通过颅骨的活体荧光显微镜(IVFM)结合遗传性动物模型,用于研究造血细胞归巢并植入骨髓(BM)微环境的过程。
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通过颅骨的活体荧光显微镜(IVFM)结合遗传性动物模型,用于研究造血细胞归巢并植入骨髓(BM)微环境的过程。
越来越多的证据表明,正常的造血过程受到骨髓(BM)中不同微环境信号的调控,这些信号包括能够调节造血干细胞(HSC)关键功能的特化细胞生态位1,2事实上,现在正逐步揭示出造血微环境更为详细的图景,其中骨内膜微环境和血管内皮微环境共同构成调控正常造血干细胞(HSC)及其子代细胞的功能性单位。3,4,5新研究揭示了血管周围细胞、脂肪细胞和神经元细胞在维持和调控造血干细胞功能中的重要作用6,7,8此外,有证据表明,来自不同谱系的细胞 即 髓系和淋巴系细胞在骨髓微环境中特定的生态位中定居并长期存在。然而,对骨髓微环境及其所含细胞的全面图谱绘制仍在进行中。
现已提供表达谱系特异性荧光标记的转基因小鼠品系,或经基因工程改造、在骨髓微环境特定细胞中缺失选定分子的小鼠。结合移植技术,基因敲除与谱系示踪模型为深入解析特定分子在骨髓微环境中的功能提供了有力工具 "生态位" 用于定义造血细胞群体(如造血干细胞、B细胞、T细胞、髓系细胞和红系细胞)的分析。通过结合颅骨的双光子显微镜成像,该策略可进一步增强。 体内 高分辨率成像与BM颅骨的三维重建,使我们能够精确定位特定造血细胞亚群在骨髓中的归巢位置,并评估其随时间扩增的动力学特征。此处使用Lys-GFP转基因小鼠(标记髓系细胞)9 以及RBPJ基因敲除小鼠(缺乏经典Notch信号通路)10 与IVFM联用,以确定髓系细胞在Notch缺陷型骨髓微环境中的植入情况。
活体多光子荧光显微镜(IVFM)是一种强大的成像技术,可在高达1 mm的深度范围内实现组织的高分辨率、实时成像,具体深度取决于组织类型。当应用于小鼠颅骨时,该技术能够以非侵入方式观察骨髓(BM)内造血细胞的行为,成像深度可达60–100 μm11。本研究利用该方法测定正常髓系前体细胞在缺乏经典Notch信号通路的RBPJ基因敲除小鼠骨髓中植入的动力学过程。
我们课题组近期的研究表明,骨髓微环境中经典的Notch信号通路功能缺陷会导致类似骨髓增殖性疾病的表型12。本研究通过使用Mx1-Cre介导的重组技术,条件性地删除RBPJ的DNA结合结构域,从而阻断经典的Notch信号通路,其中RBPJ是经典Notch信号通路下游的关键转录因子10。本研究采用了Mx1-Cre/RBPJlox/lox小鼠模型。条件性删除RBPJ的DNA结合基序会导致所有Notch受体信号的丧失。在Mx1-Cre模型中,Cre的表达由Mx1启动子驱动,该启动子在给予聚肌胞苷酸(polyI:C)后被激活,从而在血液细胞以及包括骨髓、脾脏和肝脏在内的多个器官的基质成分中诱导靶基因的删除。
经polyI:C诱导的Mx1-Cre+/RBPJlox/lox和....
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涉及动物使用的全部操作均须经印第安纳大学医学院动物护理与使用委员会批准后方可进行。务必遵守开展工作的国家有关动物实验的法律法规。
1. Mx1CreRBPJ-/- 受体小鼠的制备
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在不同时间点(移植 BM Lys-GFP 细胞后 24 小时以及 2、4 和 6 周)对 2 只 RBPJKO 和 2 只 RBPJWT 受体小鼠组成的队列,在单独的成像实验中进行了成像(工作流程见图 1A)。
在每只小鼠中,根据中央静脉分叉位置确定颅骨骨髓的6个标准区域,并从中获取图像,图2A, a)和冠状缝合线(图2A,b)。成像前注射葡聚糖Texas-Red可识别这些标志点,并从中选取6个区域(图2A左上、中上和右上(UL, UM, UR),左下、中下和右下(LL, LM, LR)。60 x 1 μm 从每个区域采集z轴层扫图像,并重建成三维最大强度投影(3-D Maximal Intensity Projection, MIP),图2B);三维.......
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本方案描述了一种优化的实验设计,用于通过活体荧光显微镜研究造血细胞植入的动力学过程。在本研究中,通过骨髓移植(BMT)后追踪Lys-GFP阳性髓系细胞在RBPJWT或RBPJKO受体小鼠颅骨骨髓中的情况,观察髓系祖细胞在野生型(WT)骨髓或Notch信号缺陷型骨髓中的扩增过程。该方法可作为一种模型,用于解答类似科学问题,例如:i)利用携带谱系特异性启动子驱动GFP或Tomato-red表达的造血细胞作为供体细胞,确定淋巴系、红系或巨核细胞系等其他谱系细胞在骨髓微环境中的扩增及定位;ii)通过使用其他特定基因敲除(KO)或转基因小鼠作为受体,评估不同微环境因素对造血细胞行为的影响。
该颅骨成像方案的优势在于,用于选择骨髓区域的解剖标志——中央静脉分叉处和冠状缝——在所有小鼠中均具有较好的保守性,因此可在不同个体实验之间保持一致性,同时无需使用自动载物台。此外,利用GFP模型追踪造血细胞被证明非常有效,因为GFP在非理想条件下(如照射后)仍能提供稳定的信号。最后,所描述的成像系统采用倒置显微镜和定制的立体定位装置,使小鼠处于仰卧位,可极大程度地减少呼吸伪影。
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作者无任何利益冲突需要披露。
成像工作在印第安纳大学的印第安纳生物显微中心完成,该中心由肯·邓恩博士(Dr. Ken Dunn)负责。立体定位装置是由威尔斯儿科研究中心的马克·孙帕(Mark Soonpaa)设计和制造的原型设备。本研究得到以下资助:NIH/R01DK097837-09(NC)、NIH/R01HL068256-05(NC)、NIH/NIDDK1U54DK106846-01(NC)、MPN研究基金会(NC)以及印第安纳大学医学院/圣母大学临床与转化科学研究所(CTSI)合作项目(NC)。
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| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
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