本文描述了一种新的行为检测方法，用于研究自由活动的大黄蜂（Bombus terrestris）口器对溶液中营养物质和毒素的短期味觉反应。
本文内容
摘要
摘要
像小盾蜂（Bombus terrestris）这样的广食性传粉者在采集开花植物的花蜜时，会同时接触到营养物质和毒素。目前仅有少数研究描述了蜜蜂对食物中毒素的味觉反应，而这些实验主要采用束缚状态下的蜜蜂进行喙伸展反应测试。本文介绍了一种新的行为测定方法，用于测量自由活动的个体工蜂对营养物质和毒素的摄食反应。该方法可量化每只熊蜂摄入的溶液量，并揭示食物中的呈味物质如何影响摄食行为的微观结构。
将溶液置于微毛细管中，提供给先前已被饥饿处理2-4小时的个体熊蜂。行为过程通过数字视频记录。利用事件记录软件，对视频录像中喙（口器）位置进行连续评分，以分析取食行为的精细结构。喙的位置分为三种不同的行为类别：（1）喙伸出并接触溶液，（2）喙伸出但未接触溶液，（3）喙收拢于头部下方。此外，还估算了喙从溶液中回缩的速度。
在本实验中，通过测定溶液消耗量、取食次数、取食持续时间以及首次接触后喙的回缩速度，来评估所测试化合物的摄食刺激活性或拒食活性。
这种新的味觉检测方法将使研究人员能够测量花蜜中发现的化合物如何影响蜜蜂的摄食行为，同时也有助于研究熊蜂味觉系统的传粉生物学、毒理学和神经行为学领域的科学家。
引言
植物与传粉者之间的相互作用十分复杂。传粉者访问花朵以获取花蜜和花粉作为食物；反过来，传粉者促进植物的有性繁殖。尽管这种关系大多是互利的，但花蜜和花粉有时含有对传粉者有害的毒素或其他植物化合物1-5 。在所有情况下，花蜜和花粉中存在这些化合物的生态学意义尚不明确。该领域一个尚未解决的问题是，蜜蜂等传粉者如何能够检测并避开含有毒素花蜜的花朵。
大黄蜂物种， Bombus terrestris （林奈，1758），是一种广食性传粉昆虫，可访问多种植物的花朵，包括那些产生含毒素花蜜的植物6大黄蜂在24小时双选择实验中表现出避免摄取高浓度毒素溶液的行为。7Tiedeken 描述的这种食物消耗测定方法 等.7 结果显示蜜蜂能够检测溶液中的苦味化合物。然而，该实验无法区分味觉与摄入后的生理过程（如不适反应），后者也可能影响此时间间隔内的摄食行为。8-10.
蜜蜂的触角、口器和跗节上具有味觉感器，可用于检测化合物11-13。喙伸反射（PER）实验通过将单只蜜蜂固定在束缚装置中，随后刺激其触角感器以引发取食反射14-17。可将蜜蜂个体束缚于固定装置中，再施加刺激以诱导取食反射，借此评估其对化合物的味觉能力18,19。已有研究对PER检测方法进行了改进，用于研究触角或口器对毒素的敏感性9,20。然而，蜜蜂在被束缚过程中会承受应激，这可能影响其对化合物的反应21。
本文介绍了一种新方法，用于评估自由活动的大黄蜂对蔗糖以及奎宁的味觉行为反应。奎宁是一种生物碱，先前已有报道表明其对蜜蜂（Apis mellifera）和大黄蜂（Bombus terrestris）具有拒食性9和毒性107,22。尽管尚未在植物花蜜中发现奎宁，但该生物碱常被用作蜜蜂行为与生理研究中的厌恶刺激7,9,12,13,22。该方法通过高分辨率视频记录大黄蜂口器在喙初次接触测试溶液时的行为表现。具体而言，在2分钟的时间区间内持续记录取食行为的细微结构。在取食期间测量溶液的摄取体积，从而可将摄食量与取食行为的微观结构相关联。同时测量喙回缩的速度，作为主动回避行为的指标，进而反映摄食前的味觉识别能力。
方案
1. 采集蜂群中的蜜蜂并进行饥饿处理
注：此处描述的实验在英国纽卡斯尔大学进行 Bombus terrestris audax每次处理使用2-3个市售购买的群体。这些群体在实验室条件下（25 ± 2 °C 在持续黑暗条件下（温度28 ± 2°C，相对湿度28 ± 2%）饲养，并饲以蜜蜂采集的花粉和糖溶液 随意摄取.
- 打开蜂群出口，仅让一只蜜蜂飞出并被捕获后，立即用带打孔塑料塞的塑料管（长7 cm，内径2.8 cm）收集单独的工蜂。
- 实验前，在塑料管中将所有工蜂单独饥饿处理2–4小时，并于室温下完全黑暗环境中静置。
2. 将蜜蜂转移至容纳管及适应阶段
- 饥饿期结束后，将一只熊蜂直接从塑料小瓶转移到固定管中。固定管是一种经过改造的 15 ml 离心管（长度：119 mm；直径 17 mm），其管尖钻有一个直径 4 mm 的孔，并通过加热的解剖钢针熔化管壁塑料，将一块钢丝网（底边 8 mm；高 30 mm）固定于管内。
- 用牙科蜡将装有熊蜂的固定管固定在聚苯乙烯支架上，并在固定管两侧各固定一片纸板。目的是遮挡可能干扰实验的视觉刺激。
- 在固定管管尖正上方 5 cm 处放置一台数码显微摄像机，并将其连接至一台兼容的笔记本电脑。
- 调整固定管的位置，确保其前端至少 18 mm 处于视频画面范围内。实验开始前，先进行 3 分钟的适应期。
3. 预测试阶段：呈现一滴蔗糖溶液
- 将注射器连接至含有蔗糖溶液液滴的雌性接头（约 3.5 µl，500 mM 蔗糖溶于去离子水中）。将蔗糖溶液置于持管尖端内，以诱导蜜蜂伸出喙。
- 给予熊蜂最多 5 分钟时间摄食蔗糖液滴。若液滴未被摄食，则将该熊蜂移出实验。
- 习惯化阶段结束后开始视频记录。本研究中，以 25 倍放大率、26.7 帧/秒-1 的速率记录喙部活动。
4. 测试阶段：给予测试溶液
- 用测试溶液填充一支 100 µl 的微毛细管。将其连接至一段硅胶管（6 cm 长，内径 1 mm），并固定在显微操作器上。
- 通过一个公接头将该硅胶管连接至另一段硅胶管（6 cm 长，内径 4 mm），后者作为移液吹头使用。
- 将微毛细管置于持握管尖端 5–10 mm 处。轻轻挤压管路，使喂食溶液保持在微毛细管尖端。
- 当大黄蜂吸食完蔗糖液滴后，立即移除含有 500 mM 蔗糖溶液的注射器。
- 当大黄蜂的喙接触到微毛细管内的溶液时，开始 2 分钟的测试阶段。
- 为排除可能的蒸发影响，另准备两支微毛细管，分别装入蔗糖溶液或水，并在测试阶段以完全相同的方式进行操作。
- 每次试验前后，使用 600 dpi 的扫描仪扫描微毛细管内液面位置，以测定摄食量（图 4A）。
5. 图像分析
- 使用图像处理软件 ImageJ（版本 1.48）确定溶液消耗体积。
- 上传图像文件并放大图像（约 400%）。为设定参考比例尺，选择直线工具，在微毛细管两端之间画一条线。选择“Analyze”，然后选择“Set Scale”。在“Known distance”栏中输入毛细管的总长度，并在“Unit of length”栏中输入相应的单位。
- 再次选择直线工具，在液面两端之间画一条线。选择“Analyze”，然后选择“Measure”。在结果窗口中，液面长度将显示在“Length”列下。
- 使用以下公式计算溶液消耗体积：
其中
为微毛细管的长度，
和 
分别为测试阶段前后微毛细管内液体的测量长度。
6. 视频分析
- 使用事件记录软件（参见材料表）对每段视频的2分钟测试阶段中的取食行为进行评分。
- 首先，在记录软件的行为分类菜单中定义取食行为（即行为要素）。取食行为包括以下几类： （1）喙伸出/接触：喙伸出并接触微量毛细管内的溶液；（2）喙伸出/未接触：喙伸出但未接触微量毛细管内的溶液；（3）喙收起：喙未伸出，而是收于头部下方；（4）离开视野：熊蜂离开视频画面范围。
- 在属性菜单中将每种行为设置为“状态”且“互斥”，并持续记录2分钟时间区间内的行为。以慢动作模式（速度减慢2倍）回放视频以提高准确性。
- 使用运动追踪视频软件（参见材料表），测量首次接触测试溶液后连续两帧之间（本实验视频记录中帧间隔为37.5毫秒）喙的回缩速度。
- 上传视频文件，并跳转至喙首次接触溶液的那一帧。
- 为设定参考比例尺，选择直线工具，并在视频帧中微量毛细管的宽度上画一条线。右键单击该线，选择“校准测量”，输入毛细管的宽度及其对应单位。
- 选择“图像”，然后选择“坐标系原点”。在新窗口中点击喙的尖端，并选择“应用”。
- 选择手形移动工具，右键单击视频帧中喙尖端的追踪点，选择“追踪路径”。前进到下一帧，并将追踪点重新调整至喙的尖端位置。
- 右键单击追踪点，选择“配置”，选择“完整路径”，并在测量项中选择“速度”，然后选择“应用”。此时速度值将显示出来。
结果
该新检测方法用于测试对1 M蔗糖、1 M蔗糖溶液加1 mM奎宁以及去离子水的摄食反应。在2分钟测试阶段内，通过量化喙与测试溶液接触的持续时间、摄食行为的发生频率，以及首次接触后喙从测试溶液回缩的速度，来确定对每种处理的即时摄食反应。测试阶段结束后还测量摄取溶液的体积。本研究中，我们选用5秒作为摄食行为的判定间隔标准。图1， 参见 补充文件）基于法国先前的研究工作 等.25 使用5秒阈值来表征喙部回缩行为的 果蝇 对驱避化合物的反应25因此，我们将取食行为定义为：探出的喙与溶液接触且未被持续5秒或更长时间的无接触所中断的过程。
与单独的蔗糖和去离子水相比，在蔗糖溶液中添加奎宁明显抑制了熊蜂的取食行为，因为一旦它们检测到厌恶性物质，便会迅速离开视频图1).
在本实验中，处理因素对测试阶段喙接触的累积持续时间具有显著影响（对对数转换数据进行方差分析，F2,31 = 41, p <0.001）。与仅含蔗糖相比，含奎宁的蔗糖溶液的累计接触时间显著减少（p <0.001），但不包括去离子水p = 0.219) (图 2）。类似地，处理方式对摄食行为的累积持续时间具有显著影响（对对数转换后的数据进行方差分析，F2,31 = 27.95, p <0.001, 图 3A）。与仅含蔗糖相比，含奎宁的蔗糖摄食周期的累积持续时间显著减少（p <0.001），但与去离子水单独处理相比无显著差异（p = 0.41）。处理方式对摄食行为频率也有显著影响（泊松广义线性模型，采用对数连接函数，偏差变化量相较于 c2 分布： p <0.050），其中含奎宁的蔗糖摄入片段数量显著高于纯蔗糖p <0.01），但与去离子水处理组相比差异处于边缘显著水平（p = 0.055，原因是有一只熊蜂在水上表现出七次取食行为， 图3B）。同样，不同处理之间的喙回缩速度差异显著（对数转换数据的方差分析，F2,31 = 5.12, p <0.050）。与仅含蔗糖或去离子水的溶液相比，熊蜂在首次接触到含有奎宁的蔗糖溶液后，显著更快地将喙从测试溶液中缩回p <0.050, 图3C）。这些结果表明，奎宁会引发大黄蜂的主动回避行为。不同处理对大黄蜂消耗的溶液总体积也有显著影响（对对数转换后的数据进行方差分析，F2,32 = 62.5, p <0.001），即与蔗糖相比，含奎宁的蔗糖消耗量减少p <0.001），但不适用于去离子水（p = 0.457) (图 4B）。在测试期间，毛细管中溶液蒸发的体积可忽略不计。在实验室条件（25 ±2°C 以及28 ±2% 相对湿度），蒸发量在0.033至0.033到 0.883 µl 平均为 0.276 µl 和 0.171 µl 分别为去离子水和1 M蔗糖。
在此实验中，无法避免触角与测试溶液之间的接触。然而，在测试阶段利用触角品尝饲喂溶液的熊蜂比例在不同处理间并无显著差异（蔗糖：46.1%，蔗糖加奎宁：60.0%，去离子水：33.3%）（二项分布广义线性模型，与对照相比的偏差变化） c2 分布： p = 0.450)处理对首次触角接触测试溶液与首次喙接触之间的时间间隔无显著影响（中位数：蔗糖组为2.67秒；蔗糖加奎宁组为1.10秒；去离子水组为0.80秒，对数转换数据的方差分析，F）2,13 = 0.620, p = 0.550）。此外，各处理组中蜜蜂伸出喙以品尝测试溶液的百分比保持恒定（蔗糖：66.7%；蔗糖加奎宁：50.0%；去离子水：52.2%；二项式广义线性模型，与对照相比的偏差变化） c2 分布： p = 0.840）。这些结果共同表明，在本实验中，触角在毒素检测中所起的作用较小。
另一项实验考察了是否需要将蜜蜂的测试时间延长至超过 2 分钟。在两种条件下测试蜜蜂对 1 M 蔗糖溶液或含 1 mM 奎宁的 1 M 蔗糖溶液的食物摄取量：测试时长分别为 2 分钟和 10 分钟。对于两种处理，不同测试时长下的总摄食量无显著差异，且测试时长与处理之间无显著交互作用（N = 6 - 13，对对数转换后的数据进行方差分析；处理效应：F1,31 = 54.8，p < 0.001；测试时长效应：F1,31 = 0，p = 0.979；交互作用效应：F = 0.1，p = 0.457）。综上所述，2 分钟的测试时长已足以评估溶液对熊蜂总摄食量的影响，以及本实验中对有毒或驱避性物质的抑制效应。因此，通过测量摄食量并分析摄食行为，可将总摄食量与实验过程中摄食行为的精细结构相关联。
图 1：取食实验前2分钟内喙部接触之间的潜伏期。 显示每次喙部接触1 M蔗糖溶液、1 M蔗糖+1 mM奎宁溶液以及水之间时间潜伏期的密度图。数据分别来自13只、10只和11只蜜蜂的累计结果。请点击此处查看该图的放大版本。
图 2： 摄食实验前 2 分钟内喙接触持续时间。 荒蜂取食 1 M 蔗糖、1 M 蔗糖 + 1 mM 奎宁或水溶液时的喙接触持续时间密度图。样本量同图 1。请点击此处查看该图的放大版本。
图 3：大黄蜂取食 1 M 蔗糖、1 M 蔗糖 + 1 mM 奎宁或水时的喙部活动情况。（A）测试阶段取食行为的累计持续时间，（B）取食行为的发生频率，以及（C）首次接触后的喙部回缩速度。字母标注表示存在显著差异：不同字母标注的处理组表示 P <0.05。箱线图中黑色横线代表中位数，须线表示仍处于四分位距 1.5 倍范围内的最小值和最大值，圆圈表示离群值。样本量同图 1。请点击此处查看该图的高清版本。
图4：奎宁抑制熊蜂的摄食行为。（A）微毛细管管的扫描图像，分别显示测试阶段前和测试阶段后1 M蔗糖溶液或含1 mM奎宁的1 M蔗糖溶液的液面高度（由黑线指示）。（B）测试阶段后熊蜂对1 M蔗糖、含1 mM奎宁的1 M蔗糖或去离子水的消耗量。字母标注表示显著差异：不同字母标注的处理组表示P <0.001。箱线图表示中位数（黑条）、仍处于1.5倍四分位距范围内的最低和最高数据点（须线）以及离群值（圆圈）。样本量同图1。请点击此处查看本图的放大版本。
视频图1：在测试阶段对（A）1 M 蔗糖、（B）1 M 蔗糖加 1 mM 奎宁 以及（C）去离子水 的喙活动视频记录。
讨论
通过这一新型行为检测方法，发现奎宁能够抑制黄尾熊蜂的摄食行为。熊蜂与添加了奎宁的水或蔗糖溶液接触时，喙的接触时间缩短、摄食频次降低，这被解释为对无营养或潜在有毒溶液拒绝继续摄食的表现。当奎宁被加入1 M蔗糖溶液中时，熊蜂不仅减少了摄入的液体体积，还更快地收回其喙，从而缩短了口器与含毒素溶液的接触时间。这些结果共同表明，奎宁可被熊蜂口器上的味觉感受细胞所感知，这一点与先前在蜜蜂中已确认的结果一致9。奎宁是一种对昆虫具有毒性的化合物，可在蜜蜂中引发类似不适的行为反应10，并在疟疾蚊（Anopheles gambiae）中引起击倒效应23。该检测方法有望用于鉴定熊蜂口器味觉受体细胞所感知的其他拒食性及潜在毒性化合物。
微毛细管必须装入足够体积的测试溶液，以确保在整个测试过程中持续供应。建议至少填充微毛细管的四分之三左右例如 70-80 µl）被吸入。然而，在操作过程中应避免将微毛细管完全充满，以减少在扫描及将微毛细管连接至实验装置时发生液体溢出的风险。当向熊蜂呈现500 mM蔗糖液滴时也应格外小心，避免将液滴漏入容纳管中。
持握管尖端的4 mm孔径足以让一只成年工熊蜂自然地将喙伸向测试溶液。然而，熊蜂可能在伸出喙之前已用触角感知到溶液的味道。这可能会影响喙伸展的概率，因为用糖溶液刺激熊蜂的触角即可引发伸喙反应（PER）15。事实上，膜翅目昆虫（如寄生蜂Trissolcus brochymenae）24或蜜蜂13的触角上具有味觉感器，使其能够感知糖类和奎宁等毒素。因此，触角初次接触含有强拒食性化合物（如奎宁）的溶液时，可能会降低熊蜂伸出喙的动机，从而影响实验的成功率。尽管无法完全控制触角与测试溶液的接触，但在本研究中，我们并未发现触角接触对熊蜂向测试溶液伸喙产生显著影响。在本实验中，可在预试阶段结束后立即放置微毛细管，此时熊蜂的触角仍处于持握管内，从而减少其通过触角接触测试溶液的机会。
当使用运动追踪视频软件记录首次喙接触测试溶液后喙的回缩运动时，该检测方法的主要局限性随之出现。由于视频画面仅显示喙的二维运动，因此测得的速度结果可能被低估或高估。然而，通过一些改进措施，该检测方法的这一方面可得到优化。
该实验可用于观察大黄蜂对含有不同化合物（包括天然植物次生代谢物）溶液的自然取食反应。通过本实验观察即时取食反应，可详细了解大黄蜂如何感知这些化合物。与现有的“选择-不选择”方法（如PER18,19）以及双选实验7相比，该方法具有优势，因为它能够提供多种行为反应指标，包括在一次独立取食过程中食物的摄取量。
同时测量多个参数有助于更全面地评估一种化合物的适口性。例如，在我们的实验中，大黄蜂会避免摄取含有奎宁的水或蔗糖溶液。喙的回缩可能是由于糖感受细胞的反应发生变化所致12,13。我们的实验结果显示，大黄蜂在接触蔗糖加奎宁溶液后比仅接触水时更快地回缩喙；这表明奎宁除了抑制糖感知神经元外，还可能影响另一类特定的神经元9,12,13,25。
我们的检测方法能够分析进食过程中行为反应的时间模式。已有类似方案通过测量进食时间和摄食次数来评估摄食反应。 果蝇 营养性糖与非营养性糖26我们预测，由于蜜蜂在固定管中可以自由活动，因此在本实验方法中的取食刺激反应将比其他方法（如PER）更为可靠21该技术将能够全面分析大黄蜂及其他潜在蜂类物种对营养物质和毒素的味觉阈值，从而阐明其摄食机制。
披露
作者声明无利益冲突。
致谢
本工作由勒弗休姆信托基金（RPG-2012-708）和英国生物技术和生物科学研究理事会（BBSRC）基金（BB/M00709X/1）资助，资助对象为 GAW。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 熊蜂蜂群 | 科伯特生物系统公司 | NATUPOL 蜂巢 | |
| 数码显微镜相机 | Dino-lite Europe | AM4815ZT | Dino-Lite Edge |
| 100 μl 微量毛细管 | Blaubrand IntraEND | 709144 | |
| 15 ml 聚丙烯离心管 | Fisher Scientific | 11849650 | |
| 1 ml 一次性塑料鲁尔滑动接头注射器 | BD | 300013 | |
| 戴尔 Latitude 3550 笔记本电脑 | 戴尔 | 检查与视频软件的兼容性 | |
| 佳能 CanoScan LiDE 120 | 佳能 | 检查与计算机/笔记本电脑的兼容性 | |
| Observer 软件版本 5.0.25 | Noldus | ||
| Kinovea 软件版本 0.8.15 | Kinovea | ||
| 硅胶管 | 6 厘米长度，1 毫米内 Ø &和 6 厘米长度，4 毫米内 Ø | ||
| 雄性鲁尔接头 x1/16" 标准软管接头聚丙烯接头 | Cole-Parmer | TW-45518-22 | |
| 雌性鲁尔接头 × 1/16" 标准软管接头聚丙烯接头 | Cole-Palmer | TW-45508-12 | |
| 钢丝网 | 0.5 mm 网孔尺寸 | ||
| 蔗糖（II级） | Sigma-Aldrich | S5391 | |
| 盐酸奎宁二水合物 | Sigma-Aldrich | Q1125 | |
| ImageJ 软件版本 1.48 | ImageJ |
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