本文介绍了一种巨噬细胞集落刺激因子（M-CSF）诱导分化的人单核细胞来源巨噬细胞的细胞培养方案。该方案采用单核细胞的冷冻保存，并将其大规模分化为巨噬细胞。随后，收获的巨噬细胞可根据实验需求以特定的细胞密度接种至培养孔中进行后续实验。
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摘要
摘要
本文介绍了一种巨噬细胞集落刺激因子（M-CSF）诱导人单核细胞来源的巨噬细胞进行细胞培养的实验方案。实验开始时，将新鲜或冻存的单核细胞在含有M-CSF的培养瓶中培养1周，以诱导其分化为巨噬细胞。随后，可收获这些巨噬细胞，并以所需的细胞密度接种至培养板中以开展后续实验。相较于使用固定数量的单核细胞起始培养，采用确定数量的巨噬细胞进行实验起始，能够更稳定地达到目标细胞密度。使用冻存单核细胞可减少对供体来源的依赖性，并获得更为均一的巨噬细胞培养体系。
引言
培养的巨噬细胞是研究这些细胞在动脉粥样硬化斑块等炎症过程中功能的有用模型。当研究重点涉及人类巨噬细胞相关疾病时，使用原代人巨噬细胞而非非人来源的巨噬细胞有助于避免种属差异。此外，与使用巨噬细胞系相比，采用原代巨噬细胞可避免细胞转化所带来的影响。为此，可通过从人血液中分离单核细胞并将其分化为巨噬细胞，以此获得原代人巨噬细胞。
组织巨噬细胞可能为驻留于组织内的巨噬细胞，也可能来源于迁移至组织并分化为巨噬细胞的单核细胞1。目前已定义出两种人类单核细胞来源的巨噬细胞，它们不仅在形态学上存在差异，而且在基因表达和细胞功能上也有所不同2。这两种巨噬细胞分别由在M-CSF加胎牛血清（FBS）存在下分化为巨噬细胞的单核细胞，以及在粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）加FBS存在下分化为巨噬细胞的单核细胞获得2-6。根据我们的经验（未发表观察），使用人血清替代FBS时，无论分化培养基中添加M-CSF还是GM-CSF，均会生成GM-CSF型巨噬细胞。M-CSF型巨噬细胞通常比GM-CSF型巨噬细胞更为细长，而后者在形态上类似煎蛋。研究者应认识到，人类M-CSF和GM-CSF来源的单核细胞衍生巨噬细胞并不等同于所谓的小鼠M1和M2型骨髓来源巨噬细胞6。
在使用人单核细胞来源的M-CSF分化巨噬细胞进行研究时，我们遇到了因单核细胞获取困难而难以启动实验的问题，以及在单核细胞向巨噬细胞分化过程中获得的巨噬细胞密度存在差异的问题。为解决这些问题，我们开发了以下实验方案：将单核细胞冻存以备后续使用，并大规模地将单核细胞分化为巨噬细胞，随后从培养瓶中收集这些巨噬细胞，并以目标细胞密度接种，从而在不同实验间获得更为均一的细胞培养结果。
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方案
白细胞单采术是在美国国立卫生研究院机构审查委员会批准的人类受试者研究方案下进行的。
1. 单核细胞的分离与冷冻保存
- 通过白细胞单采术获取人供体的单个核细胞，并按照参考文献所述，采用连续逆流离心淘析法从单个核细胞中富集单核细胞 7,8. 获取约 100 x 106 使用制造商指定的elutriation缓冲液收集洗脱细胞（约80–90%为单核细胞）。用血细胞计数板计数细胞。
- 在15 ml聚丙烯管中以300 x g离心单核细胞 室温下孵育5分钟。
- 移去上清液，将细胞轻轻重悬于胎牛血清（FBS）中，随后加入二甲基亚砜，使终浓度为90% FBS/10%二甲基亚砜，并含有50 × 106 细胞/毫升
- 将每毫升细胞悬液加入到一个独立的冻存管中。
- 将冻存管放入细胞冻存盒中，于-80 °C冰箱中放置24小时，随后转移至液氮冻存管储存罐中进行长期保存。
2. 单核细胞向巨噬细胞的分化
- 将冻存细胞的冻存管迅速转移至37 °C水浴中解冻，当细胞悬液约70%融化时立即取出。
- 室温下完全解冻后，立即将1 ml冻存管内容物转移至50 ml预热至37 °C的含2 mM L-谷氨酰胺、50 ng/ml M-CSF、25 ng/ml 白细胞介素-10（IL-10）和10%胎牛血清（FBS）的Roswell Park Memorial Institute（RPMI）1640培养基（完全培养基）中。
- 将25 ml单核细胞悬液分别加入两个75 cm2的塑料细胞培养瓶中。
- 将培养物置于37 °C、5% CO2 / 95%空气的细胞培养箱中孵育48小时。
- 用10 ml预热至37 °C的RPMI 1640培养基轻轻冲洗培养物3次，每次小心移除培养基，避免冲走松散贴壁的细胞。
- 冲洗后，加入新鲜的完全培养基，每2天更换一次培养基，直至单核细胞充分分化并增殖形成融合单层。此过程通常需要约一周的培养时间。
3. 收集巨噬细胞以启动实验
- 用 10 ml 预热至 37 °C 的不含 Ca²⁺ 的 Dulbecco 磷酸盐缓冲液，将培养瓶中的分化巨噬细胞冲洗 3 次2+ 和 Mg2+ 在加入 10 ml 之前 预热至37 °C的0.25%胰蛋白酶-乙二胺四乙酸（EDTA）溶液
- 将培养瓶置于细胞培养箱中孵育10–15分钟，此时约90%的巨噬细胞应已变圆并脱落。通过显微镜观察培养瓶以确认该状态。
- 加入10 ml含10% FBS的RMPI 1640培养基以终止消化。
- 将巨噬细胞悬液从培养瓶转移至50 ml聚丙烯管中，300 × g离心5分钟，弃去上清液。
- 轻轻将巨噬细胞重悬于1 ml完全培养基中。
- 将10 µl巨噬细胞悬液与10 µl台盼蓝溶液混合，测定巨噬细胞数量和活力（通常 > 95%）使用血细胞计数板进行计数。
- 根据细胞计数（通常约为 15 - 18 x 105 巨噬细胞），加入额外的完全培养基以达到所需的接种细胞密度。注意：1 x 105 在12孔板中，每孔加入1.5 ml培养基培养巨噬细胞，可获得接近汇合的细胞培养状态。
- 接种后，将巨噬细胞在37 °C、5% CO₂的细胞培养箱中孵育过夜2 / 95% 空气条件下培养，以促进细胞贴壁。随后，开始进行所需的实验。
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结果
新鲜或冻存单核细胞的活力通过台盼蓝染色法测定，高于95% 9. 图 1 和 图2 分别在较低和较高放大倍数下比较新鲜样本与冷冻保存样本的进展情况（即，冷冻）单核细胞向巨噬细胞的分化。需要注意的是，与冻存单核细胞相比，新鲜单核细胞中存在一个正在分化的单核细胞亚群，这些细胞未发生铺展，仍保持圆形。在上述两种条件下，单核细胞来源的巨噬细胞中均出现透亮的空泡，这些空泡为大胞饮体，是此前已报道的M-CSF型巨噬细胞的特征性结构 10,11.
从单核细胞分化所用培养瓶中收获巨噬细胞后进行冻存，未能成功建立巨噬细胞培养体系（图3）。此类培养物中细胞贴壁极为稀疏，可能源于冻存后细胞活力低下。
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讨论
获得特定类型的巨噬细胞有助于阐明研究巨噬细胞生物学时因实验条件不同而导致的研究人员之间结果不一致的问题。使用不同的培养条件和分化因子来诱导生成原代人巨噬细胞，可能产生截然不同的巨噬细胞类型，而研究人员可能并未充分认识到这一点。例如，人单核细胞有时在无血清、仅含人血清、人血清添加M-CSF、仅含FBS，或含M-CSF或GM-CSF的FBS条件下分化为巨噬细胞。如先前报道及我们所观察到的，单核细胞在无血清或仅含FBS但未添加分化因子的条件下培养一周后无法维持存活3。如上所述，使用仅含人血清或添加M-CSF的人血清培养的单核细胞所生成的巨噬细胞，呈现出与在FBS加GM-CSF条件下分化的单核细胞特征性的“煎蛋状”形态相似的形态"。因此，即使在添加M-CSF的情况下，只要存在人血清，也无法获得具有更长梭形形态的M-CSF型巨噬细胞"。
有趣的是，我们观察到，使用含有M-CSF和GM-CSF的FBS对单核细胞进行分化，可同时产生M-CSF诱导的细长形细胞和GM-CSF "煎蛋" 同一培养物中出现不同的形态学表型。这表明不同的单核细胞亚群可...
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
美国国立卫生研究院临床中心输血医学科提供了经离心分离的单核细胞。本工作由美国国立卫生研究院国家心肺血液研究所院内研究计划资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| Cellbind 12孔培养板 | Corning | 3336 | |
| CELLSTAR，T-75培养瓶，组织培养处理 | Greiner Bio-One 北美公司 | 658157 | |
| RPMI 1640 培养基 | Cellgro Mediatech | 15-040-CM | 预热至 37 °C |
| L-谷氨酰胺 | Cellgro Mediatech | 25-005-CI | |
| 胎牛血清 | Gibco | 16000-036 | |
| M-CSF | PeproTech | 300-25 | |
| GM-CSF | PeproTech | 300-03 | |
| IL-10 | PeproTech | 200-10 | |
| DMSO | Sigma | D2650 | |
| 冻存管 | Thermo Scientific | 375418 | |
| 不含 Ca2+ 和 Mg2+ 的 DPBS | Corning cellgro | 21-031-CV | |
| 0.25% 胰蛋白酶-EDTA | Gibco | 25200-056 | |
| 50 ml 聚丙烯圆锥形离心管 | Falcon | 352070 | |
| 台盼蓝 | Lonza | 17-942E | |
| 改进型内波尔计数板（亮视野血细胞计数器） | Paul Marienfeld GmbH & Co. KG | 610031 | http://www.marienfeld-superior.com/index.php/counting-chambers/articles/counting-chambers.html |
| CoolCell LX 细胞冻存容器 | BioCision | BCS-405 | 其他冻存容器也应适用于此步骤 |
| 液氮储存系统，CryoPlus 1 | Thermo Scientific | 7400 | 任何液氮罐均应适用 |
参考文献
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