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一种简便的植物多聚核糖体分析方法

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DOI：

10.3791/54231

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2016年8月28日

 ,  ,  ,  , 
1Laboratoire de Génétique et Biophysique des Plantes, Aix-Marseille Université, 2UMR 7265 Biologie Végétale & Microbiologie Environnementales, CNRS, 3BIAM, CEA, 4Department of Biology, Biocenter, University of Copenhagen, 5Laboratoire de Chimie Bactérienne, 6CNRS, LCB UMR 7283, Aix Marseille Université

通讯作者： Cécile Lecampion <cecile.lecampion@univ-amu.fr>

本文内容

摘要

本方案描述了一种根据结合的核糖体数量从植物组织中提取和分级分离转录本的简便方法。该方法可用于全局评估翻译活性，并确定特定mRNA的翻译状态。

摘要

mRNA翻译为蛋白质是一个基本且高度受调控的生物学过程。多聚核糖体分析法被认为是研究翻译调控的金标准。本文所述方法是一种简便且经济的从多种植物组织中分离多聚核糖体的方案。通过依次冷冻各层即可制备蔗糖梯度，无需使用梯度混合器。在含有环己酰亚胺和氯霉素的缓冲液中制备细胞质提取物，以使细胞质和质体核糖体固定在mRNA上，随后将提取物加样至蔗糖梯度中。离心后，无需穿刺超速离心管，直接从梯度底部至顶部收集六个组分。在收集过程中连续检测260 nm处的吸光度，生成反映全局翻译活性的多聚核糖体图谱。随后将组分合并，用于制备三类不同的mRNA群体：多聚核糖体（与多个核糖体结合的mRNA）、单核糖体（与一个核糖体结合的mRNA）以及未与核糖体结合的mRNA。最后提取mRNA。该方案已在多种植物及组织中得到验证，包括 拟南芥 幼苗和成年植株， Nicotiana benthamiana，Solanum lycopersicum，以及 Oryza sativa 叶片

引言

蛋白质合成是所有细胞中必不可少且能量消耗巨大的过程1。首先，细胞必须投入能量来生成翻译机器——核糖体。例如，一个活跃分裂的酵母细胞每分钟可产生多达2,000个核糖体。这种生产过程需要消耗细胞总转录活性的高达60%以及总剪接活性的高达90%2。此外，氨基酸、氨酰-tRNA 和肽键的合成也需要能量。在植物中，向肽链添加一个氨基酸需消耗4.5至5.9个ATP分子3。因此，mRNA向蛋白质的翻译成为调控的关键环节，尤其是在应对环境条件变化时尤为如此。

翻译的起始步骤，即mRNA与核糖体的结合，是翻译调控的主要靶点4。由于翻译调控以及其他转录后调控步骤的影响，仅有40%的蛋白质浓度变化可通过mRNA丰度来解释5,6。因此，对总mRNA的研究只能提供关于蛋白质丰度的有限信息。另一方面，通过检测与核糖体结合的mRNA，可以更准确地反映参与翻译过程的mRNA情况，从而更好地了解蛋白质丰度。处于活跃翻译状态的mRNA会与多个核糖体结合，形成称为多聚核糖体（polysomes）的结构；相反，翻译效率较低的mRNA通常仅与一个核糖体结合（单核糖体，monosome）。因此，通过监测mRNA与核糖体的结合情况，可评估其翻译状态7。

本实验方案描述了从六天大的Arabidopsis thaliana幼苗中分离多聚核糖体、随后提取RNA并分析结果的方法。多聚核糖体和单核糖体通过蔗糖密度梯度离心进行分离，梯度被收集为六个组分。其中部分组分被合并，以获得三个分离良好的组分：多聚核糖体、单核糖体以及轻组分（以下简称上清组分），后者包含游离的60S和40S核糖体亚基以及未与核糖体结合的mRNA。通过计算曲线下面积并比较多聚核糖体图谱，可计算多聚核糖体/单核糖体比值，从而评估整体翻译活性。随后从不同组分中提取mRNA和蛋白质，用于RT-PCR、qRT-PCR、Northern印迹、微阵列、Western印迹或蛋白质组学分析。该方案已验证适用于其他植物及组织。

执行本方案所需的设备在大多数实验室中均常见：无需使用梯度混合器。在添加下一层之前先将每一层冷冻，可防止各层之间发生混合或扰动。收集梯度组分时无需使用穿孔器，可通过将玻璃毛细管浸入梯度液中完成收集。因此，昂贵的超速离心管不会受损，可多次重复使用。综上，本方案是一种简便且经济的多核糖体分析方法。

方案

1. 20% 至 50%（w/v）蔗糖梯度的制备

注意：梯度由13.2 ml超速离心管中的4层蔗糖组成（50%、35%和两层20%）。根据我们的经验，将20%蔗糖分两层加入可显著提高多聚核糖体样品的质量。

  1. 配制储备溶液。确保所有溶液均无RNA酶和DNA酶。
    1. 配制10X盐溶液：400 mM Tris-HCl pH 8.4、200 mM KCl 和 100 mM MgCl2。
    2. 配制2 M蔗糖溶液：配制200 ml时，将137 g蔗糖溶解于1X盐溶液中。
  2. 按照表1所述，用盐溶液稀释蔗糖溶液以制备梯度溶液。所列体积适用于制备六个梯度。
最终蔗糖浓度2M 蔗糖溶液 (ml)1X 盐溶液 (ml)终体积 (ml)
50%8.83.212
35%12.912.125
20%7.417.625
20%5.814.220

表1. 蔗糖溶液的稀释比例，用于制备六种梯度溶液。

  1. 根据表 2 倒入各层。
蔗糖层50%35%20%20%
体积 (ml)1.853.653.651.35

表2. 每层蔗糖溶液的体积。

  1. 每加入一层蔗糖溶液后，需将离心管置于 -40 °C 或 -80 °C 冰箱中，直至完全冻结后再加入下一层蔗糖溶液。通常在 -40 °C 下冷冻 2 小时即可完成冻结，但建议等待约 6 小时后再加入下一层。最后一层 20% 的蔗糖溶液可预先冷冻保存，也可在实验当天新鲜配制后加入。
    注意：在加入下一层前将每一层完全冻结，可防止各层之间发生混合或扰动。蔗糖梯度可于 -40 °C 或 -80 °C 冰箱中保存至少六个月。
  2. 若尚未完成，可在实验当天向梯度中加入最后一层 20% 蔗糖溶液，随后将梯度置于冷室或冰箱中使其缓慢融化。

2. 细胞质提取物的制备

注意：我们建议每个生物样本使用两个梯度。当使用6天大的Arabidopsis thaliana幼苗时，准备两个梯度所需的植物材料最佳用量为300 mg。当处理翻译活性较低的组织时，植物材料的用量可增加至600 mg。

  1. 在含1%蔗糖或等效培养基的½ Murashige和Skoog8培养基上培养六天的幼苗，用液氮快速冷冻后收获
  2. 在预冷的研钵和研杵中加入液氮研磨植物材料
  3. 在预冷的称量皿中称取300 mg粉末状材料。此步骤需迅速完成，以避免样品解冻。
    注意：冷冻样品在-80 °C冰箱中保存不得超过一周
  4. 加入2.4 ml预冷的多聚核糖体缓冲液（盐溶液4×，5.26 mM EGTA，0.5% (v/v) 分支型辛基苯基聚(环氧乙烷)乙醇，50 µg.ml-1 环己酰亚胺，50 µg.ml-1 氯霉素），用移液器吸头混匀。转移至两个1.5 ml离心管中。操作需迅速，防止样品升温
  5. 在4 °C下，以16,000 × g离心15分钟，沉淀碎片。
    注意：为防止RNA降解，所有样品始终在4 °C下操作，使用无RNase/DNase的溶液，并在无RNase/DNase的环境中操作。可在多聚核糖体缓冲液中添加肝素至终浓度300 µg.ml-1，以增强RNA保护效果。然而，由于肝素可能干扰后续分析，需在RNA沉淀步骤中通过氯化锂沉淀替代乙醇沉淀将其去除（参见注释4.7）

3. 多聚核糖体分析

  1. 小心吸取上清液，避免扰动沉淀。若吸出植物碎片，则重复步骤 2.5。将上清液沿离心管管壁缓慢而连续地滴加至密度梯度液上方，形成分层。每 1.5 ml 离心管使用一个密度梯度。
  2. 转移至预冷的离心桶中，在 4 °C 条件下，以 175,000 × g 离心 2 小时 45 分钟（例如使用 SW41 转子时设为 32,000 rpm）。
  3. 按 图 1 所示设置梯度收集系统。紫外比色皿的光程为 1 mm。

色谱图：分光光度计装置，260 nm 紫外检测，蠕动泵，组分收集器。
图 1. 梯度组分收集系统。 紫外比色皿通过聚氯乙烯管连接至一根玻璃毛细管，该毛细管延伸至梯度液底部。梯度液在蠕动泵的驱动下流经系统。连续监测 OD260，并收集 2 ml 的组分。请点击此处查看该图的放大版本。

  1. 将组分收集器调节至室温，并设置转盘速度，以确保每管收集 2 ml 组分。使用预冷的收集管。
  2. 利用连接在聚氯乙烯管路上的玻璃毛细管，从梯度底部至顶部依次收集各组分。使用塑料石蜡膜固定聚氯乙烯管路与玻璃毛细管之间的连接处。
  3. 从梯度底部至顶部测定 260 nm 处的吸光度。当整个梯度收集完毕后，将收集管置于冰上，待进行 RNA 提取。

4. RNA 提取

  1. 将来自两个梯度的组分按以下方式收集到50 ml带盖离心管中：
    多聚核糖体：第1至第3组分（12 ml）
    单核糖体：第4组分（4 ml）
    上清液：第5和第6组分（8 ml）
  2. 向每份组分中加入1体积8 M盐酸胍、50 µg丙烯酸载体和1.5体积异丙醇。
    注：丙烯酸载体为线性丙烯酰胺，作为共沉淀剂以提高醇沉淀过程中核酸的回收率。
  3. 通过倒置混匀管子，并在-20 °C下过夜沉淀。
  4. 在超速离心机中以175,000 × g离心1小时，温度为4 °C（SW32转子中32,000 rpm）。若沉淀步骤使用的离心管不适用于超速离心，请转移至合适的离心管。
  5. 弃去上清液，将沉淀溶解于200 µl无RNase的TE缓冲液（10 mM Tris-HCl pH 7.5 - 1 mM EDTA）中，并转移至新的1.5 ml离心管。
  6. 通过加入1体积水饱和酚（pH 6.6）和1体积氯仿:异戊醇（24:1）提取RNA，剧烈混匀。在4 °C下以15,000 × g离心20分钟，将水相转移至新的1.5 ml离心管。
    注：可使用酸性酚（pH 4.5）以最大程度减少DNA污染。
  7. 通过加入1/10体积3 M乙酸钠和3体积100%乙醇沉淀RNA。在-80 °C下沉淀20分钟，或在-20 °C下过夜沉淀。在4 °C下以15,000 × g离心15分钟。
    注：若在多聚核糖体缓冲液中使用肝素（参见注2.5），则应采用氯化锂（LiCl）沉淀代替乙醇沉淀，以彻底去除可能干扰下游分析的微量肝素9。提取后，加入LiCl使其终浓度为2.5 M。在-20 °C下沉淀30分钟，或在4 °C下过夜沉淀。在4 °C下以15,000 × g离心15分钟。
  8. 用500 µl 75%乙醇洗涤沉淀，空气干燥后溶于30 µl TE缓冲液中。通过在无RNase的1.2%琼脂糖凝胶（100 V，15分钟）上电泳或毛细管电泳方法评估RNA质量。

5. 数据分析

  1. 将原始数据导出至图形与数据分析软件。
    注意：如图2A和B所示，原始图谱可提供定性信息：可见的多聚核糖体峰数量、单体核糖体峰的高度，以及是否存在对应于游离核糖体亚基的肩峰。
  2. 合并图谱，以便对不同样本间的图谱进行比较。使用屏幕读取工具确定每个样本单体核糖体峰的X值，并通过删除曲线起始处多余的數據点对齐单体核糖体峰。识别曲线的最低点，并确定其Y值（使用屏幕读取工具）。通过“设置列值”功能将最低点的Y值设为0。
  3. 通过积分原始图谱曲线下面积来确定多聚核糖体与单体核糖体的比值（图3C）。使用数据选择工具定义需积分区域的边界，然后使用积分功能（Analysis-Mathematics）。
  4. 通过将每条曲线的所有数据点除以单体核糖体峰顶点的Y值（使用屏幕读取工具确定），对曲线进行以单体核糖体峰为基准的归一化处理。选中相应列后，在Analysis-Mathematics中选择Normalize，并选择“除以指定值”方法。此步骤可实现对多聚核糖体相对水平的比较（图3D）。

蔗糖梯度多聚核糖体分析示意图；mRNA翻译分析；图中包含图表。
图 2. 典型的多聚核糖体图谱。 Arabidopsis thaliana 野生型（wt，生态型 Col-0）和突变体幼苗在长日照光周期（16 小时光照，8 小时黑暗）条件下，在 ½ Murashige 和 Skoog 培养基上生长六天。A：来自野生型幼苗的原始多聚核糖体图谱。B：来自突变体幼苗的原始多聚核糖体图谱。C：通过积分曲线下面积确定多聚核糖体和单核糖体的百分比。D：以单核糖体峰为基准归一化的多聚核糖体图谱。请点击此处查看该图的放大版本。

结果

在文献中，多聚核糖体图谱通常按照从轻组分到重组分的顺序展示，这是由于梯度组分的收集方式为从上至下所致。而本文所述方案中，梯度组分是从底部向上收集的，因此我们展示的图谱始于重组分（多聚核糖体），逐渐过渡到轻组分（游离核糖体亚基和RNA）（图2A）。随后，我们将每个梯度收集为6个2 ml的组分，但如果需要对多聚核糖体组分进行更详细的分析，也可收集更小的组分。

将曲线合并并以单体峰进行归一化图 2D）可用于比较不同品系或生长条件下的图谱，从而在不依赖起始水平的情况下获得多聚核糖体相对含量的信息。另一种分析图谱的方法是计算曲线下面积，由此可确定与单核糖体或多聚核糖体结合的 mRNA 的相对数量。图2C）。该比例因植物种类和生长条件而异。然而，对于翻译活性较低的组织，这种方法可能不适用。

我们已将该方法应用于A. thaliana的完整幼苗、幼嫩和成熟的莲座叶，以及N. benthamiana（图3C）、S. lycopersicum（图3E）和O. sativa叶片（图3D）。图谱的形态取决于生长条件、植株年龄以及所分析的组织。本实验中使用了6日龄的A. thaliana幼苗。在此阶段，翻译活性较高，图谱呈现出清晰分明的峰形（图2A和图2B）。使用A. thaliana花组织时也呈现类似结果（图3A）。当使用4周龄的A. thaliana莲座叶（图3B）时，样品主要包含完全发育的成熟叶片，其细胞基本不再分裂，因此多聚核糖体和单核糖体的总体含量较低。图谱中多聚核糖体峰数量减少，但仍保持清晰的峰形。在单核糖体峰旁的肩峰反映了大量游离的60S核糖体亚基。在其他类型的植物或组织中，多聚核糖体峰可能几乎不可见，例如使用30日龄的O. sativa叶片时（图3D）。即使参与翻译的mRNA含量极低（图谱上无法观察到多聚核糖体峰），单核糖体峰的存在仍表明分级分离操作正确完成，且可从该组分中进一步提取mRNA用于后续分析。提取RNA的质量通过琼脂糖凝胶电泳进行评估（图4）。细胞质中的25S和18S核糖体RNA应在凝胶上清晰可见。当RNA从绿色组织中提取时，对应叶绿体核糖体RNA的较低条带也应可见10。

蔗糖梯度吸收图谱；拟南芥、烟草、水稻、茄科植物叶片分析。
图 3. 来自不同植物材料和物种的多聚核糖体图谱。(A) Arabidopsis thaliana 花朵（300 mg），(B) Arabidopsis thaliana 4 周大的莲座叶（600 mg），(C) Nicotiana benthamiana（短日照条件下生长 40 天植株的幼嫩叶片 - 300 mg），(D) Oryza sativa（30 天植株的叶片 - 300 mg），(E) Solanum lycopersicum（短日照条件下生长 35 天植株的幼嫩叶片 - 300 mg）。单核糖体峰由箭头标示。请点击此处查看该图的放大版本。

电泳凝胶结果；rRNA 条带，多聚体、单体核糖体分离，RNA 分析。
图 4. RNA 质量评估。 将从 6 日龄拟南芥（Arabidopsis thaliana）幼苗地上部分提取的 RNA（500 ng）按所示组分上样至 1.2% 琼脂糖凝胶，并通过电泳（100 V，15 分钟）进行分离。箭头指示细胞质 rRNA（25S 和 18S），括号指示叶绿体 rRNA（23S 和 16S）。请点击此处查看该图的放大版本。

讨论

本文介绍的方法是一种简便且经济的手段，用于生成多聚核糖体图谱并分离与多聚核糖体、单个核糖体或无核糖体结合的mRNA。文献中已描述了多种不同的多聚核糖体分级分离方法。本文所述方法经过优化，仅保留必要的组分，并针对植物材料进行了改良。特别是，我们减少了去垢剂的用量11，并在缓冲液中添加了氯霉素，以使叶绿体核糖体固定在mRNA上（类似于环己酰亚胺对细胞质核糖体的作用）12。此外，我们还缩短了超速离心的总时间7。

为了获得高质量的多聚核糖体图谱，必须使用 freshly 收集的植物材料，并在 4°C 下完成所有步骤。当使用翻译活性较低的组织时，可增加上样量（最多 600 mg）。

多聚核糖体图谱分析可提供关于细胞整体翻译状态以及特定mRNA翻译状态的信息13。我们已将通过该方法分离的RNA用于多种应用。将RNA用于微阵列分析使我们鉴定出一类镉胁迫应答基因，其转录与翻译过程是去偶联的14。我们还利用该方法鉴定出与多聚核糖体组分相关的小RNA。该鉴定通过提取多聚核糖体组分中的RNA进行Northern印迹分析完成15，为植物中miRNA通路存在翻译调控组分提供了生化证据。在另一项研究中，通过定量RT-PCR鉴定出一条顺式天然反义转录本（cis-NAT）RNA。该cis-NAT参与磷酸盐稳态调控，并促进PHO1;2转录本的翻译16。

多核糖体分析方法的主要局限性在于无法提供核糖体在mRNA上的具体位置及其沿mRNA移动进程的信息。为克服这些限制，核糖体图谱技术应运而生17，并已成功应用于植物组织18。核糖体图谱技术借助测序技术的进步，实现了对翻译过程的全局性测量。然而，与所有基于测序的检测方法一样，其结果质量依赖于序列向基因组的比对准确性，因此聚焦于核糖体保护的小片段RNA时，难以解析重复序列区域。此外，未受核糖体保护的RNA被消化，导致3'和5'非翻译区（UTR）中所含的调控信息丢失。因此，无法区分具有不同3'或5' UTR、且翻译水平不同的转录本变体19。本文所述的多核糖体分析方法操作快速，且无需特殊技术技能。总体而言，这两种方法互为补充，可用于研究翻译调控机制。

披露

作者无任何利益冲突需要披露

致谢

本工作由法国国家科研署（ANR-14-CE02-0010）资助。感谢 Benjamin Field 博士和 Elodie Lanet 博士对稿件的审阅。感谢 Michel Terese 先生在视频编辑方面的帮助。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
超速离心管，薄壁，聚烯烃材质 - 13.2 mlBeckman Coulter331372
超速离心管，薄壁，聚烯烃材质 - 38.5 mlBeckman Coulter326823
玻璃毛细管Drummond Scientific1-000-1000
超速离心机 Beckman CoulterOptima 系列
超速离心机转子 SW41Beckman Coulter331362
超速离心机转子 SW32Beckman Coulter369650
蠕动泵Any
Tygon R3607 聚氯乙烯管 Fisher Scientific070534-22聚氯乙烯管，2.29 mm 
组分收集器 Model 2110Bio-Rad731-8120
紫外比色皿Hellma170.700-QS石英流通式比色皿
紫外分光光度计VarianCary50每 0.0125 秒读数一次
所有化学品Any仅使用分子生物学级试剂
Murashige 和 Skoog 基础盐混合物 (MS)Sigma-AldrichM5524
无 RNase 水Any
培养皿Fisher Scientific10083251 
支链辛基苯氧基聚乙氧基乙醇（Nonidet P40）EuromedexUN3500
线性丙烯酰胺（丙烯酰载体）ThermoFischer scientificAM9520RNA 沉淀载体
OriginPro 8OriginLab分析软件

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