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采用化学与生态毒理学多方法联用评估废水处理工艺去除雌激素活性效能

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DOI：

10.3791/54243

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2016年9月11日

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1Institute of Environment Health and Societies, Brunel University London, 2Department of Chemistry, Carnegie Mellon University

本文内容

摘要

内分泌干扰物（EDC）对水生环境构成重大风险。市政污水处理厂是地表水中雌激素活性的主要来源。本文提供的方法可用于评估污水处理工艺在去除内分泌干扰物方面的有效性和适用性。

摘要

内分泌干扰物对水生环境构成重大风险。乙炔雌二醇（EE2）和雌酮（E1）最近已被列入欧洲水框架指令的环境污染物监测清单。市政污水处理厂是地表水中雌激素活性的主要来源。污水处理厂（WWTP）出水中大部分的雌激素活性可归因于类固醇雌激素（包括雌二醇（E2）、EE2 和 E1）的排放，这是由于处理过程中对这些物质的去除不完全所致。评估污水处理工艺的有效性需要对各单一物质进行定量测定，通常采用化学分析方法完成。最常用的方法包括使用多反应监测（MRM）的气相色谱-质谱联用（GCMS/MS）或液相色谱-质谱联用（LCMS/MS）。尽管这些方法在监管方面非常有用，但靶向化学分析仅能提供所监测化合物（及特定代谢物）的数据。生态毒理学方法则可进一步通过测量其生物活性，评估处理过程中产生的副产物或存在的未知雌激素类化合物。多种 体外 包括酵母雌激素筛查（YES）在内的生物测定法可用于测量废水样品的雌激素活性。化学分析与 体内 和 体外 生物测定法为评估废水处理工艺在去除雌激素类内分泌干扰物方面的有效性和适用性提供了有用的工具箱。本文采用一系列化学和生态毒理学测试方法，在实验室和现场研究中对常规、先进及新兴的废水处理工艺进行评估。

引言

关于内分泌干扰物对野生动物生殖健康的不良影响的担忧，已促使欧盟根据《水框架指令》（WFD）将两种雌激素物质（雌二醇和乙炔雌二醇）列入"监测清单"。内分泌干扰物涵盖多种化学类别，包括天然和合成类固醇雌激素、药物、农药、工业化学品以及消费品中的成分，这些物质已被证实对野生动物具有不良影响。其中一些化合物可能对人类健康产生潜在影响1。

研究表明，污水处理厂（WWTP）的出水对鱼类具有雌激素活性2，因此许多受纳水体也对鱼类表现出雌激素效应3。这一现象最早通过英国全国性调查得以证实，调查发现野生雄性鱼类血液中卵黄原蛋白浓度升高（一种雌性特异的卵黄蛋白前体4），并且在正常情况下为雌雄异体的鱼类物种中，普遍存在间性现象（即雄性鱼类的睾丸中出现卵子发育和/或雌性生殖导管）5,6。

传统的污水处理通常是一个三阶段过程，包括初步筛滤，随后进行一级和二级处理，以去除溶解性和悬浮性有机物。对每种内分泌干扰物（EDC）的去除效果取决于物质的理化性质以及所采用处理工艺的有效性。对于许多内分泌干扰物而言，通过吸附和生物降解可实现显著但不完全的去除。三级处理（如砂滤）可有效提高内分泌干扰物的去除率7，而采用高级氧化技术（例如臭氧）或活性炭的深度处理则可实现接近完全的去除7。

评估任何用于废水处理的新技术时，都需要确定该工艺在去除内分泌干扰物（EDC）方面的有效性。一系列测试包括目标化学分析以及利用生态毒理学测试 体内 和 体外 生物测定法为此目的提供了全面的数据。尽管靶向化学分析在监管方面非常有用，但仅能提供有关被监测化合物（及特定代谢物）的数据。生物测定法还可额外允许 "检测" 代谢物及治疗过程中产生的废水中转化副产物的不良影响，若不加以检测则可能被忽视8,9本文描述了采用一系列化学和生态毒性实验室检测方法，评估多种先进及新兴污水处理工艺在去除原污水、处理后污水及受纳水体中雌激素活性效力方面的效果。

方案

伦理声明：评估化学品/混合物在鱼类中内分泌干扰活性的实验方案已获得伦敦布鲁内尔大学动物福利与伦理审查委员会（AWERB）以及英国动物健康办公室根据《1986年动物（科学程序）法案》的批准。

1. 水样采集、保存与提取

  1. 样本采集与保存
    1. 使用前，用合适的表面活性清洁剂清洗瓶子。清洗后，用水冲洗瓶子，沥干并干燥。
    2. 使用含有0.5 g硝酸铜(II)和6 ml 3.6 M盐酸溶液组成的防腐剂的2 L容量玻璃瓶采集样品。样品储存于以下条件 10 °C采集并保存后，应尽快进行提取和分析。
  2. 样品提取与净化（用于甾体雌激素分析）10
    1. 固相萃取（SPE）
      1. 在提取之前，为减少悬浮物，使用滤膜过滤水样 1 µm 孔径滤纸
        1. 过滤后，向 spike 样品中加入内标 100 µl 加入含有2,4,16,16-d的氘代内标储备溶液4-雌酮：2,4,16,16-d4-17β-雌二醇（E2）：以及 2,4,16,16-d4-17α-乙炔雌二醇（EE2）（均在 40 µg/L 在甲醇中）加入1,000 ml出水（或100 ml进水），使污水出水样品的内标加标浓度为2 ng/L，污水进水样品的内标加标浓度为20 ng/L。
      2. 将一次性阀衬管、苯乙烯-二乙烯苯固相萃取小柱及小柱储液槽安装至固相萃取装置上。开启真空泵，检查设备密封性是否良好。
      3. 将5 ml乙酸乙酯移入每个储液槽中，以润洗固相萃取柱。开启真空泵（压力低于10 inHg，使流速低于每分钟10 ml），抽吸液体。注意不要让固相萃取柱完全干燥。依次用5 ml甲醇和5 ml水重复上述步骤。
      4. 向每个滤芯储液槽中加水至满，并连接1/8" 将PTFE管连接在滤芯储液槽与玻璃样品瓶之间。开启真空泵，调节流速至每分钟10 ml以下，使整个样品通过滤芯。根据需要及时清空废液瓶。
      5. 在真空条件下（或使用空气或氮气）彻底干燥固相萃取柱，直至柱内填料颜色发生变化例如， 从深棕色到浅棕色。
      6. 将洁净干燥的10 ml玻璃收集瓶放入支架中，并置于萃取装置内。检查每个衬管是否位于收集瓶上方。用移液器向每个样品储液槽中加入8 ml二氯甲烷，开启真空泵（流速小于10 ml/分钟），使液体抽入收集瓶中。
      7. 从固相萃取装置中取出10 ml小瓶，使用浓缩仪将体积浓缩至1 ml。将每个样品转移至自动进样器小瓶中，并进一步浓缩至 100 µl 使用氮气吹扫设备。
    2. 凝胶渗透色谱（GPC）净化
      1. 注射 95 µl 将洗脱的样品提取物注入配备 GPC 的 HPLC，采用上述描述的条件 表1. 将GPC提取物浓缩至 200 µl 使用浓缩器和氮吹装置浓缩后，用正己烷定容至2.0 ml。
    3. 固相萃取净化
      1. 将一次性阀衬管、氨基丙基柱和柱储液管连接至固相萃取装置。将洁净干燥的10 ml玻璃收集管放入支架中，并置于萃取装置内部。用移液器向每个储液管中加入2 ml己烷，以润洗柱子。让液体流经柱子。
      2. 将GPC样品提取物用移液器加入储液池中，再次让液体流经小柱。收集流出的样品洗脱液于小瓶中，并从流路装置上取下。请勿丢弃洗脱液。
      3. 将一个新的洁净干燥的10 ml收集管放入支架中，并置于萃取 manifold 内。为清洗柱子，在储液槽中加入2 ml正己烷-乙酸乙酯（30% v/v），使液体通过柱子。再重复加入2 ml正己烷-乙酸乙酯，弃去所有洗涤液。
      4. 将最初的10 ml收集瓶（步骤1.2.3.2）放回收集架内的萃取装置中。用移液器将2 ml乙酸乙酯-丙酮溶液（50% v/v）加入储液池中，开启真空泵（压力低于2 inHg，使流速低于每分钟2 ml），将液体抽滤至收集瓶中。再用另外2 ml乙酸乙酯重复上述操作一次。
      5. 取出样品瓶，使用浓缩器将提取液体积浓缩至1 ml。将样品转移至较小的玻璃小瓶中，并使用氮吹浓缩设备将提取液蒸发至近干。
      6. 添加 100 µl 加入甲醇并充分混匀。将提取物转移至自动进样瓶（含0.3 ml插入管），盖上瓶盖。使用LCMS/MS分析样品（见第2节）。
色谱柱： PL gel, 50 A, 300 x 7.5 mm, 5 µm
保护柱：PL gel, 50 x 7.5 mm, 5 µm
流动相：二氯甲烷
流速：1 ml/min
柱温：25 °C
紫外检测器：210 nm
进样体积：95 µl
进样模式：标准模式
吸取速度：500 ml/min
排出速度：500 ml/min
吸取位置：3 mm
收集的馏分：3 ml 馏分（7 - 10 分钟）收集于 10 ml 小瓶中

表1. 提取后废水中样品凝胶渗透色谱（GPC）净化的条件与参数。 该表列出了GPC色谱柱、流动相、温度、进样体积和检测器波长。

  1. 样品提取（用于酵母雌激素筛查）
    1. 按照第1.2.1.1节所述过滤样品。将一次性阀衬管、C18固相萃取柱（SPE柱）和柱储液管安装到SPE装置上。开启真空泵，检查设备是否密封良好。
    2. 向每个储液管中加入5 ml甲醇，以润洗C18萃取柱。开启真空（调节至约5 inHg，使流速约为每分钟5 ml），让液体流过萃取柱，中途暂停1分钟。注意不得让萃取柱完全干燥。随后用HPLC级水或重蒸水（ddH2O）重复此步骤。同样注意不得让柱子干涸。
    3. 按照第1.2.1.4节所述方法提取水样。继续抽真空至少30分钟，以彻底干燥萃取柱。
    4. 将洁净干燥的10 ml收集管放入提取装置的试管架中。检查每个衬管是否位于收集管正上方。向每个储液管中加入5 ml甲醇。开启真空（最大流速5 ml/min），使液体通过萃取柱流入收集管，中途暂停2分钟。
    5. 在使用YES检测法分析前，用氮气将提取物浓缩至近干，然后用500–1,000 µl乙醇重新溶解。密封样品管盖以防止蒸发，并在4 °C（防爆冰箱）中保存。

2. 使用液相色谱-串联质谱法进行化学分析

  1. 根据制造商的说明优化液相色谱-串联质谱（LCMS/MS）系统的运行条件。
  2. 使用液相色谱和质谱条件分析校准标准溶液、样品提取物、空白样品以及分析质量控制（AQC）样品，并监测表2中详细列出的离子跃迁。利用内标法测定样品提取物中类固醇雌激素的浓度10。
液相色谱-质谱联用（LCMS）
液相色谱
色谱柱：C18(2)，150 × 4.6 mm，5 μm。
进样体积：20 µl
流速：0.5 ml/分钟。
流动相：溶剂 A：含 0.1% 氨水的水溶液。
溶剂 B：乙腈。
梯度程序：
时间（分钟）010182428
A:B 溶剂比例90:10:0050:50:000.4791670.47916790:10:00
质谱分析
离子源： 电喷雾电离（负离子模式）
气源与源参数： CUR：20 psi，GS1：70 psi，GS2：30 psi
TEM：600 °C，CAD 气体：5，IonSpray 电压：-900
 多反应监测（MRM）跃迁：
  E1： 269/145 & 269/143
  E2： 271/145 & 271/143
  EE2： 295/145 & 295/143
  E1-D4 ： 273/147
  E2-D4： 275/147
  EE2-D4： 299/145 

表2. 废水中甾体雌激素的液相色谱-串联质谱分析的详细参数和条件。 该表格列出了样品进样体积和流速、流动相条件及梯度洗脱程序。

3. 使用雌激素活性检测 体外 酵母雌激素筛查（YES）实验8

  1. 根据表3 (a) 至 (g)准备并储存基本培养基及培养基组分。
(a) 最小培养基（pH 7.1）：
制备 Fe2(SO4)3 通过加入40 mg的Fe溶液2(SO4)3 至50 ml双蒸水（ddH₂O）2O)
加入 1 L ddH₂O2O 至一个 2 L 玻璃烧杯
将以下组分加入烧杯中：
13.61 g KH2PO4
1.98 g (NH4)2SO4
4.2 g KOH
0.2 g MgSO₄4
1 ml 的 Fe2(SO4)3 溶液
50 mg L-亮氨酸
50 mg L-组氨酸
50 mg 腺嘌呤
20 mg L-arginine-HCl
20 mg L-甲硫氨酸
30 mg L-酪氨酸
30 mg L-异亮氨酸
30 mg L-赖氨酸盐酸盐
25 mg L-苯丙氨酸
100 mg L-谷氨酸
150 mg L-缬氨酸
375 mg L-丝氨酸
将烧杯置于加热搅拌器上，加入磁力搅拌子，搅拌至完全溶解
检查pH值是否为7.1，必要时进行调节
使用50 ml无菌注射器将45 ml等分试样分装至带金属螺旋盖的玻璃瓶中
在最小培养基中进行灭菌 121 °C 在高压灭菌锅中处理 10 分钟
室温保存
(b) D-(+)-葡萄糖：
配制20% w/v的ddH₂O溶液2O
将20 ml等分试样分装至带金属螺旋盖的玻璃小瓶中
葡萄糖溶液的灭菌 121 °C 在高压灭菌锅中处理10分钟
室温保存
(c) L-天冬氨酸：
配制 4 mg/ml 的母液于 ddH₂O 中2O
将20 ml等分试样分装至带金属螺旋盖的玻璃小瓶中
在121℃下对L-天冬氨酸溶液进行灭菌 °C 在高压灭菌锅中灭菌10分钟
室温保存
(d) 维生素溶液： 
将2 mg生物素加入100 ml去离子水中，配制生物素溶液。2O
称取 8 mg 硫胺素、8 mg 吡哆素、8 mg 泛酸、40 mg 肌醇。将所有干燥组分与 20 ml 生物素溶液加入 180 ml ddH₂O 中2O
通过0.2-μm滤器过滤，制备10 ml无菌分装液µm 孔径一次性滤器过滤至无菌玻璃瓶中，在层流空气操作柜内进行
储存于 4 °C
(e) L-苏氨酸： 
制备 100 ml 浓度为 24 mg/ml 的 L-苏氨酸溶液，使用 ddH₂O 作为溶剂。2O
将10 ml等分试样分装至带金属螺旋盖的玻璃小瓶中
在121℃下对L-苏氨酸溶液进行灭菌 °C 在高压灭菌锅中灭菌10分钟
室温保存
(f) 硫酸铜(II)：
配制 25 ml 20 mM 硫酸铜(II) 溶液于 ddH₂O 中2O
 通过0.2-μm滤器过滤，制备5 ml无菌分装样µm 孔径滤器过滤至无菌玻璃瓶中，在层流柜内操作
室温保存
（g）氯酚红-β-D-半乳吡喃糖苷（CPRG）：
配制 25 ml 浓度为 10 mg/ml 的 CPRG 溶液于 ddH₂O 中2O
通过0.2-μm滤器过滤，制备5 ml无菌分装液µm 在超净工作台中将孔径滤膜过滤至无菌玻璃瓶中
储存于 4 °C

表3. 酵母雌激素筛选实验；最低培养基及其组分的制备与储存。

  1. 10倍浓缩酵母培养物的制备与保存
    1. 第1天，制备生长培养基（详见3.4.1），倒入无菌锥形瓶中。从-20 °C保存的冻存管中取出125 µl 10倍浓缩酵母加入培养基中。将接种后的培养基于28 °C在摇床中培养约24小时。
    2. 第2天，制备两瓶生长培养基（约50 ml），分别倒入无菌锥形瓶中。向每瓶培养基中加入1 ml培养24小时的酵母菌液。将接种后的培养基于28 °C在摇床中培养约24小时。
    3. 第3天，将每份24小时培养物转移至无菌50 ml离心管中。在4 °C、2,000 × g条件下离心10分钟。弃去上清液，将每份沉淀用含15%甘油的5 ml基础培养基重悬。将10倍浓缩酵母培养物以每管0.5 ml分装至1.2 ml无菌冻存管中，于-20 °C保存，最长可保存4个月。
  2. 标准曲线用化学储备液的制备与保存
    1. 所有玻璃器皿和药匙均用无水乙醇冲洗两次，并在使用前晾干，以去除任何污染物残留。
    2. 在粉末称量柜中将E2直接称入玻璃小瓶中，并用无水乙醇定容调节浓度。稀释至浓度为2×10-7 M（54.48 µg/L）。密封后于4 °C（防爆冰箱中）保存。
  3. 检测实验操作
    1. 第0天，制备生长培养基。向45 ml基础培养基中加入5 ml葡萄糖溶液、1.25 ml L-天冬氨酸溶液、0.5 ml维生素溶液、0.4 ml L-苏氨酸溶液和125 µl硫酸铜(II)溶液。将生长培养基倒入无菌锥形瓶中。
      1. 向锥形瓶中加入125 µl 10倍浓缩储备液（从-20 °C取出解冻），将接种后的培养基于28 °C在摇床中培养约24小时。
    2. 第1天，标记一个无菌96孔“稀释板”，并用乙醇进行E2标准曲线及待测化学品/出水提取物（例如，EE2）的系列稀释（每步100 µl）。
    3. 标记无菌96孔光学平底微孔板“检测板”。每块板均需包含空白孔（含/不含溶剂）和E2标准曲线，以及待测化学品/出水提取物的测试孔行。
    4. 将各浓度（E2、化学品或提取物）取10 µl加入检测板相应孔中。向检测板的每个“溶剂空白”孔中加入10 µl乙醇。打开检测板盖，使溶剂挥发至干。
    5. 制备一瓶生长培养基（约50 ml），每瓶加入0.5 ml氯酚红-β-D-半乳吡喃糖苷（CPRG）溶液。使用酶标仪在620 nm处测定24小时培养物的浊度，以确定酵母细胞密度。从24小时培养物中取4×107个酵母细胞接种至检测培养基中。
    6. 将接种后的检测培养基倒入无菌储液槽中。使用多通道移液器向96孔检测板的每孔加入200 µl接种后的检测培养基。
    7. 盖上96孔检测板盖，并用封口膜密封边缘。在振荡器上剧烈震荡2分钟，随后置于通风加热培养箱中32 °C孵育。
    8. 第2天，在振荡器上剧烈震荡检测板2分钟，然后放回32 °C培养箱中继续孵育。
    9. 第4天，在振荡器上剧烈震荡检测板2分钟。静置约1小时后，使用酶标仪在540 nm（CPRG最大吸收波长约575 nm）和620 nm（用于浊度校正）测定检测板的吸光度。如需，可将板置于室温下稍后读数。
  4. 雌激素活性计算
    1. 使用以下公式对吸光度读数进行浊度校正：校正值 = 样品或标准品（E2）在540 nm处的吸光度 - [样品或标准品（E2）在620 nm处的吸光度 - 空白在620 nm处的吸光度]。绘制E2标准曲线并设置适当空白对照（以检查是否存在污染）8。
    2. 使用校正后的样品（提取物或化学品）数据计算“雌二醇当量”。根据绘制的E2标准曲线数值及回归方程（根据拟合情况选择三参数多项式或线性方程），将样品/提取物的吸光度值插值为E2当量值。结合浓缩倍数（即，水样提取体积与提取物重悬所用乙醇体积之比），计算原始样品中的雌激素活性。

4. 利用实验室方法评估雌激素活性 在体 内 雄性肥头 minnow 卵黄原蛋白诱导

  1. 使用雄性胖头 minnows（Pimephales promelas) >4个月大，表现出第二性征（即，婚配结节和背部脂肪垫的发育）表明雄性性别决定。
    1. 为防止产卵行为，需将性成熟雄性个体分隔开三周± 在试验开始前3天，准备至少两个45 L的玻璃水族箱，最大养殖密度为3 g/L。为确保试验中有足够数量的健康鱼类，至少使用100尾雄鱼。
    2. 将雄性鱼置于与试验中所经历的相同环境条件下饲养（即，水温25 ± 1 °C 以及16:8小时的光照:黑暗光周期）。维持每个水箱的稀释水流量，确保每6至8小时至少完成95%的水体更换。 即， 45 L 水箱的流速为 330 ml/min。
  2. 测试装置与实验设计
    1. 使用大型玻璃水族箱，以容纳每升水体最多3克鱼类的饲养密度。对于8条成年雄鱼（每条约4.5克），应使用10-20升的水族箱。
      1. 每种处理使用两个重复的水箱，并将每个水箱屏蔽以避免任何不必要的视觉干扰（即， 在 tanks 之间使用层压卡片隔板。使用研究编号、暴露浓度和容器识别编号标记每个 tank。
    2. 用于废水排放研究
      1. 到达后，立即将流出液转移至10 ℃的储液罐中 ± 1 °C收到出水后两小时内开始给药。
      2. 通过蠕动泵将流出液从 10 °C 将储罐中的液体转移至驯化容器中。将驯化容器中的出水加热至18 ± 2 °C. 将驯化容器中加热后的出水抽入加药/混合容器，然后转移至饲养鱼类的测试水族箱中。将水族箱加热至25℃ ± 1 °C.
    3. 用于化学加药研究
      1. 在粉末称量柜中称取测试化学品。使用ddH₂O配制高浓度化学储备液。2O 最好在不使用溶剂的情况下进行。
        注意：如果需要使用溶剂来溶解待测化合物，除稀释水对照外，还需设置溶剂对照。
      2. 通过流量控制装置，将温控储水罐中的稀释水以重力流或泵送方式输送至加药/混合容器。使用蠕动泵系统将浓缩化学原液输送至加药/混合容器。调节原液化学试剂的泵送速率和稀释水的流速，以达到目标暴露浓度。
        注意：使用硅胶管将水/测试化学品从给药/混合容器输送至每个测试容器。流速应足以在至少24小时内实现75%的容器体积置换。 即， 20 L 水箱保持 20 ml/min 的流速。维持流速于 ± 规定标称值的10%。
    4. 保持暴露罐水温为25 ± 1 °C，溶解氧高于空气饱和值的70%（5.8 mg/L）-1 在 25 °C）和 ± 0.5 个 pH 单位（起始 pH 在 6.5 至 8.5 之间）在整个研究过程中保持。设定光照条件为 16 小时光照：8 小时黑暗的光周期，黎明和黄昏过渡期各为 20 分钟。
    5. 每天两次用新鲜解冻的成年丰年虾投喂鱼类（卤虫) 在 2.5 (± 每 tank 每次投喂 0.1 g。同时每天投喂一次热带鱼flake饲料，用量为两指捏取的小量。每次投喂之间至少间隔 3 小时。
      1. 每日记录投喂情况，以监测摄食反应/行为（与对照组相比，判断为良好、中等或较差）。每周至少两次（最好每天）用虹吸法清理容器，以去除未摄食的饲料和粪便。每周至少清洁一次试验容器的侧壁和底部。
    6. 每周从每个水箱中采集水样，以通过酵母筛选法检测雌激素活性，并通过分析化学方法检测化学成分。有关水样采集、提取和分析的详细信息，请参见第1-3节。
      注意：每次实验均需设置稀释水对照组（阴性对照）、阳性对照（E2 或 EE2）以及至少三个浓度梯度的出水样（100%、50% 和 25%）或受试化学品，以监测剂量-效应关系。若测试新型技术，应使用经处理与未经处理的化合物/出水样进行对比例如，未处理的EE2，含TAML/过氧化氢（H₂O₂）的EE22O2处理12; 图1).

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图1. 实验设计示意图 体内 fathead minnow 卵黄原蛋白生物测定法用于确定去除 17 种环境毒性的效果α-使用TAML/过氧化物水处理技术降解乙炔雌二醇。 实验装置由八个11 L的玻璃水族箱组成，每个水族箱均持续通入水流。单独的化学储备液和水（过滤去氯水）被输送至混合室。混合容器中的名义浓度（不考虑反应）为2 ng/L EE2、80 nM TAML和 0.16 µg/L H2O2. 化学品储备液（EE2，H2O2 以及 TAML）分别配制并分别投加，使反应在混合容器中开始。每次反应接触约 45 分钟后，将鱼类（每缸 8 条雄性黑头软口鲦）暴露于反应混合物中。每周从暴露缸中采集水样。从基线组（研究开始时）及其他所有鱼类在暴露 21 天后采集血浆样品，用于测定雌激素生物标志物卵黄原蛋白（VTG）。具体处理组为：“-C”：阴性对照组（仅稀释水）；“+”：EE2 阳性对照组；“+H”：EE2 加 H2O2，'+T'；EE2 加 H2O2 加TAML。该图已根据Mills修改 等 201512. 请点击此处以查看此图的放大版本。

  1. 测试程序
    1. 适应期
      1. 测量每条性成熟雄性鱼的湿重（g），并随机分配至各个鱼缸中（每缸8条雄鱼）。
      2. 保留同一批次中未分配的鱼，并在相同的测试条件下维持饲养。在7天的适应期内，若任何鱼出现身体损伤或状态不佳的迹象，可用这些鱼进行替换。确保在适应期结束时，每个处理组鱼缸中均有8条已完全适应测试条件的雄鱼。
      3. 从同一批次的雄鱼中额外选取8条，采集“基线”血浆样本。按照第4.4节中的采血方法以及第4.5节中的卵黄原蛋白（VTG）分析方法进行操作。
    2. 适应期结束后，按照4.2.2或4.2.3节所述方法，向暴露鱼缸中输送出水或化学物质处理液，持续21天。每天在首次投喂前，观察并记录每个重复鱼缸中鱼的死亡率、行为和外观表现。记录任何异常行为或事件。
      注意：确保环境条件和投喂速率能够维持鱼类健康（参见4.2.4和4.2.5节）。
  2. 21天暴露期后的鱼类取样
    1. 取样前12小时停止喂食。
    2. 标记用于采集血液样本的微量离心管，每管加入约5 µl 抑肽酶（一种蛋白酶抑制剂），并将管子置于冰上。
    3. 通过将500 mg MS222溶解于1 L去氯水中（预先调节至25 ± 1 °C），配制500 mg/L的MS222溶液（麻醉剂）。使用1 M NaOH将MS222溶液中和至pH 7.4 ± 0.4。
    4. 将每条鱼从鱼缸中转移至含缓冲液的MS222溶液中，保持至鳃盖运动完全停止（通常为5 ± 1分钟）。
    5. 在终末麻醉状态下测量并记录叉长（mm）。使用一次性解剖刀切断尾部，用肝素化毛细管从尾动脉采集血液（图2）。小心地将血液转移至预先标记的微量离心管中，并保持在冰上。
    6. 采血后立即处死鱼类。通过循环系统的永久性停止和/或脑组织破坏来确认死亡。测量并记录鱼的总重量（精确至0.01 g），并根据需要解剖组织。
    7. 在采血后2小时内对血液进行离心（4 °C下7,000 × g离心5分钟）。使用移液器将血浆上清液转移至新标记的0.4 ml微量离心管中，并保持在冰上。离心后30分钟内将含血浆的管子置于干冰上冷冻，并在分析血浆VTG浓度前储存在-80 °C条件下。

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图2. 雄性胖头 minnow（Pimephales promelas），血浆采集和睾丸定位。 在21天暴露期结束后，应处死所有鱼类以采集血液样本。在实施终末麻醉后，应立即测量鱼类体长（叉长，mm），随后迅速从尾动脉采集血液。 光-A：红色虚线表示尾部截除位置（应使用一次性手术刀进行尾部截除）。 光-B 显示一支用于采集血液的肝素化血细胞比容管。每条鱼在采集完血样后应立即处死，本例中为将整个头部从身体上切断（光化学）。鱼处死后，可打开体腔以暴露内脏器官。图C显示了鲤科鱼类精巢（性腺）相对于 swim bladder（SB）的位置。 例如， 胖头 minnow，roach，鲤鱼， 等等。 请点击此处以查看此图的放大版本。

  1. 使用专为胖头鲦鱼设计的同源卵黄蛋白原（VTG）酶联免疫吸附测定（ELISA）试剂盒测定血浆中VTG的浓度。
    1. 按照生产商提供的说明书配制VTG标准品和缓冲液。将血浆样本按1:50、1:5,000和1:500,000稀释，并设复孔进行检测，以获得处于VTG标准曲线范围内的读数。根据生产商的指导计算卵黄蛋白原浓度。

5. 利用In Vivo 卵黄原蛋白及拟鲤（Rutilus rutilus）间性现象诱导评估先进/新型废水处理技术对雌激素活性的削减效果

  1. 捕获污水处理厂排放口下游野生roach鱼
    注意：使用蜚蠊（Rutilus rutilus）或其他丰富的淡水或咸淡水鱼类物种，这些鱼类为雌雄异体，且已知对雌激素类内分泌干扰物敏感。
    1. 根据具体情况，采用电捕、网捕、陷阱捕捞或其他公认的捕鱼方法捕获鱼类13将鱼置于充氧的水箱中运回实验室进行取样。
    2. 按照4.4.2节所述准备微量离心管。按4.4.3节所述配制含缓冲液的MS222。按4.4.4节所述对鱼类进行麻醉。
    3. 在终末麻醉下测量鱼的体长和体重。
    4. 从尾动脉采集血液，使用一次性肝素化注射器。每条鱼在采集血样后立即处死。将血液小心分装至预先标记的微量离心管中，并置于冰上保存。按步骤4.4.7所述方法制备血浆，并通过ELISA法测定VTG（4.5）。
    5. 用镊子从每条鱼身上取下2-3片鱼鳞，放入分别标记的小型纸信封中。将信封置于室温干燥条件下保存，用于后续鱼类年龄鉴定和生长分析。
    6. 用手术刀切开体腔以暴露内脏器官。取出肠道以显露位于两侧各有一个性腺的 swim bladder（鳔）。图2）。用精细的尖头镊子小心取出成对的性腺，并放入玻璃小瓶中。以1:10的组织与固定剂比例加入Bouin固定液覆盖性腺。
    7. 根据组织大小，将组织置于Bouin's固定液中6-24小时（固定液渗透速度为每小时1毫米）。固定完成后，倒去Bouin's固定液，更换为70%工业甲基化酒精（IMS）。将固定后的组织在室温下保存，直至进行组织病理学处理（第5.3节）。
  2. 基于野外评估的雌激素活性检测方法 体内 鲤鱼卵黄原蛋白与间性诱导
    1. 实验设计与建立
      注意：应在实验前尽早搭建好水箱和中试装置 在体 开始工作。在向系统添加鱼类前3-4周启动水箱循环。监测水流速度、水质和环境条件（pH、温度、溶解氧， 等等。定期检查以确保参数能够维持。
      1. 构建大型水箱（例如在中试装置现场设置体积为300-1,000 L的水箱，可并行接入“对照”去氯自来水、标准处理出水和深度处理出水。将空气泵或曝气器连接至水箱，调节水流速度，确保每日至少完成6次水箱体积的换水。
        注意：确保水箱具有良好的隔热和遮阴措施，以防止温度在一天内出现过大波动。水箱设计应便于观察鱼类行为变化（如摄食减少、 等等。），疾病症状及死亡率。
    2. 将鱼场的蟑螂鱼袋放入相应水族箱中漂浮1小时以开始暴露。逐渐向袋中加入水族箱中的水，直至袋内水温及水质条件与水族箱环境一致。随后将鱼释放到各自的水族箱中。
    3. 成年雅罗鱼每日投喂颗粒大小为0.5−0.8的颗粒鱼饲料；幼年雅罗鱼每日投喂颗粒大小为100−300的无雌激素颗粒饲料14 自由采食，根据未食用饲料量进行调整。每日记录饲喂情况，包括摄食反应/行为（与对照组相比，良好、中等或较差）。
    4. 每周从每个水箱中采集水样，以确认雌激素活性和化学成分。有关水样采集和分析方法的详细信息，请参见第1-3节。
  3. 鱼类性腺的组织病理学15
    1. 用镊子小心地将已解剖并固定的性腺（见步骤 5.1.6 和 5.1.7）从容器中取出，置于切板上。
    2. 使用切片刀将每个性腺切成三部分（前部、中部和后部），并从每部分切取3-5 mm厚的横切片。将全部六个组织块小心放入已标记的塑料活检包埋盒中，并按照所列时间表放入组织处理仪中处理。 表 4.
    3. 石蜡包埋组织，并用旋转式切片机切片（3-5 μm）。将切片转移至标记好的生物粘附涂层载玻片上，并将载玻片置于加热板上（设定温度为 45 °C干燥24小时。
    4. 使用手动或自动染色仪，按照下述时间进行染色 表5在染色组织上滴加一滴封片剂，并将玻璃盖玻片覆盖于封片剂上，以保护组织。
    5. 首先，在低倍镜下（20X， 即 2倍物镜，10倍目镜放大倍数）用于确定性别及与体腔的附着点数量15记录每条鱼的任何异常情况。
    6. 在更高倍数（100X 或 400X）下观察组织，以评估配子发生阶段、异常情况以及睾丸组织中卵母细胞的存在。采用以下分级系统记录间性程度的严重性，范围从 0（正常雄性组织）至 7（100% 卵巢组织）。6 （参见 表6).
步骤编号处理目的时间（小时）
170% IMS脱水3
290% IMS脱水2.5
395% IMS脱水1.5
4100% IMS脱水1.5
5100% IMS脱水1.5
6100% IMS脱水1.5
7100% IMS脱水1.5
8组织学透明剂透明1.5
9组织学透明剂透明1.5
10组织学透明剂透明1.5
11WAX浸蜡1.25
12WAX浸蜡1.25
总计 20 小时

表4. 组织病理学石蜡浸渍组织的处理程序。 组织应使用自动组织处理机进行处理。组织应浸入指定溶液中，并按所规定的时间进行处理。

染色编号染色剂用途时间（分钟）
1Histology Clearing agent溶解石蜡15
2100% IMS水化2
390% IMS水化2
470% IMS水化2
5TAP WATER (RUNNING)冲洗2
6HAEMOTOXYLIN使细胞核染成蓝色10
7TAP WATER (RUNNING)去除多余染液10
8Acidified IMS脱氯20 秒
9TAP WATER (RUNNING)冲洗20 秒
10LiCO3盐溶液20 秒
11TAP WATER (RUNNING)冲洗20 秒
121% EOSIN (AQUEOUS)使细胞质染成粉红色20 秒
13TAP WATER (RUNNING)去除多余染液5
1470% IMS脱水2
1590% IMS脱水2
16100% IMS脱水5
17Histology Clearing agent去除 IMS，作为封片介质5

表5. 鱼类性腺组织苏木精-伊红（H & E）染色所用溶液及浸染时间。 应按顺序将载玻片依次放入各溶液中，并保持指定时间。对组织进行H & E染色，旨在评估雌激素类废水排放物对鱼类性腺发育或组织结构的影响。

评分部分描述
0正常雄性睾丸 
1多灶性卵睾体，1–5 个卵母细胞（通常为单个）散在分布于睾丸组织中 
2多灶性卵睾体，6–20个卵母细胞常以小簇状散在分布于睾丸组织中 
3多灶性卵睾，21–50 个卵母细胞成簇分布 
4>50 和 <100 个卵母细胞。该切片通常为多灶性，呈现出睾丸和卵巢组织镶嵌的形态。 
5>100 个卵母细胞，通常为多灶性，但也可能为局灶性，具有可明确识别的卵巢组织和睾丸组织区域，且与睾丸组织分离。 
6>切片中50%的性腺组织为卵巢组织，且由上皮细胞和吞噬组织与睾丸组织明显分隔。 
7切片中100%的性腺组织为卵巢组织。 

表6. 欧洲鲫鱼间性状况严重程度的评分系统。 应在光学显微镜下以20倍、100倍和400倍放大倍数检查性腺组织的组织学切片，以评估是否存在异常以及睾丸组织中是否存在卵母细胞。本表改编自Jobling et al. 20066。

结果

为了评估废水处理工艺改进的影响，或确定在现有污水处理厂加装三级处理设备时最合适的技术，以有效去除排放出水中内分泌干扰活性，不仅需要测量进入处理系统的各种关键化学组分，还必须分析可能同样具有内分泌干扰活性的降解产物。在生活污水出水中，雌激素活性最强的物质主要是类固醇激素，即雌酮（E1）、17β-雌二醇（E2）和17α-乙炔基雌二醇（EE2）5,8。类固醇雌激素主要以无活性的结合态混合物形式从人体排出16,17。这些结合型雌激素在下水道系统中通过细菌作用被大量去结合，随后在污水处理厂中进一步降解。去结合后的类固醇通过吸附至污泥或在二级处理过程中被生物降解而从废水中去除，此过程首先生成转化产物，最终可实现初始活性组分的完全矿化。对出水水流中所有单个化合物进行化学分析将十分困难、耗时且成本高昂，且无法涵盖样品中未知的活性组分。此外，各组分雌激素贡献的总和仅能反映所分析化合物样本的累积雌激素效价，若转化过程产生未知的雌激素物质，或进水来源于工业废水，则存在评估风险。将化学分析与in vivo和in vitro生态毒理学生物测定相结合，可有效解决诸如经处理污水等混合物中未知雌激素组分的检出问题。in vitro测定方法，如酵母雌激素筛查法（YES），已被广泛用于测定污水出水的雌激素活性，并帮助识别处理样品中的活性组分8,18,19。然而，in vivo与in vitro测试结果之间可能存在显著差异11，因此，针对内分泌干扰效价的处理效果对新工艺进行全面评估时，需要综合采用一系列化学分析与生态毒理学测试方法。

确定单个污水处理厂或处理工艺能否从废水中去除活性化合物，可通过化学分析实现，该过程通常在样品提取、浓缩及提取物净化后进行，多数采用液相色谱-质谱法（LCMS/MS）或气相色谱-质谱法（GCMS/MS）进行分析。化学分析所得数据可用于评估是否符合各自的预测无效应浓度（PNEC）20 或环境质量标准（EQS）21 特定化合物的分析至关重要，因此这类方法对于满足监管合规性数据要求具有重要意义。此外，与仅提供总体响应的生物方法相比，靶向或非靶向化学分析方法能够实现对单个化合物或异构体的鉴定与定量。因此，化学分析方法可对特定化合物进行评估，从而针对各个污水处理厂的具体情况，应对这些污水处理挑战。研究表明，传统污水处理（例如， 活性污泥处理厂在去除天然类固醇激素方面可具有高效性，但对合成激素EE2的去除效果通常较差。利用臭氧、颗粒活性炭（GAC）和膜技术等先进处理手段的实地研究表明，尽管成本较高，这些方法可作为末端处理方案，将EE2去除至低于预测效应水平乃至检测限以下。 图3 展示了在市政污水处理厂中试规模下采用颗粒活性炭（GAC）去除雌二醇（EE2）的效果。在市政污水处理厂开展的中试规模研究中，采用末端GAC处理工艺，结合酵母雌激素检测法（Yeast Estrogen Screen, YES）测定，同样观察到GAC处理后雌激素活性显著降低。 图4.

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图3. 高级三级处理后乙炔雌二醇去除效果的现场数据示例。 （A）按照样品保存的操作步骤，在污水处理厂（活性污泥法处理厂）完成常规处理后采集样品。（B）采用固相萃取法提取样品，并通过正相固相萃取和凝胶渗透色谱法净化，以去除干扰物质。（C）将净化并浓缩后的提取物进一步浓缩至较小体积，采用负离子电喷雾LCMS/MS在多反应监测（MRM）模式下进行分析。使用同位素标记的内标物通过内标法计算结果。在本示例中，最终活性污泥法出水中乙炔雌二醇（EE2）浓度高于预测无效应浓度（PNEC，0.1 ng/L），通过颗粒活性炭（GAC）和臭氧（O3）处理将其降至对环境安全的浓度。请点击此处查看该图的放大版本。

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图4. 酵母雌激素筛查（YES）试验板照片（A），显示样品因雌激素活性引起的颜色由黄色变为红色。根据YES试验板数据绘制的图表，显示了雌二醇标准品（B）、活性污泥工艺出水（ASP）和颗粒活性炭（GAC）处理后的废水出水样品（C）在540 nm处的校正吸光度。 每个样品均设两个重复。ASP和GAC出水样品采用第1节所述固相萃取（SPE）方法进行提取和浓缩。请点击此处查看该图的放大版本。

臭氧氧化在去除经传统工艺处理的污水处理厂出水中的类固醇雌激素及雌激素活性方面也具有高效性。臭氧能够氧化废水样品中多种有机污染物和溶解性有机物，并具备消毒特性。臭氧氧化的效果取决于水体特性，如pH值、有机物含量以及臭氧投加剂量。对于传统处理工艺难以去除的雌激素，采用0.8至2 mg O₃/L的臭氧剂量即可从废水中有效去除。3毫克/升 DOC。臭氧是一种选择性氧化剂，可与富电子位点（如不饱和碳-碳键、芳香族化合物，包括芳香醇）发生反应，因此可用于降解多种内分泌干扰物（EDC）。然而，单一化合物的去除并不一定意味着原始化合物的完全矿化。臭氧处理后的有机物可能转化为中间产物或氧化转化副产物，包括一系列低分子量、极性化合物，如醛类、酮类、羧酸、酮酸以及溴代化合物。典型例子包括溴酸盐、甲醛、乙醛和羧酸。使用 体内 和 体外 生物测定结果表明，尽管臭氧仅部分氧化某些化学物质，但其主要转化产物的雌激素活性显著降低，因此在适当剂量下应用臭氧可高效去除雌激素活性。

对废水进行深度处理的主要益处之一，是减少受纳水体中雄性鱼类的雌性化现象；这种不良效应可能导致鱼类生育力下降3。利用鱼类（例如，雅罗鱼或黑头软口鱼）暴露于废水的体内研究显示，雄性鱼的精巢中出现雌性生殖细胞或卵母细胞（例如，如图5所示）。在经过活性炭颗粒（GAC）7或臭氧22等高级处理后，鱼类中几乎检测不到或显著减少了间性个体或雄性鱼体内卵黄原蛋白（VTG）的表达。这些研究表明，臭氧氧化过程中产生的转化产物不具有雌激素活性，但这并未涉及出水毒性的评估。该问题已在其他研究中得到关注，例如Magdeburg 等23的一项研究显示，臭氧氧化副产物对虹鳟鱼具有毒性，但该毒性可通过臭氧处理后的下游砂滤工艺予以去除。

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图5. 在野外评估中暴露于废水中成年雅罗鱼（Rutilus rutilus）的正常雄性（A）和雌雄同体（B, C）性腺的显微照片。 显微照片A显示了正常雄性精巢的组织切片。显微照片B和C显示了一条暴露于活性污泥工艺废水排放物六个月的雌雄同体雄鱼的组织切片。箭头指示存在于精巢组织中的卵母细胞。每张显微照片中的比例尺代表100 µm。请点击此处查看此图的放大版本。

使用臭氧、颗粒活性炭（GAC）或膜技术进行末端处理的成本较高，因此亟需开发成本更低、可持续的替代方法以去除内分泌干扰物（EDC）。此外，吸附与分离方法仅将EDC从一相转移至另一相，而无法通过降解实现彻底消除。TAML活化剂已被开发用于催化过氧化氢氧化废水中的有机微污染物。12,24-26. 具有 H 的 TAML 激活剂2O2 有效降解纯实验室用水、市政污水处理厂出水以及加标尿液样品中的雌酮（EE2）及其他类固醇雌激素12实验室研究表明，TAML/H2O2 处理可高效去除类固醇雌激素，包括去除EE2，并显著降低测得的雌激素活性 体外 利用YES生物测定法并显著减轻鱼类雌性化 体内 使用VTG生物测定法测定（图1 和 图6).

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图6. 处理与未处理水箱水体中乙炔雌二醇（EE2）的平均浓度及雌激素活性（A），以及基线与暴露雄鱼血浆中卵黄原蛋白含量（B）。 A) 通过LCMS/MS测定EE2浓度（ng/L，深蓝色柱状图），通过 体外 酵母雌激素筛选（YES）。 B血浆卵黄原蛋白（ng/ml，浅蓝色柱状图）浓度通过定量酶联免疫吸附测定法（ELISA）在雄性黑头软口鲦鱼中进行检测。EE2化学分析结果报告为 < 0.03 ng/L EE2（即， 低于检测限（LOD）的值被视为等于一半 LOD（即， 0.015 ng/L EE2），用于计算平均值、标准误和统计分析。EE2浓度和雌激素活性为21天暴露期间采集样品的平均实测浓度。血浆VTG在暴露前（基线）和暴露21天后分别进行测定。处理方案包括：阴性对照组（仅稀释用水）、EE2+H2O2+TAML，EE2+H2O2，以及仅使用EE2的处理组。图A中的误差线表示平均值的标准误差，图B中的误差线表示标准差。图B柱状图上方的字母表示统计学上的相似性。该图已根据Mills的研究修改 等12 请点击此处以查看此图的放大版本。

讨论

污水处理厂是内分泌干扰物（EDC）进入地表水环境的主要途径。评估常规、高级或新兴处理工艺对内分泌活性去除效果的有效性，需要采用多种化学和生物检测方法。利用非靶向和靶向分析进行化学分析，可提供针对单个组分去除效果的定性或定量数据，从而能够根据环境质量标准或所分析化合物及其混合物的预测无效应浓度进行评估。

物质经处理后因矿化不完全而产生转化产物，以及废水中存在未知的生物活性组分，这些因素限制了单纯化学检测的适用性。体内和体外生物测定方法结合分析化学筛查，为评估新兴废水处理工艺对内分泌干扰物（EDC）去除效果提供了一套有效的工具。当这些检测与传统的水质参数以及其他毒理学和微生物学终点指标结合进行时，可对现有及新兴的废水处理技术进行关键性评价。

需要注意的是，基于酵母的雌激素检测方法（例如，YES）并非唯一用于测定化学品和废水中雌激素活性的体外检测手段。目前已开发出多种稳定转染的哺乳动物细胞检测方法，例如分别使用人乳腺癌细胞或宫颈肿瘤细胞的ER-CALUX27和hERα-HeLa-990328。YES已与类似的基于哺乳动物细胞的检测方法进行了比较，结果表明其在重复性、真正阳性及真正阴性雌激素识别率方面均具有相当高的水平29，尽管有时被认为灵敏度略低27。基于酵母的报告基因检测方法的一个优势在于，对于缺乏哺乳动物细胞培养丰富经验的实验室而言，YES更容易被采用，因其对生物安全控制措施和无菌操作技术的要求较低（如有需要，YES可在实验台面上进行）。而基于人源细胞的检测则需要CO2培养箱和化学发光检测仪，相比之下，YES仅需使用常规培养箱和微孔板读数仪。目前，两种基于酵母的雌激素报告基因检测方法（YES，Saccharomyces cerevisiae；A-YES，Arxula adeninivorans）正在开展多实验室联合验证试验，以支持ISO 19040标准"水质—水和废水中雌激素潜力的测定"的制定，这凸显了工业界对这些技术的关注。

所述方法存在若干局限性，包括采样、样品储存和分析过程中可能受到来自野外或实验室环境中的雌激素类物质污染，或人为污染（例如，增塑剂、表面活性剂、个人护理产品）。此类污染在酵母雌激素筛查（YES）实验（或其他基于细胞的报告基因实验）中会提高背景信号，影响实验的准确性。储存于塑料瓶中的水样或溶剂极易导致假阳性结果。假阴性结果同样值得关注，因为液相色谱-串联质谱法（LCMS/MS）和YES实验均需通过固相萃取（SPE）将雌激素浓缩至可检测水平。基质成分、SPE吸附剂的选择以及洗脱溶剂均会影响萃取效率及洗脱化合物的种类。采用本方案所述条件使用C18固相萃取小柱进行萃取时，可能会产生负偏差，因为高极性或碱性化合物在该吸附剂上的保留能力较弱。此外，本方案要求在氮气下将甲醇洗脱液完全蒸发后再用乙醇重新溶解，此过程会导致挥发性化合物的损失，从而可能低估待测样品的雌激素活性。当使用YES实验时，这些局限性尤为重要，因为未知或未预期的化合物可能因未被有效萃取或在蒸发过程中损失而被遗漏。此外，LCMS/MS技术可通过使用标记的内标校正回收率，而该方法无法应用于YES实验。

显著局限性 在 活体测试排放物相较于其他方法具有成本高、评估耗时长的特点 体外 方法。目前，利用鱼类胚胎检测雌激素活性的应用仍有限。然而，已有成功案例报道，通过构建对雌激素响应的转基因发光鱼类胚胎来实现检测30，具有潜在的应用前景。本方案所用的肥头鲦鱼是常见的实验室物种，雄性鱼类中卵黄原蛋白（VTG）的诱导是雌激素暴露的明确生物标志物，也是衡量废水中雌激素活性的可量化指标。22 或其他雌激素类化合物或混合物31经济合作与发展组织（OECD）内分泌干扰物测试指南已采用成年黑头软口鲦鱼、日本青鳉和斑马鱼进行验证32,33，其中VTG是这三种物种中雌激素暴露的敏感生物标志物。然而，VTG的诱导并不能直接反映繁殖功能受损，因此无法准确体现废水暴露所导致的生态后果，如在严重发生性反转的雅罗鱼中所观察到的情况3另一方面，由于罗非鱼体型较大、世代周期较长（2-3年才能达到性成熟）、繁殖方式为每年一次的群体产卵，以及在非产卵季节难以区分雌雄个体，因此并非生态毒理学研究中的经典“模式实验室物种”。然而，该物种在英国已得到广泛研究，原因是在雌激素类废水排放口下游，研究人员发现雄性鱼类的内分泌系统出现了紊乱例如，血液中存在雌性特异性卵黄原蛋白）以及组织病理学检查（卵睾体——睾丸中发育中的卵子和/或雌性生殖道）5,6因此，作为这些方案的未来应用，拟鲤（或类似物种）可作为一种有用的野生指示物种，用于检测接受深度处理出水的河流中是否真正改善了废水水质（并降低了雌激素活性）。它们还可用于末端管道系统，以监测中试规模处理设施经技术改进后的出水情况。7在考虑使用哪种物种时 体内 废水评估中，使用实验室物种进行相对较快且受控的测试，与使用本地物种进行耗时较长但环境相关性更高的实地测试之间存在权衡。然而，此类 体内 评估成本较高，应仅在化学分析评估之后作为最终测试手段来考虑 体外 检测方法

在所述方案中的关键步骤包括样品和玻璃器皿（即 瓶子和采样设备应预先使用适当的表面活性清洁剂处理）的制备与操作，以避免环境污染物对样品造成污染，包括尽量减少样品与塑料及其他可能产生假阳性结果的材料的接触。在设计和构建水族箱及鱼类暴露系统时，这一点同样重要。理想情况下，用于饲养种群和暴露实验的水族箱应采用吸附性低32、污染风险最小的材料制造。不锈钢可用于排放液或储水罐；而玻璃材质的水箱则更适合作为鱼类养殖箱（同时也便于观察鱼类）。应避免使用低等级的塑料管道或管路32，若必须使用聚氯乙烯（PVC）34 或丙烯腈-丁二烯-苯乙烯共聚物（ABS），则需“充分预处理”，即 在使用前用流动的稀释水浸泡至少12小时，以充分沥滤出可能存在的污染物。在本机构中，医用级硅胶管已成功用于蠕动泵向水箱输送化学物质以及废水/稀释水。除了需考虑水生系统的构建和运行过程中可能引入的雌激素类污染外，还必须关注鱼类的饲料问题；许多市售鱼类饲料已被发现具有雌激素活性。因此，在此类研究中使用任何饲料之前，必须先检测其活性（例如，通过酵母雌激素筛查法，参见 Beresford et al.14）。

若在分析过程中同时检测质量保证样品，包括多个运输空白、实验室空白和溶剂空白，以及阳性对照和实际样品，则可简化对所述化学分析或YES检测方案的故障排查，从而消除假阳性与假阴性结果。阳性（例如，EE2）以及阴性对照（仅稀释水）也应始终使用于实验中 体内 用于确认预期生物标志物或终点指标敏感性的检测方法（即，VTG 或组织病理学），并能够检测到任何意外的污染（例如， 从实验设置、饮食或稀释用水等方面进行的任何修改，在开展任何研究之前都应经过验证。

随着对通过污水处理厂出水进入环境的雌激素类化合物实施更严格的监管，有必要开发更高效的城市污水处理技术。本论文所述的这一系列测试方法可作为对污水处理厂出水常规开展的生态毒理学和化学评估测试的补充。因此，未来应用此类综合性测试体系将有助于污水处理技术研发人员和运营人员采用生态上最安全的设计方案，以有效去除特定的受监管雌激素类化学物质以及整体生物活性。

披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

本文介绍的项目由塞文特伦特水务公司和伦敦布鲁内尔大学资助。作者感谢艾伦·亨肖和约翰·丘奇利提供野外和实验室协助。T.J.C. 感谢海因兹基金会的支持。M.R.M. 感谢斯坦布伦纳研究所提供的斯坦布伦纳博士奖学金以及卡内基梅隆大学提供的校长奖学金。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
Wellwash Versa 洗板机Thermo Scientific5165010
酶标仪Molecular DevicesSpectraMax 340PC
培养箱MemmertINB 400鲤鱼检测需在 37 °C 下孵育
Fisherbrand 漩涡混合器Fisher Scientific13214789
制冰机ScotsmanAF80
12 通道 F1 数字多通道移液器Thermo Scientific Finnpipette4661070
ELISA 试剂盒Biosense LaboratoriesV01018401-096（黑头呆鱼）
V01003402-096（鲤鱼）
微量离心管，0.5 mlAlpha labsLW2372
微量离心管，1.5 mlAlpha labsLW2375
硫酸，95-98%Sigma-Aldrich258105
组织学
组织处理机Leica BiosystemsTP1020
石蜡分配器Thermo Scientific Raymond LambE66HC
金属包埋模具Leica Biosystems各种规格
加热板Thermo Scientific Shandon3120063
冷台（EG1150 C）Leica Biosystems14038838037
加热镊子（EG F）Leica Biosystems14038835824
切片机Leica BiosystemsRM2235
石蜡切片漂浮浴 ElectrothermalMH8517
载玻片干燥台ElectrothermalMH6616
Stainmate 自动染色机Thermo Scientific ShandonE103/S10L
包埋盒，Histosette II，活检用SimportM493
石蜡Thermo Scientific Raymond LambW1
Histo-Clear IINational DiagnosticsHS-202
工业甲基化酒精（乙醇混合物），IDA99TennantsID440
Polysine 黏附载玻片Thermo Scientific Gerhard MenzelJ2800AMNZ
盖玻片，22×50 mmVWR631-0137
Histomount 封片剂National DiagnosticsHS-103
苏木精 Harris GURRVWR351945S
伊红，1%，水溶液Pyramid InovationS20007-E
Fisherbrand 载玻片盒Fisher Scientific11701486
切片机刀片，MB35Thermo Scientific Shandon3050835
Bouin’s 溶液Sigma AldrichHT10132-1L
酵母筛选
生物安全柜Labcaire Systems LtdSC12R
冷却培养箱LMS Cooled Incubator303
培养箱MemmertINB 400
摇床GrantPSU-10i
Fisherbrand 漩涡混合器Fisher Scientific13214789
板式摇床Heidolph Titramax 100544-11200-00
12 通道 F1 数字多通道移液器Thermo Scientific Finnpipette4661070
12 通道电子移液器Sartorius735441
96 孔平底微孔板MP Biomedicals
Thermo Scientific Nunc
Sarstedt		76-232-05
260860
82.1581.001		我们发现这些多孔板均能产生较低的背景信号
高效液相色谱级水RathburnRH1020
无水乙醇Hayman KimiaF200238
无水磷酸二氢钾Sigma-AldrichP-5655
硫酸铵Sigma-AldrichA-2939
氢氧化钾，颗粒状Sigma-AldrichP-1767
无水硫酸镁Sigma-AldrichM-2643
硫酸铁(III)Sigma-Aldrich307718
L-亮氨酸Sigma-AldrichL-8912
L-组氨酸Sigma-AldrichH-6034
腺嘌呤Sigma-AldrichA-2786
L-精氨酸盐酸盐Sigma-AldrichA-6969
L-甲硫氨酸Sigma-AldrichM-5308
L-酪氨酸Sigma-AldrichT-8566
L-异亮氨酸Sigma-AldrichI-7403
L-赖氨酸盐酸盐Sigma-AldrichL-8662
L-苯丙氨酸Sigma-AldrichP-5482
L-谷氨酸Sigma-AldrichG-8415
L-缬氨酸Sigma-AldrichV-0513
L-丝氨酸Sigma-AldrichS-4311
硫胺素盐酸盐Sigma-AldrichT-1270
吡哆醇Sigma-AldrichP-5669
D-泛酸，半钙盐Sigma-AldrichP-5155
肌醇Sigma-AldrichI-5125
D-生物素Sigma-AldrichB-4639
无水 D-(+)-葡萄糖；混合异头物Sigma-AldrichG-7021
L-天冬氨酸Sigma-AldrichA-4534
L-苏氨酸Sigma-AldrichT-8441
无水硫酸铜(II)Sigma-AldrichC-1297
氯酚红-β-D-半乳吡喃糖苷（CPRG）Sigma-Aldrich10884308001
甘油Sigma-AldrichG-2025
17 β-雌二醇Sigma-AldrichE-8875
类固醇
丙酮Rathburn
乙腈Rathburn
氨水溶液Rathburn
乙酸乙酯Rathburn
硝酸铜(II)Sigma-Aldrich
丙酮Rathburn
二氯甲烷Rathburn
2,4,16,16-d4-17β-雌二醇CDN Isotopes
2,4,16,16-d4-雌酮CDN Isotopes
2,4,16,16-d4-17α-乙炔基雌二醇CDN Isotopes
17β-雌二醇Sigma-Aldrich
雌酮Sigma-Aldrich
17α-乙炔基雌二醇Sigma-Aldrich
正己烷Rathburn
盐酸Sigma-Aldrich
甲醇Sigma-Aldrich
碳酸氢钠Sigma-Aldrich
氢氧化钠Sigma-Aldrich
苯乙烯-二乙烯基苯固相萃取小柱（Isolute ENV+）（200 mg/6 ml）Biotage
Isolute 氨丙基固相萃取小柱（500 mg/6 ml）Biotage
鱼类研究
橙白硅胶管，内径 0.63 mm，6 根/包Watson Marlow982.0063.000
直通接头，适用于内径 0.5/0.8 mm，20 个/包Watson Marlow999.2008.000
pumsil 硅胶管，内径 0.8 mm，15 mWatson Marlow913.A008.016
200 系列多通道蠕动泵Watson Marlow205CA
硅胶管 × 15 m（用于加药罐）VWRSFM1-3250
硅胶管 × 15 m（大口径，用于进/出液）VWRSFM1-5450
2.5 L 玻璃广口瓶，4 个/包Fisher ScientificBTF-505-050B
磁力搅拌子，51 × 8 mm，10 个/包Fisher ScientificFB55595 
三氨基苯甲酸乙酯甲磺酸盐（MS222）Sigma AldrichE10521-10G
17α-乙炔基雌二醇Sigma AldrichE4876-100MG
无水乙醇Hayman KimiaF200238
固相萃取（SPE）
1/8 英寸 PTFE 管，“吸管”，彩色编码，4 根/包Sigma Aldrich57276
一次性层析柱架衬垫Sigma Aldrich57059
无烧结滤片的过滤管，6 ml，30 根/包Sigma Aldrich57242
储液瓶适配器，12 个/包Sigma Aldrich57020-U
层析柱架不锈钢配重，4 个/包Sigma Aldrich57278
阳鲁尔接头，用于层析柱架，12 个/包Sigma Aldrich504351
SPE 真空层析柱架Sigma Aldrich57265
萃取层析柱架用旋塞阀（Supelco），12 个/包WatersWAT054806
Sep-Pak Plus C18 小柱，50 WatersWAT020515
高效液相色谱级甲醇，2.5 LFisher ScientificM/4056/17
7 ml 玻璃小瓶及瓶盖（58 × 17 mm），399 个/包Fisher ScientificTUL-520-031K
无水乙醇Hayman KimiaF200238
真空泵，例如，VP 系列真空泵Camlab1136915

参考文献

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