本文介绍了一种巨噬细胞集落刺激因子（M-CSF）诱导分化的人单核细胞来源巨噬细胞的细胞培养方案。该方案采用单核细胞的冷冻保存，并将其大规模分化为巨噬细胞。随后，收获的巨噬细胞可根据实验需求以特定的细胞密度接种至培养孔中进行后续实验。
本文内容
摘要
摘要
本文介绍了一种巨噬细胞集落刺激因子（M-CSF）诱导人单核细胞来源的巨噬细胞进行细胞培养的实验方案。实验开始时，将新鲜或冻存的单核细胞在含有M-CSF的培养瓶中培养1周，以诱导其分化为巨噬细胞。随后，可收获这些巨噬细胞，并以所需的细胞密度接种至培养板中以开展后续实验。相较于使用固定数量的单核细胞起始培养，采用确定数量的巨噬细胞进行实验起始，能够更稳定地达到目标细胞密度。使用冻存单核细胞可减少对供体来源的依赖性，并获得更为均一的巨噬细胞培养体系。
引言
培养的巨噬细胞是研究这些细胞在动脉粥样硬化斑块等炎症过程中功能的有用模型。当研究重点涉及人类巨噬细胞相关疾病时，使用原代人巨噬细胞而非非人来源的巨噬细胞有助于避免种属差异。此外，与使用巨噬细胞系相比，采用原代巨噬细胞可避免细胞转化所带来的影响。为此，可通过从人血液中分离单核细胞并将其分化为巨噬细胞，以此获得原代人巨噬细胞。
组织巨噬细胞可能为驻留于组织内的巨噬细胞，也可能来源于迁移至组织并分化为巨噬细胞的单核细胞1。目前已定义出两种人类单核细胞来源的巨噬细胞，它们不仅在形态学上存在差异，而且在基因表达和细胞功能上也有所不同2。这两种巨噬细胞分别由在M-CSF加胎牛血清（FBS）存在下分化为巨噬细胞的单核细胞，以及在粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）加FBS存在下分化为巨噬细胞的单核细胞获得2-6。根据我们的经验（未发表观察），使用人血清替代FBS时，无论分化培养基中添加M-CSF还是GM-CSF，均会生成GM-CSF型巨噬细胞。M-CSF型巨噬细胞通常比GM-CSF型巨噬细胞更为细长，而后者在形态上类似煎蛋。研究者应认识到，人类M-CSF和GM-CSF来源的单核细胞衍生巨噬细胞并不等同于所谓的小鼠M1和M2型骨髓来源巨噬细胞6。
在使用人单核细胞来源的M-CSF分化巨噬细胞进行研究时，我们遇到了因单核细胞获取困难而难以启动实验的问题，以及在单核细胞向巨噬细胞分化过程中获得的巨噬细胞密度存在差异的问题。为解决这些问题，我们开发了以下实验方案：将单核细胞冻存以备后续使用，并大规模地将单核细胞分化为巨噬细胞，随后从培养瓶中收集这些巨噬细胞，并以目标细胞密度接种，从而在不同实验间获得更为均一的细胞培养结果。
方案
白细胞单采术是在美国国立卫生研究院机构审查委员会批准的人类受试者研究方案下进行的。
1. 单核细胞的分离与冷冻保存
- 通过白细胞单采术获取人供体的单个核细胞，并按照参考文献所述，采用连续逆流离心淘析法从单个核细胞中富集单核细胞 7,8. 获取约 100 x 106 使用制造商指定的elutriation缓冲液收集洗脱细胞（约80–90%为单核细胞）。用血细胞计数板计数细胞。
- 在15 ml聚丙烯管中以300 x g离心单核细胞 室温下孵育5分钟。
- 移去上清液，将细胞轻轻重悬于胎牛血清（FBS）中，随后加入二甲基亚砜，使终浓度为90% FBS/10%二甲基亚砜，并含有50 × 106 细胞/毫升
- 将每毫升细胞悬液加入到一个独立的冻存管中。
- 将冻存管放入细胞冻存盒中，于-80 °C冰箱中放置24小时，随后转移至液氮冻存管储存罐中进行长期保存。
2. 单核细胞向巨噬细胞的分化
- 将冻存细胞的冻存管迅速转移至37 °C水浴中解冻，当细胞悬液约70%融化时立即取出。
- 室温下完全解冻后，立即将1 ml冻存管内容物转移至50 ml预热至37 °C的含2 mM L-谷氨酰胺、50 ng/ml M-CSF、25 ng/ml 白细胞介素-10（IL-10）和10%胎牛血清（FBS）的Roswell Park Memorial Institute（RPMI）1640培养基（完全培养基）中。
- 将25 ml单核细胞悬液分别加入两个75 cm2的塑料细胞培养瓶中。
- 将培养物置于37 °C、5% CO2 / 95%空气的细胞培养箱中孵育48小时。
- 用10 ml预热至37 °C的RPMI 1640培养基轻轻冲洗培养物3次，每次小心移除培养基，避免冲走松散贴壁的细胞。
- 冲洗后，加入新鲜的完全培养基，每2天更换一次培养基，直至单核细胞充分分化并增殖形成融合单层。此过程通常需要约一周的培养时间。
3. 收集巨噬细胞以启动实验
- 用 10 ml 预热至 37 °C 的不含 Ca²⁺ 的 Dulbecco 磷酸盐缓冲液，将培养瓶中的分化巨噬细胞冲洗 3 次2+ 和 Mg2+ 在加入 10 ml 之前 预热至37 °C的0.25%胰蛋白酶-乙二胺四乙酸（EDTA）溶液
- 将培养瓶置于细胞培养箱中孵育10–15分钟，此时约90%的巨噬细胞应已变圆并脱落。通过显微镜观察培养瓶以确认该状态。
- 加入10 ml含10% FBS的RMPI 1640培养基以终止消化。
- 将巨噬细胞悬液从培养瓶转移至50 ml聚丙烯管中，300 × g离心5分钟，弃去上清液。
- 轻轻将巨噬细胞重悬于1 ml完全培养基中。
- 将10 µl巨噬细胞悬液与10 µl台盼蓝溶液混合，测定巨噬细胞数量和活力（通常 > 95%）使用血细胞计数板进行计数。
- 根据细胞计数（通常约为 15 - 18 x 105 巨噬细胞），加入额外的完全培养基以达到所需的接种细胞密度。注意：1 x 105 在12孔板中，每孔加入1.5 ml培养基培养巨噬细胞，可获得接近汇合的细胞培养状态。
- 接种后，将巨噬细胞在37 °C、5% CO₂的细胞培养箱中孵育过夜2 / 95% 空气条件下培养，以促进细胞贴壁。随后，开始进行所需的实验。
结果
新鲜或冻存单核细胞的活力通过台盼蓝染色法测定，高于95% 9. 图 1 和 图2 分别在较低和较高放大倍数下比较新鲜样本与冷冻保存样本的进展情况（即，冷冻）单核细胞向巨噬细胞的分化。需要注意的是，与冻存单核细胞相比，新鲜单核细胞中存在一个正在分化的单核细胞亚群，这些细胞未发生铺展，仍保持圆形。在上述两种条件下，单核细胞来源的巨噬细胞中均出现透亮的空泡，这些空泡为大胞饮体，是此前已报道的M-CSF型巨噬细胞的特征性结构 10,11.
从单核细胞分化所用培养瓶中收获巨噬细胞后进行冻存，未能成功建立巨噬细胞培养体系（图3）。此类培养物中细胞贴壁极为稀疏，可能源于冻存后细胞活力低下。
上述用于制备M-CSF型巨噬细胞的方案可在不含有污染性GM-CSF型巨噬细胞的情况下实现，而当直接从单核细胞建立培养时，有时会出现此类污染，尤其是在未经过冷冻保存并在培养瓶中向M-CSF型巨噬细胞分化的情况下。然而，使用含FBS和GM-CSF的培养基对冻存单核细胞进行分化，可获得优质的GM-CSF型细胞培养物（图4）。
图1：用于生成巨噬细胞的新鲜与冻存单核细胞的比较（低倍放大）。 冻存（冷冻）和新鲜单核细胞在M-CSF诱导下向巨噬细胞分化过程中的相差显微镜图像。图中显示了单核细胞在培养瓶中培养第3天和第7天的情况，以及在第8天的形态，即收获并重新接种至12孔培养板后一天。标尺 = 100 µm，适用于所有图像。请点击此处查看该图的放大版本。
图2：用于生成巨噬细胞的新鲜与冻存单核细胞的比较（高倍放大）。 单核细胞的培养方法如图1图注所述，此处展示为更高倍放大图像。相位透明的空泡为巨胞饮体（白色箭头）。标尺 = 50 µm，适用于所有图像。请点击此处查看该图的放大版本。
图3：冻存的巨噬细胞无法形成良好的培养物。 新鲜单核细胞被接种至培养瓶中，并在M-CSF存在下培养7天以诱导分化，如上文图1和图2所示。随后，将已分化的巨噬细胞从培养瓶中收集并进行冻存。接着，将冻存后的巨噬细胞按非冻存巨噬细胞的实验方案接种至12孔板中，并继续培养1天（第8天）。培养1天后的相差显微镜图像显示，经过冻存后仅有极少数巨噬细胞能够贴壁（与上文图1中非冻存巨噬细胞在第8天的贴壁情况相比）。标尺 = 100 µm。 请点击此处查看该图的放大版本。
图 4：冻存的单核细胞也适用于生成GM-CSF型单核细胞来源的巨噬细胞。将冻存的单核细胞（25 × 106）接种至培养瓶中，并在含10%胎牛血清和50 ng/mL GM-CSF的培养基中培养8天以诱导分化。相差显微镜图像显示了GM-CSF型巨噬细胞典型的“煎蛋样”形态。标尺 = 100 µm。请点击此处查看该图的放大版本。
讨论
获得特定类型的巨噬细胞有助于阐明研究巨噬细胞生物学时因实验条件不同而导致的研究人员之间结果不一致的问题。使用不同的培养条件和分化因子来诱导生成原代人巨噬细胞，可能产生截然不同的巨噬细胞类型，而研究人员可能并未充分认识到这一点。例如，人单核细胞有时在无血清、仅含人血清、人血清添加M-CSF、仅含FBS，或含M-CSF或GM-CSF的FBS条件下分化为巨噬细胞。如先前报道及我们所观察到的，单核细胞在无血清或仅含FBS但未添加分化因子的条件下培养一周后无法维持存活3。如上所述，使用仅含人血清或添加M-CSF的人血清培养的单核细胞所生成的巨噬细胞，呈现出与在FBS加GM-CSF条件下分化的单核细胞特征性的“煎蛋状”形态相似的形态"。因此，即使在添加M-CSF的情况下，只要存在人血清，也无法获得具有更长梭形形态的M-CSF型巨噬细胞"。
有趣的是，我们观察到，使用含有M-CSF和GM-CSF的FBS对单核细胞进行分化，可同时产生M-CSF诱导的细长形细胞和GM-CSF "煎蛋" 同一培养物中出现不同的形态学表型。这表明不同的单核细胞亚群可分化为这两种巨噬细胞类型。既往研究表明，M-CSF和GM-CSF这两种分化因子不仅影响巨噬细胞的形态，还影响其基因表达和细胞功能，而这两种巨噬细胞类型的基因表达和功能存在显著差异。 2-6免疫染色检测巨噬细胞标志物CD68，联合检测M-CSF型巨噬细胞表达的CD14以及GM-CSF巨噬细胞表达的25F9，可用于确认巨噬细胞类型，如先前研究所示。 2这两种巨噬细胞类型可能与动脉粥样硬化的研究特别相关，因为在动脉粥样硬化斑块中存在不同类型的巨噬细胞，且它们在胆固醇代谢以及炎症介质表达方面可能表现出差异。 2,12,13例如，M-CSF型巨噬细胞具有独特性，当这些巨噬细胞富含胆固醇时，会将胆固醇沉积到细胞外基质中 12,14,15.
在本方案中，与M-CSF共培养时，按先前所述常规添加IL-10 16该细胞因子可促进巨噬细胞的生长与分化，并使其呈现更为均一的长梭形形态。此外，IL-10通过抑制GM-CSF诱导的信号转导事件，抑制GM-CSF依赖性单核细胞的存活。 17然而，研究者应考虑到IL-10可能影响正在研究的其他细胞反应，因此可能希望省略IL-10。在采用当前方案（即在培养瓶中进行单核细胞增殖与分化）之前，巨噬细胞培养是通过将离心洗涤获得的单核细胞直接接种于培养板孔中，并在开始实验前进行为期7天的分化来建立的。然而，即使添加了IL-10，部分此类巨噬细胞培养物仍显示出少量（通常少于10%） "煎蛋" GM-CSF型巨噬细胞对细长的M-CSF型巨噬细胞的污染。根据当前方案，GM-CSF型巨噬细胞的污染不会发生，其原因尚不明确。然而，这并非由于在冻存过程中GM-CSF型巨噬细胞前体单核细胞丢失所致，因为将冻存的单核细胞在含FBS和GM-CSF的培养基中培养可获得优质的GM-CSF型细胞培养结果（参见 图4).
本方案在单核细胞分化为巨噬细胞之前，采用单核细胞的冷冻保存技术。先前的研究已表明，单核细胞的冷冻保存不会影响其功能，并且该方法已被广泛使用18-21。在这方面，我们发现，采用上述方案由冷冻保存的单核细胞所生成的巨噬细胞，能够将胆固醇沉积至细胞外空间，其表现与我们此前使用未经冷冻保存、直接培养为巨噬细胞的单核细胞所观察到的结果相似12。通过单核细胞冷冻保存，可确保在需要启动实验时随时获得单核细胞，而不受供体采血时间的限制。尽管在实施本方案前对单核细胞进行冷冻保存并非必需，但我们发现，经过冷冻保存的单核细胞所产生的巨噬细胞培养物更为均一：这些巨噬细胞更多呈铺展状态，而使用新鲜单核细胞时，巨噬细胞则同时存在圆形和铺展形态。我们已成功利用冷冻保存达6个月（已测试的最长时间）的单核细胞生成了巨噬细胞培养物。另一方面，将已分化的巨噬细胞冷冻后重新接种至培养板进行实验，则无法获得理想的巨噬细胞培养效果。
该实验方案的关键步骤包括：在加入二甲基亚砜后立即将单核细胞放入冻存管并置于液氮中冻存，以及在冻存单核细胞解冻后立即转移至培养基中。尽管通常在将冻存细胞接种至培养体系前通过离心去除二甲基亚砜（DMSO），但我们发现这一步骤对于单核细胞的成功培养并非必需。然而，若残留DMSO浓度（2 µl/ml）高于本方案所述水平，研究者可能需要进行此步骤。单核细胞接种至培养瓶后，必须在48小时内避免洗涤，否则可能因细胞对培养表面的黏附程度不同而导致部分细胞丢失。另一方面，一旦单核细胞分化为巨噬细胞，其黏附性增强，可能需要延长胰蛋白酶消化时间才能有效解离，或可在初始胰蛋白酶处理后使用细胞刮铲辅助细胞释放。若单核细胞未能增殖或分化，可能原因包括供体单核细胞的特殊个体特征、M-CSF活性丧失，或所用胎牛血清（FBS）批次存在问题。此外，若培养过程未见预期进展，还需考虑试剂是否被内毒素污染，内毒素是一种已知可抑制巨噬细胞增殖的物质22。
在培养瓶中利用M-CSF诱导冻存的单核细胞分化，可使其大量分化为巨噬细胞。随后，可收集巨噬细胞并以所需的细胞密度接种至培养孔中进行实验。与使用确定数量的单核细胞起始培养相比，直接使用确定数量的巨噬细胞进行实验，能够更稳定地达到目标细胞密度。
披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
美国国立卫生研究院临床中心输血医学科提供了经离心分离的单核细胞。本工作由美国国立卫生研究院国家心肺血液研究所院内研究计划资助。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| Cellbind 12孔培养板 | Corning | 3336 | |
| CELLSTAR，T-75培养瓶，组织培养处理 | Greiner Bio-One 北美公司 | 658157 | |
| RPMI 1640 培养基 | Cellgro Mediatech | 15-040-CM | 预热至 37 °C |
| L-谷氨酰胺 | Cellgro Mediatech | 25-005-CI | |
| 胎牛血清 | Gibco | 16000-036 | |
| M-CSF | PeproTech | 300-25 | |
| GM-CSF | PeproTech | 300-03 | |
| IL-10 | PeproTech | 200-10 | |
| DMSO | Sigma | D2650 | |
| 冻存管 | Thermo Scientific | 375418 | |
| 不含 Ca2+ 和 Mg2+ 的 DPBS | Corning cellgro | 21-031-CV | |
| 0.25% 胰蛋白酶-EDTA | Gibco | 25200-056 | |
| 50 ml 聚丙烯圆锥形离心管 | Falcon | 352070 | |
| 台盼蓝 | Lonza | 17-942E | |
| 改进型内波尔计数板（亮视野血细胞计数器） | Paul Marienfeld GmbH & Co. KG | 610031 | http://www.marienfeld-superior.com/index.php/counting-chambers/articles/counting-chambers.html |
| CoolCell LX 细胞冻存容器 | BioCision | BCS-405 | 其他冻存容器也应适用于此步骤 |
| 液氮储存系统，CryoPlus 1 | Thermo Scientific | 7400 | 任何液氮罐均应适用 |
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