本文介绍了我们制备单批次蜜蜂群体的详细方案——这是一种用于分析与角色相关的工蜂生理学的有用工具。我们还描述了用保幼激素和蜕皮激素处理工蜂的详细步骤，以评估这些激素在调控工蜂行为和（或）生理过程中的作用。
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摘要
摘要
蜜蜂工蜂参与维持蜂群活动的多种任务。工蜂的任务会随着其年龄而变化（年龄相关的劳动分工）。年轻的工蜂负责哺育幼虫（哺育蜂），而年长的工蜂则负责采集花蜜和花粉（采集蜂）。工蜂的生理状态会随着这种角色转变而发生相应变化。例如，咽下腺（HPGs）的主要功能从分泌主要蜂王浆蛋白（MRJPs）转变为分泌碳水化合物代谢酶。由于在典型蜂群中，工蜂的任务会随年龄增长而改变，因此很难区分哪些生理变化是由衰老引起的，哪些是由角色转换引起的。为了研究包括咽下腺在内的工蜂组织在角色转变过程中的生理变化，可通过建立单龄蜂群（即几乎同龄的工蜂执行不同任务）来操控蜂群组成，这种方法将非常有用。本文介绍了一种用于构建此类单龄蜂群的详细实验方案。在建立单龄蜂群后6至8天，会出现比正常情况更早执行采集任务的早熟采集蜂。代表性结果表明，咽下腺的基因表达发生了与角色相关的变化，提示咽下腺功能与工蜂角色相关。除了操控蜂群组成外，对内分泌系统的分析对于研究角色相关的生理变化也至关重要。本文还详细描述了使用20-羟基蜕皮酮（20E，蜕皮酮的活性形式）和甲基保幼激素（保幼激素类似物）处理工蜂的实验方案。经处理蜜蜂的存活率足以用于检测咽下腺中的基因表达。观察到在20E和/或甲基保幼激素处理下，基因表达发生了变化，表明激素处理可诱导咽下腺的生理变化。本文所述的激素处理方案适用于研究激素对工蜂生理的影响。
引言
欧洲蜜蜂（Apis mellifera）是一种具有高度组织化社会结构的真社会性昆虫1。工蜂（劳动阶层）承担多种任务以维持蜂群的正常运作，这些任务会随着工蜂羽化后的日龄而发生变化，这一现象被称为与年龄相关的劳动分工2-4。年轻的工蜂（<13日龄）通过分泌蜂王浆来哺育幼虫（哺育蜂），而较年长的工蜂（>15日龄）则在蜂巢外采集花蜜和花粉（采集蜂）2-4。工蜂的生理状态会随着这种角色转变而发生相应变化。例如，位于头部的一对咽下腺（HPG）作为外分泌腺，其功能会随着从哺育到采集的角色转换而改变2,5。哺育蜂的咽下腺主要合成蜂王浆主蛋白，这些蛋白是蜂乳的主要成分；而采集蜂的咽下腺则主要合成碳水化合物代谢酶，例如α-葡萄糖苷酶III，用于将蔗糖转化为葡萄糖和果糖，从而将花蜜加工成蜂蜜。我们先前的研究表明，在角色转变过程中，编码蜂王浆主蛋白的基因mrjp2以及编码α-葡萄糖苷酶III的基因Hbg3的表达水平会发生变化6-9。
为了确定工蜂组织（包括咽下腺）的生理变化是与角色转变相关，还是与工蜂的年龄相关，可通过操控蜂群的群体组成来进行研究，例如建立单龄群蜂群，使年龄几乎相同的工蜂执行不同的任务10,11。Robinson et al. (1989) 描述了一种建立单龄群蜂群的方法10。单龄群蜂群最初由一只蜂王和0-2日龄的工蜂组成。蜂群建立数天后，年龄相近的工蜂会承担不同的任务：一些工蜂像在普通蜂群中一样执行哺育任务，而另一些工蜂则比通常更早地开始执行采集任务，因此被称为早熟采集蜂。对哺育蜂与早熟采集蜂之间的基因表达进行比较，将有助于了解工蜂组织与任务相关的生理特征12-16。本文中，我们详细描述了一种用于分析咽下腺与任务和/或年龄相关生理特征的单龄群蜂群制备方案16。此外，我们还简要介绍了如何通过定量反转录-聚合酶链式反应（RT-PCR）检测 mrjp2 和 Hbg3 基因的表达水平，以评估咽下腺的生理状态。
除了分析单群体蜂群中工蜂的生理特征外，研究内分泌系统对于解析与角色相关的工蜂生理调控机制也至关重要。保幼激素（Juvenile hormone, JH）在昆虫幼虫中被称为“维持现状”激素，但在工蜂中可加速其从哺育角色向采集角色的转变11。此外，蜕皮激素（ecdysone）虽以变态过程中促进蜕皮而闻名，但也可能参与工蜂的角色转变，因为编码蜕皮激素信号分子的基因在工蜂脑的高级中枢——蘑菇体中表达17-19。因此，本文还描述了我们在先前研究中所采用的详细实验方案16，即使用20-羟基蜕皮酮（20E，蜕皮激素的活性形式）和保幼激素类似物甲氧普烯（methoprene）处理工蜂，以分析内分泌系统对咽侧体-咽下神经节（HPG）生理的影响（包括mrjp2和Hbg3的表达）。
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方案
1. 单批次群体的制备
- 准备三个蜜蜂蜂群，用于建立两个单龄蜂群，并获得足够数量的刚羽化的工蜂。
- 使用镊子打开封盖的巢房，检查巢脾边缘封盖巢房中的蛹是否具有褐色的眼睛和色素化的体壁。若边缘巢房中存在此类蛹，则整个巢脾中的大多数蛹将在约1-3天内羽化。
- 随后，在用刷子去除附着的成年工蜂后，收集含有这些蛹的巢脾，并将来自三个蜂群的巢脾混合，以最小化蜂群间的差异。
- 将收集的巢脾置于空蜂箱中，在33 °C、湿润条件（>60% 相对湿度）下孵化。从收集的巢脾中在3天内收集约6,000只刚羽化的工蜂（每个蜂群约3,000只）。
- 根据从未处理蜂群中随机选取的5只刚羽化工蜂的重量，确定工蜂数量。
- 使用称重仪器称量从未处理蜂群中随机选取的5只刚羽化工蜂。
注意：5只刚羽化工蜂的重量通常为500–600 mg。 - 通过将收集的工蜂总重量除以5只刚羽化工蜂的平均重量，估算所收集工蜂的数量。
- 使用称重仪器称量从未处理蜂群中随机选取的5只刚羽化工蜂。
- 使用水性广告颜料笔在约1,800只工蜂（每个蜂群900只）的胸部标记颜料记号。
注意：用于标记的可水洗记号笔列于材料表中。 - 将一只蜂王和约3,000只0–2日龄的工蜂引入一个含有两个巢脾的新蜂箱中，其中一个巢脾含有蜂蜜和花粉作为储备食物，另一个为空巢脾供蜂王产卵。在去除所有附着蜜蜂后，从另一个未处理蜂群中采集含有蜂蜜和花粉的巢脾。
注意：建议使用核群蜂箱（小型蜂箱）。 - 在建立单龄蜂群后6至8天，收集带有颜料标记的哺育蜂和早熟采集蜂。
- 为收集哺育蜂，选取将头部伸入巢房中照料幼虫的工蜂。使用镊子从含有大量幼虫和成年工蜂的巢脾上采集哺育蜂。
注意：若所采集工蜂的咽下腺（HPG）在按步骤1.7所述进行解剖时显示发育良好，则定义为哺育蜂。建议用镊子夹住胸部以从巢脾上取下工蜂。 - 为收集采集蜂，使用昆虫网捕捉后腿携带花粉团返回蜂巢的工蜂。
注意：若所捕获工蜂的咽下腺（HPG）在按步骤1.7所述进行解剖时呈现萎缩状态，则定义为采集蜂。
- 为收集哺育蜂，选取将头部伸入巢房中照料幼虫的工蜂。使用镊子从含有大量幼虫和成年工蜂的巢脾上采集哺育蜂。
- 在体视显微镜下通过解剖将咽下腺（HPG）分为三类：“发育良好”、“中间型”和“萎缩”。
- 将10–15只蜜蜂置于冰箱中的昆虫笼内麻醉10–15分钟，直至蜜蜂无法飞行或爬行。然后将蜜蜂转移至冰上，继续在冰上完成麻醉5分钟。
注意：达到完全麻醉状态总共约需15–20分钟。若需缩短麻醉时间，应减少每笼蜜蜂数量至1–3只。 - 使用剪刀和镊子将头部与身体分离。用大头针将头部固定在培养皿中的牙科蜡上，将两根大头针插入触角基部以固定头部。将固定好的头部浸泡于昆虫生理盐水（130 mM NaCl, 5 mM KCl, 1 mM CaCl2）中。
- 在双目显微镜下，使用精细镊子和手术刀去除头部体壁的前部。
注意：去除体壁后，咽下腺（HPG）在头部中易于识别。HPG为一种葡萄状器官，位于头部脑部周围。 - 去除体壁下方的气管组织（一种白色膜状组织），然后用镊子缓慢牵拉，将咽下腺（HPG）从头部解剖分离。
- 将具有大而圆形腺泡的咽下腺（HPG）归类为“发育良好”；将具有小而变形腺泡的咽下腺归类为“萎缩”；将不符合“发育良好”或“萎缩”特征的咽下腺归类为“中间型”。
注意：图2中展示了这三类咽下腺状态的代表性照片。 - 将“发育良好”和“萎缩”的咽下腺分别用于RNA提取，作为“哺育蜂咽下腺”和“采集蜂咽下腺”，并比较哺育蜂与采集蜂咽下腺中的基因表达差异（第4节）。
- 将10–15只蜜蜂置于冰箱中的昆虫笼内麻醉10–15分钟，直至蜜蜂无法飞行或爬行。然后将蜜蜂转移至冰上，继续在冰上完成麻醉5分钟。
2. 注射20E
- 按照步骤1.6.1所述方法，从典型蜂群中采集哺育蜂。
注意：这些蜜蜂无法用于检测咽下腺（HPGs），因为蜜蜂将被继续饲养。 - 将蜜蜂置于冰箱中4 °C条件下进行麻醉（不要使用冰块）。
注意：大约需要30分钟才能达到麻醉效果。若麻醉时间缩短，应减少每个蜂笼中的蜜蜂数量至1–3只。 - 使用镊子将蜜蜂固定在培养皿中的牙科蜡上。
- 使用玻璃微电极拉制仪制备的校准毛细玻璃微量移液管作为注射针头，向蜜蜂头部前部注射1 µl的20E溶液。
- 将20E溶于乙醇-昆虫生理盐水（130 mM NaCl，5 mM KCl，1 mM CaCl2）混合液（体积比1:4），配制成浓度为2.5 µg/µl的溶液。
- 将注射针头连接至一段橡胶管，并在橡胶管另一端连接一个黄色微量移液器吸头。
- 用微量移液器将1 µl的20E溶液滴加至石蜡膜上，用嘴含住黄色微量移液器吸头，将溶液吸入注射针头中。
- 将注射针头插入蜜蜂触角基部，通过吹气经由黄色微量移液器吸头将溶液注入。
注意：本步骤所示方案为典型的注射方法，但必要时建议使用自动注射仪以确保操作安全20。
- 将注射后的蜜蜂置于昆虫饲养笼中，在黑暗且湿润（>60%相对湿度）的环境中，于33–36 °C（理想温度为35 °C）条件下饲养1天或3天。提供蜂蜜与水按1:1比例配制的混合液供蜜蜂取食。如需，可在注射后统计存活蜜蜂数量。
3. 保幼激素类似物（甲氧普烯）的应用
- 用刷子去除典型蜂群巢脾上附着的成年蜜蜂后，收集含有蛹的巢脾。将巢脾置于33–36 °C（理想温度为35 °C）、湿度较高（>60% 相对湿度）的条件下孵化，时间不超过1天。
- 从收集的巢脾中采集刚羽化的蜜蜂，使用广告颜料按照单批次蜂群制备方案所述方法在其胸部标记记号。将标记后的蜜蜂放回原蜂群。
- 6天后，从蜂群中采集带标记的工蜂（6日龄）。用镊子夹住其胸部从巢脾上取下带标记的工蜂。
- 按照步骤2.2的方法，将蜜蜂置于4 °C冰箱中（非冰上）进行麻醉。用镊子将蜜蜂固定在培养皿中的牙科蜡上，使用微量移液器将1–5 µl溶解于丙酮中的保幼激素类似物（methoprene）溶液（50–250 µg/µl）滴加至其头部。应使用耐丙酮的滤芯吸头。
注意：丙酮可能对蜜蜂产生有害影响，导致死亡。若观察到蜜蜂死亡率较高，建议将丙酮用量至少减少至1 µl。 - 将处理后的蜜蜂置于昆虫饲养笼中，在33–36 °C（理想温度为35 °C）、黑暗且湿润（>60% 相对湿度）的条件下饲养7天。提供蜂蜜与水按1:1比例配制的混合物供蜜蜂取食。如需记录，可在施加处理后统计存活蜜蜂数量。
注意：本文中，在施加处理7天后统计存活蜜蜂数量（表3）。
4. RNA 提取与定量 RT-PCR
- 按照步骤 1.7.1 至 1.7.4 所述方法麻醉蜜蜂并解剖咽下腺（HPG）。
- 将解剖得到的 HPG 组织收集到置于干冰上的微量离心管中，并在 -80 °C 下保存直至使用。
- 加入 400 µl 蛋白变性试剂。
注意：该试剂为市售产品（参见材料表）。 - 使用配备适用于微量离心管的匀浆杵的手持式电动匀浆器匀浆 HPG 组织。在冰上以约 300 rpm 的转速匀浆 1 分钟，以破碎并裂解组织细胞。
注意：该手持式电动匀浆器为市售产品（参见材料表）。 - 加入 80 µl 氯仿，充分混匀。在室温下孵育 5 分钟。
- 在 4 °C 条件下以 14,170 × g 离心 15 分钟，将水相转移至新管中。加入等体积的异丙醇和 1 µl 甘油（5 mg/ml）。在 -20 °C 下孵育至少 20 分钟。
- 在 4 °C 条件下以 14,170 × g 离心 10 分钟，弃去上清液。
- 向沉淀中加入 400 µl 75% 乙醇，充分混匀，在 4 °C 条件下以 14,170 × g 离心 15 分钟，弃去上清液。重复该步骤一次。
- 将沉淀在空气中干燥 5–10 分钟，然后溶于 10 µl 无 RNase 的水中。
注意：沉淀完全干燥可能导致 RNA 沉淀难以溶于水中，因此略微湿润的沉淀更适宜溶解。 - 使用 NanoDrop 或类似分光光度计测定 RNA 浓度。
- 取 500 ng 总 RNA，加入 2.0 U DNase I，在 37 °C 孵育 30 分钟，以降解可能存在的基因组 DNA 污染。
- 取 200 ng 经 DNase I 处理的 RNA 进行逆转录，并使用市售试剂盒（参见材料与试剂表中的列表）及基因特异性引物（mrjp2；5'-AAATGGTCGCTCAAAATGACAGA-3' 和 5'-ATTCATCCTTTACAGGTTTGTTGC-3'，Hbg3；5'-TACCTGGCTTCGTGTCAAC-3' 和 5'-ATCTTCGGTTTCCCTAGAGAATG-3'）进行实时 PCR。PCR 程序如下：[95 °C × 30 秒 + (95 °C × 5 秒 + 60 °C × 15 秒 + 72 °C × 20 秒) × 45–55 个循环]。
- 以延伸因子1α-F2（EF1α˗F2）或核糖体蛋白49（rp49）9,16,21,22的转录水平作为内参进行标准化。这些基因为使用 qRT-PCR 分析 HPG 中基因表达的可靠对照基因。
- 使用统计学软件对两个实验组之间（哺育蜂 vs. 早熟采集蜂、20E 处理蜂 vs. 对照蜂、甲氧普烯处理蜂 vs. 对照蜂）的差异进行双尾 t 检验，以检测显著性差异。
注意：若 F 检验显示方差齐性，可采用 Student's t 检验；若不满足方差齐性，则应采用 Welch's t 检验。
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结果
制备同龄蜂群的实验方案概览如图1A所示。图1B展示了从建立同龄蜂群到样品采集的实验时间进程。根据哺育行为或采集行为的行为标准，从同龄蜂群中采集符合条件的工蜂，并评估这些工蜂的咽下腺（HPG）发育情况。表1将HPG发育程度按大小分为三类：“发达”、“中间”和“萎缩”。这三类HPG的代表性照片见图2。结果表明，根据本方案所述标准，哺育蜂和早熟采集蜂在同龄蜂群中均被观察到。咽下腺中mrjp2和Hbg3的表达分别在哺育蜂和早熟采集蜂中富集，表明咽下腺功能与工蜂的角色相关（图3）16。
向工蜂头部注射20E的操作步骤如图4所示。在20E实验前，分别于注射后1、5和7天统计存活的蜜蜂数量，以检测注射昆虫生理...
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讨论
单群落的制备
本文描述了我们在先前研究16中所采用的实验方案，用于制备单群龄蜂群，以分析与工蜂角色转变相关的咽下腺（HPG）生理状态。在单群龄蜂群中可观察到符合步骤1.6–1.7及图2所述标准的哺育蜂和早熟采集蜂（表1）。图2中的照片可作为咽下腺状态分类的参考依据。基于工蜂行为和咽下腺发育状况的双重标准，适用于在典型蜂群中定义哺育蜂或采集蜂。在这些蜂群中，从哺育到采集的角色转变是逐步进行的：在角色转变过程中，工蜂从事哺育行为的时间逐渐减少，而从事采集行为的时间则逐渐增加2。因此，仅依据行为标准难以获取 exclusively 从事哺育或采集行为的工蜂样本。本研究结果显示，咽下腺中mrjp2和Hbg3基因的表达与工蜂角色密切相关，这明确表明本文所述方案可用于分析单群龄蜂群中哺育蜂和早熟采集蜂的咽下腺生理状态（图3）。基于工蜂行为与咽下腺发育的双重标准，同样适用于定义单群龄...
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
本研究得到了日本文部科学省（MEXT）科学研究费补助金（B类）以及创新领域研究“系统分子行为学”项目的资助。T.U. 获得了日本学术振兴会青年科学家研究费的资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| UNIPOSCA | Mitsubishi pencil | PC-5M | 用于蜜蜂标记的记号笔 |
| 20-羟基蜕皮酮 | Sigma Aldrich | H5142 | |
| 甲氧普烯 | Sigma Aldrich | 33375 | |
| 昆虫繁育箱 | IRIS OHYAMA | CP-SS | |
| 电动匀浆器 | ISO | 23M-R25 | 组织匀浆 |
| TRIZol试剂 | Invitrogen | 15596-026 | 总RNA提取试剂 |
| DNase I | Takara | 2270A | |
| PrimeScript RT试剂盒 | Takara | RR037A | 逆转录试剂 |
| SYBR Premix ExTaq II | Takara | RR820A | 实时PCR试剂 |
| LightCycle 1.2 仪器 | Roche | 12011468001 | 实时PCR仪器 |
| LightCycle 毛细管 (20μl) | Roche | 4929292001 | 实时PCR耗材 |
参考文献
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