植物多聚核糖体剖面的简单方法

摘要

该方案描述了一种根据结合核糖体的数量从植物组织中提取和分级分离转录物的简单方法。它允许对翻译活性进行全局估计并确定特定 mRNA 的翻译状态。

摘要

将 mRNA 翻译成蛋白质是一个基本且高度调控的生物过程。多核糖体分析被认为是分析翻译调控的金标准。这里描述的方法是从各种植物组织中分离多核糖体的一种简单而经济的方法。通过按顺序冻结每一层，无需梯度制作器即可制作蔗糖梯度。然后在含有放线菌酮和氯霉素的缓冲液中制备胞质提取物，以将胞质和叶绿体核糖体固定在 mRNA 上，并加载到蔗糖梯度上。离心后，从梯度的底部到顶部直接收集 6 个馏分，无需刺穿超速离心管。在收集过程中，连续读取 260 nm 处的吸光度以生成多核糖体谱，从而提供整体翻译活性的快照。然后合并组分以制备三种不同的 mRNA 群：多核糖体，与几个核糖体结合的 mRNA;单体，与一个核糖体结合的 mRNA;以及不与核糖体结合的 mRNA。然后提取 mRNA。该方案已针对不同的植物和组织进行了验证，包括拟南芥幼苗和成年植物、本氏烟草、番茄和水稻叶。

引言

蛋白质的合成是在所有单元电池¹的基本和大力昂贵的过程。首先，细胞必须在生产翻译机器中，核糖体的投资能量。例如，一个活跃分裂的酵母细胞产生每分钟高达2000核糖体。这样的生产需要高达总转录活性的60％，到小区²的总剪接活性的90％。此外，需要能量的氨基酸，氨酰tRNA和肽键的合成。在植物中，从三磷酸腺苷³ 4.5至5.9分子添加一个氨基酸的肽链的成本。因此，它是不奇怪的mRNA的蛋白质的翻译调控的主要部位，特别是当它涉及到处理变化的环境条件。

翻译起始的一步，那就是与一个核糖体mRNA的关联，是调控的主要对象翻译^4。作为翻译的调节的结果，以及其他转录后调控的步骤中，只有40％的蛋白质浓度的变化可通过mRNA的丰度^5,6进行说明。因此，总mRNA的研究给出了关于蛋白丰度比较差的信息。另一方面，mRNA的核糖体与关联给出更好地了解蛋白质丰度通过给访问那些参与翻译的mRNA。积极翻译的mRNA与核糖体的几个称为多聚核糖体的结构有关。相反，翻译不好的mRNA将只有一个核糖体（monosome）相关联。因此，一个mRNA的转译状态可以通过监视与核糖体⁷的关联进行评估。

这个协议描述从六个日龄拟南芥幼苗，RNA的随后分离多聚核糖体的分离，结果的分析。宝lysom​​es和monosomes通过蔗糖密度梯度分离。梯度被收集成六个馏分。一些级分的汇集，以获得三个阱分离的部分:多核糖体，monosomes和轻馏分（以下称为上清液），其中包含不与核糖体相关的自由60S和40S核糖体亚基和的mRNA。全局翻译活性可以通过产生一个多核糖/ monosome比率，这是由该曲线下的面积的积分确定来估计，并通过比较多聚核糖体轮廓。的mRNA和蛋白质，然后从不同的级分提取并用于通过RT-PCR，定量RT-PCR，Northern印迹，微阵列，蛋白质印迹或蛋白质组学分析。该协议已经过验证的其他植物和组织。

执行此协议所需的设备在大多数实验室通常发现:没有必要为一个梯度壶。添加下一个防止冻结之前每层■从层的任意组合或干扰。无管穿孔被用于其可以通过在梯度的玻璃毛细管的浸没来实现梯度集合。因此，昂贵的超速离心管保持完好，并且可以重复使用很多次。总的来说，这使得本协议核糖体分析一个简单而廉价的方法。

方案

1. 20至50％（重量/体积）蔗糖梯度制备

注意:梯度在13.2毫升超速离心管制成的蔗糖的4层（50％，35％和2层的20％）。在我们的经验，浇注在两个单独的层的20％蔗糖大大提高多核糖制剂的质量。

1. 制备储备溶液。确保所有解决方案是RNA酶和DNA酶自由。
   1. 准备10X盐溶液:400毫米的Tris-HCl pH值8.4，200毫米氯化钾和100毫米氯化镁_2。
   2. 准备2蔗糖解决方法:200毫升，溶解137克蔗糖在1X盐溶液。
2. 稀释蔗糖溶液在盐溶液，如表1中所述，制备梯度。给出的卷六个梯度。

最终蔗糖浓度	蔗糖2M（毫升）	盐溶液1X（毫升）	最终卷。 （毫升）
50％	8.8	3.2	12
35％	12.9	12.1	25
20％	7.4	17.6	25
20％	5.8	14.2	20

表1.蔗糖溶液的稀释液准备六梯度。

3. 倾各层按表2。

蔗糖层	50％	35％	20％	20％
卷。 （毫升）	1.85	3.65	3.6五	1.35

表2.卷每一层的蔗糖溶液。

4. 浇每一层后，保持管在-40℃或-80℃的冰箱中，直至完全凝固添加下一个蔗糖层之前。冷冻通常是后在-40℃下2小时完成，但建议浇注下一层之前等待约6个小时。最后20％层可以冷冻或在实验当天新鲜加入。
   注意:将在下单前冷冻每一层从层的任何混合或干扰阻止。梯度可以保持在-40℃或-80℃冷冻至少六个月。
5. 如果它尚未完成，最后的20％的层添加到梯度在实验当天。然后，让梯度在寒冷的房间或冰箱解冻。

2.胞浆​​提取物的制备

注意:我们荐最终使用每生物样品两个梯度。 300毫克是植物材料的最佳量为6天龄的拟南芥幼苗时，制备两个梯度。当用量少翻译活性的组织工作，植物材料的量可提高到600毫克。

1. 生长在半Murashige和Skoog收获6天龄幼苗⁸中由速冻在液氮中补充有1％蔗糖或等效介质
2. 研磨植物材料中预冷研钵和研杵与液氮。
3. 称量300毫克的粉状材料中预冷称量皿。快速执行此步骤，以避免样品解冻。
   注意:使冷冻样品不超过一个星期一-80℃冷冻机中。
4. 添加2.4毫升预冷多核糖缓冲液（盐溶液4X，5.26毫EGTA，0.5％（体积/体积）辛基苯氧聚（乙烯氧基）乙醇，支^50μg.ml-1酮^，50μg.ml1氯霉素）并通过与枪头混合均匀。转移到2个1.5毫升管。迅速开展工作，以防止样本升温。
5. 在微量离心机在4℃下16000×g离心15分钟以沉淀碎片。
   注:为防止RNA降解，始终保持样品在4℃下，用RNA酶/ DNA酶免费的解决方案和工作在RNA酶/ DNA酶自由的条件。肝素可以被添加到所述多核糖体缓冲器，以^300μg.ml-1的终浓度，以增强RNA的保护。然而，因为肝素可与下游分析干扰，则其在RNA的沉淀步骤通过进行氯化锂沉淀，而不是乙醇沉淀（参见注释4.7）被除去。

3.多核糖体剖面

1. 小心吸取上清液，而不会干扰沉淀。如果植物碎片已经被吸取，重复步骤2.5。轻轻pipettin加载在梯度顶部的上清克到管中的恒定流侧壁。使用一个梯度每次1.5毫升管。
2. （使用SW41转子当例如32000转）传送在4℃175,000 XG到预冷水桶和离心机2小时45分钟，在超速离心机。
3. 如在图1中的描述设置梯度收集系统，紫外比色皿具有1 mm光程。

图1.梯度收集系统。紫外比色皿由聚氯乙烯管连接到下降到梯度的底部的玻璃毛细管。梯度通过系统由于蠕动泵的进展。 OD ₂₆₀被连续读取和2ml收集级分。 请点击此处查看大图这个数字。

4. 调整馏分收集至室温，并以一定速度，将允许2毫升馏分收集设置转盘。使用预冷却收集管。
5. 从底部收集的级分使用由聚氯乙烯管连接到梯度收集系统的玻璃毛细管到顶部。使用塑料石蜡膜以固定聚氯乙烯管与玻璃毛细管之间的连接。
6. 从底部到梯度的顶部读取260nm处的吸光度。当被收集在整个梯度，放置在冰上收集管RNA提取之前。

4. RNA提取

1. 池从两个梯度中收集的级分，在50毫升加盖离心管，如下:
   多核糖体:馏分1至3个（12毫升）中
   Monosomes:级分4（4毫升）中
   上清液:馏分5和6（8毫升）中
2. 对每个级分，加入1体积。 8M盐酸胍，50微克丙烯酰基载体和1.5卷。异丙醇。
   注:压克力载体是线性的丙烯酰胺，用作共沉淀来提高核酸醇沉淀期间的恢复。
3. 反相管混合，并在-20°C沉淀O / N。
4. 离心机175,000 XG在4℃下1小时，在超速离心机（32,000 RPM在SW32转子）。如果该沉淀步骤是在管这是不符合超速离心兼容执行，转移到合适的管中。
5. 弃上清，溶解于200μl无RNase的TE缓冲液（10mM的Tris-HCl pH为7.5 - 1mM EDTA）中沉淀。转移到一个新的1.5毫升管。
6. 通过添加1体积提取的RNA。水饱和的苯酚（pH值6.6）和1体积。氯仿:异戊醇（24:1）。混合大力。离心机以15,000 xg离心在4℃下20分钟。将水相转移至新的1.5毫升管。
   注意:酸苯酚（pH4.5）中能以最小化DNA污染被使用。
7. 通过加入1/10体积沉淀RNA。 3M乙酸钠和3体积。 100％的乙醇。在-80℃20分钟或O / N在-20°C允许沉淀。离心机以15,000 xg离心在4℃下15分钟。
   注意:如果在多核糖体缓冲（参见附注2.5），使用肝素，进行氯化锂（氯化锂），而不是沉淀乙醇沉淀的正常删除的肝素的痕迹，可能与下游分析⁹干扰。萃取后，加入氯化锂至2.5 M的最终浓度允许30分钟沉淀在-20℃或O / N在4℃。离心机以15,000 xg离心在4℃下15分钟。
8. 洗用500μl75％乙醇沉淀。空气干燥沉淀，并在30微升TE缓冲液溶解。评估上的无RNA酶的1.2％琼脂糖凝胶（100V，15分钟）或通过毛细管电泳方法，通过电泳RNA的质量。

5.数据分析

1. 出口的原始数据为图形和数据分析软件。
   注意: 如图2A和B中所示，原始型材给予定性信息:可以看到多核糖峰的数量，所述monosome峰的高度，以及对应于游离核糖体亚基的肩部的存在。
2. 合并型材允许的样本之间的曲线的比较。使用屏幕阅读器工具来确定每个样本的monosome峰的X值，并通过在曲线的开头去除额外的数据点对准monosome峰。确定曲线的最低点，并确定其Y值（使​​用屏幕阅读器工具）。通过使用"组列值"功能时设定的最低点Y值0。
3. 通过从原始型材（ 图3C）的曲线下积分面积确定的多核糖体/ monosomes比。使用该数据选择器工具来定义区域的边界被集成。然后使用整合功能（分析 - 数学）。
4. 正常化除以monosome峰之巅的Y值曲线的所有数据点到monosome峰值曲线（使用屏幕阅读器工具来确定）。选择列，然后在分析，数学，选择规范和选择"按指定的值除以"的方法。此步骤允许多聚核糖体的相对水平（ 图3D）的比较。

图2代表多核糖体轮廓。 拟南芥野生型（wt，生态型Col-0中）和突变体幼苗生长下一天的光周期（16小时光照，8小时黑暗）上半MS培养基六天。答:从重量苗生多聚核糖体轮廓。 B:由突变苗生多聚核糖体轮廓。 C:多核糖和monosomes由曲线D下的面积的积分的百分比的测定:多核糖PROFI莱归到monosome高峰。 请点击此处查看该图的放大版本。

结果

在文献中，多核糖轮廓通常由轻馏分显示出重馏分作为梯度被收集的方式所致，即从顶部至底部。因为在这里描述的方案的梯度从底部到顶部收集，我们显示轮廓开始与重馏分（多核糖体），并转到所述轻馏分（游离核糖体亚基和的RNA）（ 图2A）。然后我们收集每个梯度在六个2毫升馏分，但如果多核糖体的内容更详细的分析，必须进行更小的级分可以被收集。

合并和规范曲线的峰值monosome（ 图2D）允许来自不同线或生长条件分布的比较。这提供了多聚核糖体独立引发的水平的相对量的信息。另一种方式为nalyze型材是计算曲线下的面积，从而，可以确定的mRNA与任monosomes或多核糖体（ 图2C）相关联的相对数量。这个比例是特定的植物和生长条件。然而，这种方法可能不是很差翻译活性的组织的情况下，相关的。

讨论

我们在这里介绍的方案是一种简单且廉价的方法，用于生成多核体谱并分离与多核体、单核糖体或不含核糖体相关的 mRNA。文献中描述了多种不同的多核糖体分离方法。我们在这里描述的方法已经经过优化，只保留必要的化合物，并适用于植物材料。特别是，我们减少了去污剂¹¹ 的量，并在缓冲液中加入氯霉素，以将叶绿性核糖体固定到mRNA（就像环己酰亚胺对胞质核糖体的作用一样）¹² 。我们还减少了超速离心的总时间⁷。

为了获得高质量的多核体谱，必须使用新鲜收集的植物材料并在 4°C 下执行所有步骤。当使用翻译活性较差的组织时，可以在梯度上加载更多的植物材料（高达 600 毫克）。

多核体谱的分析可以深入了解细胞¹³ 的总体翻译状态和特定 mRNA 的翻译状态。我们已将通过这种方法分离的 RNA 用于不同的应用。使用微阵列的 RNA 使我们能够识别一类转录和翻译解偶联的镉应激反应基因 ¹⁴。我们还使用这种方法来鉴定与多染色体组分相关的小 RNA...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
超速离心管，薄壁，多聚体 - 13.2 ml	Beckman Coulter	331372
超速离心管，薄壁，多聚体 - 38.5 ml	Beckman Coulter	326823
玻璃毛细管	Drummond Scientific	1-000-1000
超速离心机	贝克曼库尔特	Optima 系列
超速离心机转子 SW41	贝克曼库尔特	331362
超速离心机转子 SW32	贝克曼库尔特	369650
蠕动泵	任何
Tygon R3607 聚氯乙烯管	Fisher Scientific	070534-22	聚氯乙烯管，2.29 mm
馏分收集器 型号 2110	Bio-Rad	731-8120
紫外比色皿	Hellma	170.700-QS	石英流通比色
皿 紫外分光光度计	Varian	Cary50	每 0.0125 秒读取
所有化学品	仅供		使用任何 分子生物学级
Murashige 和 Skoog 基础盐混合物 （MS）	Sigma-Aldrich	M5524
无 RNASE 的水	任何
培养皿	Fisher Scientific	10083251
辛基苯氧基聚（乙烯氧基）乙醇，支链 （Nonidet P40）	Euromedex	UN3500
线性丙烯酰胺（丙烯酸载体）	ThermoFischer scientific	AM9520	RNA 沉淀载体
OriginPro 8	OriginLab		分析软件