一种简便的植物多聚核糖体分析方法

摘要

本方案描述了一种根据结合的核糖体数量从植物组织中提取和分级分离转录本的简便方法。该方法可用于全局评估翻译活性，并确定特定mRNA的翻译状态。

摘要

mRNA翻译为蛋白质是一个基本且高度受调控的生物学过程。多聚核糖体分析法被认为是研究翻译调控的金标准。本文所述方法是一种简便且经济的从多种植物组织中分离多聚核糖体的方案。通过依次冷冻各层即可制备蔗糖梯度，无需使用梯度混合器。在含有环己酰亚胺和氯霉素的缓冲液中制备细胞质提取物，以使细胞质和质体核糖体固定在mRNA上，随后将提取物加样至蔗糖梯度中。离心后，无需穿刺超速离心管，直接从梯度底部至顶部收集六个组分。在收集过程中连续检测260 nm处的吸光度，生成反映全局翻译活性的多聚核糖体图谱。随后将组分合并，用于制备三类不同的mRNA群体：多聚核糖体（与多个核糖体结合的mRNA）、单核糖体（与一个核糖体结合的mRNA）以及未与核糖体结合的mRNA。最后提取mRNA。该方案已在多种植物及组织中得到验证，包括 拟南芥 幼苗和成年植株， Nicotiana benthamiana，Solanum lycopersicum，以及 Oryza sativa 叶片

引言

蛋白质合成是所有细胞中必不可少且能量消耗巨大的过程¹。首先，细胞必须投入能量来生成翻译机器——核糖体。例如，一个活跃分裂的酵母细胞每分钟可产生多达2,000个核糖体。这种生产过程需要消耗细胞总转录活性的高达60%以及总剪接活性的高达90%²。此外，氨基酸、氨酰-tRNA 和肽键的合成也需要能量。在植物中，向肽链添加一个氨基酸需消耗4.5至5.9个ATP分子³。因此，mRNA向蛋白质的翻译成为调控的关键环节，尤其是在应对环境条件变化时尤为如此。

翻译的起始步骤，即mRNA与核糖体的结合，是翻译调控的主要靶点⁴。由于翻译调控以及其他转录后调控步骤的影响，仅有40%的蛋白质浓度变化可通过mRNA丰度来解释^5,6。因此，对总mRNA的研究只能提供关于蛋白质丰度的有限信息。另一方面，通过检测与核糖体结合的mRNA，可以更准确地反映参与翻译过程的mRNA情况，从而更好地了解蛋白质丰度。处于活跃翻译状态的mRNA会与多个核糖体结合，形成称为多聚核糖体（polysomes）的结构；相反，翻译效率较低的mRNA通常仅与一个核糖体结合（单核糖体，monosome）。因此，通过监测mRNA与核糖体的结合情况，可评估其翻译状态⁷。

本实验方案描述了从六天大的Arabidopsis thaliana....

方案

1. 20% 至 50%（w/v）蔗糖梯度的制备

注意：梯度由13.2 ml超速离心管中的4层蔗糖组成（50%、35%和两层20%）。根据我们的经验，将20%蔗糖分两层加入可显著提高多聚核糖体样品的质量。

1. 配制储备溶液。确保所有溶液均无RNA酶和DNA酶。
   1. 配制10X盐溶液：400 mM Tris-HCl pH 8.4、200 mM KCl 和 100 mM MgCl₂。
   2. 配制2 M蔗糖溶液：配制200 ml时，将137 g蔗糖溶解于1X盐溶液中。
2. 按照表1所述，用盐溶液稀释蔗糖溶液以制备梯度溶液。所列体积适用于制备六个梯度。

最终蔗糖浓度	2M 蔗糖溶液 (ml)	1X 盐溶液 (ml)	终体积 (ml)
50%

结果

在文献中，多聚核糖体图谱通常按照从轻组分到重组分的顺序展示，这是由于梯度组分的收集方式为从上至下所致。而本文所述方案中，梯度组分是从底部向上收集的，因此我们展示的图谱始于重组分（多聚核糖体），逐渐过渡到轻组分（游离核糖体亚基和RNA）（图2A）。随后，我们将每个梯度收集为6个2 ml的组分，但如果需要对多聚核糖体组分进行更详细的分析，也可收集更小的组分。

将曲线合并并以单体峰进行归一化图 2D）可用于比较不同品系或生长条件下的图谱，从而在不依赖起始水平的情况下获得多聚核糖体相对含量的信息。另一种分析图谱的方法是计算曲线下面积，由此可确定与单核糖体或多聚核糖体结合的 mRNA 的相对数量。图2C）。该比例因植物种类和生长条件而异。然而，对于翻译活性较低的组织，这种方法可能不适用。

讨论

本文介绍的方法是一种简便且经济的手段，用于生成多聚核糖体图谱并分离与多聚核糖体、单个核糖体或无核糖体结合的mRNA。文献中已描述了多种不同的多聚核糖体分级分离方法。本文所述方法经过优化，仅保留必要的组分，并针对植物材料进行了改良。特别是，我们减少了去垢剂的用量¹¹，并在缓冲液中添加了氯霉素，以使叶绿体核糖体固定在mRNA上（类似于环己酰亚胺对细胞质核糖体的作用）¹²。此外，我们还缩短了超速离心的总时间⁷。

为了获得高质量的多聚核糖体图谱，必须使用 freshly 收集的植物材料，并在 4°C 下完成所有步骤。当使用翻译活性较低的组织时，可增加上样量（最多 600 mg）。

多聚核糖体图谱分析可提供关于细胞整体翻译状态以及特定mRNA翻译状态的信息¹³。我们已将通过该方法分离的RNA用于多种应用。将RNA用于微阵列分析使我们鉴定出一类镉胁迫应答基因，其转录与翻译过程是去偶联的¹⁴。我们还利用该方法鉴定出与多聚核糖体组分相.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
超速离心管，薄壁，聚烯烃材质 - 13.2 ml	Beckman Coulter	331372
超速离心管，薄壁，聚烯烃材质 - 38.5 ml	Beckman Coulter	326823
玻璃毛细管	Drummond Scientific	1-000-1000
超速离心机	Beckman Coulter	Optima 系列
超速离心机转子 SW41	Beckman Coulter	331362
超速离心机转子 SW32	Beckman Coulter	369650
蠕动泵	Any
Tygon R3607 聚氯乙烯管	Fisher Scientific	070534-22	聚氯乙烯管，2.29 mm
组分收集器 Model 2110	Bio-Rad	731-8120
紫外比色皿	Hellma	170.700-QS	石英流通式比色皿
紫外分光光度计	Varian	Cary50	每 0.0125 秒读数一次
所有化学品	Any		仅使用分子生物学级试剂
Murashige 和 Skoog 基础盐混合物 (MS)	Sigma-Aldrich	M5524
无 RNase 水	Any
培养皿	Fisher Scientific	10083251
支链辛基苯氧基聚乙氧基乙醇（Nonidet P40）	Euromedex	UN3500
线性丙烯酰胺（丙烯酰载体）	ThermoFischer scientific	AM9520	RNA 沉淀载体
OriginPro 8	OriginLab		分析软件