径：0.22 µm / 培养基与HBSS的制备
2 ml 冻存管	康宁	430488
Nalgene Mr. Frosty 冻存容器	Sigma-Aldrich	C1562-1EA
蠕动泵	Pharmacia Fine Chemicals	P3 模型
摇床水浴箱	Fisher	模型 127
真空泵	ABM	4EKFS6CX-4
氯化钠	Fisherbrand	EC231-598-3	0.9% 盐水溶液
Hank’Hank's 平衡盐溶液（Hbss）	Sigma-Aldrich	H2387	数量：9.25（一管）用于1 L消化液
羟乙基哌嗪乙磺酸（Hepes）	Life Technologies	15630-080	25 ml（1 M）用于配制 1 L 消化液
胰蛋白酶 I 型	Sigma-Aldrich	T8003	9,888 U
脱氧核糖核酸酶 IV	罗氏	10-104-159-001	402,000 U
氯化钙	Sigma-Aldrich	C4901	100 mM
硫酸镁	Baker	2500-01	800 mM
杜尔贝科’s 改良伊格尔培养基高糖（DMEM）	Life Technologies	10564-045
青霉素/链霉素硫酸盐	Hyclone	SV30010
胎牛血清	康宁	35-010-CV
Percoll	Sigma-Aldrich	P1644	密度梯度离心培养基。体积：36 ml
异丙醇	顶体	42383-0010	50 ml
二甲基亚砜	Sigma-Aldrich	472301
Automacs 磁力分离器	Miltenyi Biotec	模型 003
Automacs 列	Miltenyi Biotec	130-021-101
Automacs 运行缓冲液	Miltenyi Biotec	130-091-221	http://www.miltenyibiotec.com/~/media/Images/Products/Import/0001100/IM0001131.ashx?force=1
Automacs 清洗液	Miltenyi Biotec	130-091-222	http://www.miltenyibiotec.com/en/products-and-services/macs-cell-separation/cell-separation-buffers/automacs-rinsing-solution.aspx
抗人 HLA-ABC 纯化克隆 W6/32	Affymetrix eBioscience	14-9983-82	抗小鼠抗体
抗小鼠IgG微珠	Miltenyi Biotec	130048401
多孔板  6 孔板（带盖）	康宁	3335	细胞黏附表面
多孔板  24孔板（带盖）	康宁	3337	细胞黏附表面
多孔板  96孔板（带盖）	康宁	3300	细胞粘附表面
模块化培养箱	Billups-Rothenberg	MIC-101	同时产生常氧和缺氧/复氧条件需要一组两个
单一流量计	Billups-Rothenberg	SFM3001
50 mm 一次性在线滤器	Whatman	6721-5010	聚四氟乙烯，孔径：1.0 µm
气体调节器	Pro Star	PRS301233	同时产生常氧和缺氧/复氧条件需要一组两个
气体软管 Class Vi 透明 5/16	Parker	100-05070102	3个样本，每个约0.5 m
17 mm 可调式气体软管夹	扎带	THCSS-16
常氧气体钢瓶	普莱克斯	NI CDOXR1U-K	K 型尺寸（3rd 孕早期的组成：5% CO2，8% O₂2, Bal. N2)
常氧气体钢瓶	普莱克斯	NI CDOXR1U-K	K 型（3rd 孕早期的组成：5% CO2，0.5% O₂2，Bal. N2)
Oxygen Microelectrode Mi-730	微电极公司 INC	84477
氧气适配器	Microelectrodes INC	3572
ROS检测试剂：CM-H2DCFDA	Invitrogen	C-400
β-hCG ELISA试剂盒	DRG internatinal	EIA-4115
抗波形蛋白纯化抗体	eBioscience	14-9897	宿主：小鼠
抗细胞角蛋白7（FITC）抗体	Abcam	ab119697	宿主：小鼠
Alexa Fluor 488 山羊抗小鼠 IgG H&L 抗体	Life Technologies	A-11029