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一种简单的流式细胞术方法用于检测全血中单核细胞亚群的葡萄糖摄取及葡萄糖转运蛋白表达

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DOI：

10.3791/54255

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2016年8月12日

 ,  ,  ,  , 
1Centre for Biomedical Research, Macfarlane Burnet Institute for Medical Research and Public Health, 2Department of Infectious Diseases, Monash University, 3Department of Microbiology and Immunology, University of Melbourne, 4Department of Microbiology, The University of the West Indies, 5Division of Experimental Medicine, Department of Medicine, University of California, San Francisco, 6Department of Medicine, Monash University

本文内容

摘要

单核细胞是人类先天免疫系统的重要组成部分，在活化时依赖糖酵解代谢。本文介绍一种流式细胞术方案，用于检测新鲜全血中总单核细胞及单核细胞亚群的葡萄糖转运蛋白表达和葡萄糖摄取能力。

摘要

单核细胞是天然免疫细胞，可被病原体以及某些慢性炎症性疾病相关的炎症所激活。单核细胞的激活会诱导效应功能，并伴随从氧化代谢向糖酵解代谢的转变，同时葡萄糖转运蛋白的表达增加。单核细胞的训练免疫（一种天然免疫记忆形式）也表现出增强的糖酵解代谢。尽管 体外 已有研究描述了单核细胞葡萄糖转运蛋白表达及葡萄糖摄取的检测方法，但尚无研究采用多参数流式细胞术在全血中进行检测。本文介绍一种多参数流式细胞术检测全血中总单核细胞及经典型单核细胞（CD14++CD16-），中等水平（CD14++CD16+）和非经典（CD14+CD16++单核细胞亚群。该方法可用于检测稳态及炎症性疾病期间总单核细胞和单核细胞亚群的葡萄糖转运蛋白表达及葡萄糖摄取情况，并可经简单修改后用于检测血液中其他白细胞及其亚群的葡萄糖摄取。

引言

单核细胞是人类先天免疫系统的主要组成部分，可迅速迁移至感染和炎症部位1。单核细胞的活化对于限制病原体引起的急性损伤至关重要，同时也参与多种慢性疾病的发生发展过程，包括动脉粥样硬化2、癌症3和艾滋病病毒（HIV）感染4,5。

静息单核细胞与活化单核细胞的代谢方式存在显著差异，静息单核细胞主要依赖氧化代谢，而活化单核细胞则主要依赖糖酵解代谢（即，葡萄糖发酵为乳酸）6单核细胞的活化会诱导葡萄糖转运蛋白的表达，从而促进葡萄糖摄取以支持糖酵解代谢7单核细胞葡萄糖转运蛋白1（Glut1）便是此类在活化过程中上调的转运蛋白之一，其表达已被证实可在体外及肥胖小鼠的脂肪组织中促进促炎性细胞因子的产生8卡波西肉瘤相关疱疹病毒感染单核细胞系导致细胞Glut1表达上调9，我们最近发现，在慢性 HIV 感染期间，未经治疗和接受联合抗逆转录病毒治疗的感染者体内表达 Glut1 的单核细胞比例均有所增加10综上所述，这些研究表明单核细胞的葡萄糖摄取和糖酵解代谢在多种炎症性疾病中具有重要作用。因此，一种能够检测稳态及炎症性疾病状态下单核细胞Glut1表达和葡萄糖摄取的简便方法，可能对广大科研人员具有重要应用价值。

人类单核细胞具有异质性，可分为三个不同的亚群，可通过细胞表面标志物CD14和CD16的差异表达进行鉴定11,12。经典单核细胞高表达CD14，但不表达CD16（CD14++CD16-）；中间型单核细胞高表达CD14，并中等表达CD16（CD14++CD16+）；非经典单核细胞低表达CD14，但高表达CD16（CD14+CD16++）。表达CD16的单核细胞被称为CD16+单核细胞，与CD16-单核细胞相比，其炎症性细胞因子表达水平较高，并具有更强的抗原呈递能力13,14。在稳态条件下，约有10%的单核细胞表达CD16，在炎症状态下该比例更高15。单核细胞亚群与某些疾病状态相关，可能作为疾病及其进展的有用生物学标志物16。

我们的目标是确定一种方法，能够在尽可能接近生理条件的情况下，检测人单核细胞及其亚群的葡萄糖转运蛋白表达和葡萄糖摄取能力。以往的研究曾检测过单核细胞的葡萄糖转运蛋白表达和葡萄糖摄取17,18，但这些方法使用的是分离后的单核细胞，其蛋白表达可能与生理状态存在差异19，且尚无先前研究针对人单核细胞亚群进行分析。我们采用多参数流式细胞术，描述了一种可在未经处理的全血中，对总单核细胞及单核细胞亚群（基于CD14和CD16的表达）的葡萄糖转运蛋白表达以及荧光标记的葡萄糖类似物2-NBDG的摄取情况进行检测的方法。

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方案

注意：HIV 感染者和未感染 HIV 的受试者分别从澳大利亚维多利亚州墨尔本阿尔弗雷德医院的传染病科及当地社区招募。所有参与者均签署了知情同意书，研究已获得阿尔弗雷德医院研究与伦理委员会的批准。

1. 单核细胞及单核细胞亚群中Glut1细胞表面检测

  1. 使用柠檬酸ACD-B抗凝管采集血液，并在采集后1小时内于生物安全柜中开始实验。
  2. 将100 µl血液加入聚丙烯管中。在冰上加入2 ml 1x裂解液（见材料表），轻轻吹打混匀。冰上孵育15分钟。以220 × g离心5分钟。
  3. 弃上清，用约2–4 ml洗涤液（含0.5% BSA的1x PBS）重悬细胞，洗涤两次，每次以220 × g离心5分钟。
  4. 用移液器小心吸除尽可能多的洗涤液。将管置于冰上，并用100 µl洗涤液重悬细胞。
  5. 为鉴定特定的单核细胞亚群，使用步骤1.4中制备的每100 µl细胞悬液，加入以下体积的抗体：5 µl anti-CD3-PE、5 µl anti-CD14-APC、5 µl anti-CD16-PECy7、5 µl Glut1-FITC 或 IgG2b-FITC（同型对照管）。
  6. 避光冰上孵育30分钟，用洗涤液洗涤两次，然后用200–300 µl含0.5%甲醛的1x PBS固定。
  7. 在24小时内使用可检测4色的流式细胞仪进行分析，激发与发射波长如下：FITC（488, 530）、PE（488, 575）、PECy7（488, 780）、APC（633, 660）10。

2. 单核细胞的葡萄糖摄取

  1. 用移液器将步骤 1.1 中采集的 90 µl 血液加入聚丙烯管中。向 90 µl 血液中加入 10 µl 浓度为 14.60 µM 的 2-NBDG 工作液（终浓度为 1.46 mM），轻轻弹击管壁混匀。必须用铝箔包裹管子以避免 2-NBDG 暴露于光线下，这一点至关重要。
  2. 在 37 °C 避光孵育 15–30 分钟，然后立即置于冰上。在冰上时向管中加入 4 ml 1x FACS 溶血溶液，在 4 °C 下以 220 × g 离心 5 分钟。
  3. 加入 4 ml 洗涤液（含 0.5% BSA 的 1x PBS）洗涤一次，在 4 °C 下以 220 × g 离心 5 分钟。倾去上清液，将管置于冰上。
  4. 用抗体对细胞染色：加入 5 µl anti-CD3-PE、5 µl anti-CD14-APC 和 5 µl anti-CD16-PECy7。混匀后置于冰上，避光孵育 30 分钟。
    注意：在此期间，确保流式细胞仪已准备就绪，可立即进行分析。使用以下激发和发射波长检测细胞：2-NBDG（488，530）、PE（488，575）、PECy7（488，780）、APC（633，660）。
  5. 向管中加入 4 ml 冰冷的洗涤缓冲液（含 0.5% BSA 的 1x PBS）。在 4 °C 下以 220 × g 离心 5 分钟，洗涤一次。倾去上清液，加入 200–300 µl 冰冷的 PBS，避光（用铝箔包裹）置于冰上。在 10 分钟内使用与步骤 2.4 相同的激发和发射波长设置在流式细胞仪上进行分析。

3. 数据采集与分析

注意：假定读者具备流式细胞术及数据分析的相关知识。

  1. 使用能够进行至少四色分析的流式细胞仪，利用未染色和单染样本设置补偿。
    注意：可使用FITC标记的CD4和CD14进行单染，以完成Glut1和2-NBDG的补偿。
  2. 在获取样本前设置并标记适当的窗口。围绕单核细胞群绘制门控，以中等速度每样本获取100,000至300,000个事件，每个补偿样本获取50,000个事件即可。
    注意：补偿可在样本获取前进行，也可在单细胞分析软件中按照标准流程完成。
  3. 将数据导出并保存至适当位置。打开FlowJo等单细胞分析软件或其他分析软件（补充图1），按指定方式拖放样本（补充图2）。
  4. 双击打开文件（补充图3）。根据前向散射和侧向散射特性绘制圆形门控以圈定单核细胞群，如图1A和补充图4所示。双击单核细胞群，观察并围绕CD3-群体绘制方框（补充图4）。
  5. 双击CD3-群体。为观察单核细胞亚群，在“x”轴选择CD14-APC，“y”轴选择CD16-PECy7，并进行相应标注（补充图5）。
  6. 当无明显阳性和阴性群体时，测量特定单核细胞亚群中Glut1或2-NBDG摄取的表达水平。通过减去同型对照和无2-NBDG背景值，确定Glut1和2-NBDG的平均荧光强度（MFI）（补充图6）。
  7. 当存在明确定义的群体时，使用IgG2b-FITC设置门控，并确定阳性细胞百分比（图3）。
    注意：使用此方法分析总的CD14+单核细胞。由于2-NBDG摄取通常表现为荧光强度的偏移，因此数据最好以MFI值和直方图形式呈现。

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结果

必须对每种荧光染料进行单独补偿，以防止荧光信号溢出。首先根据前向散射和侧向散射的门控来富集单核细胞。所展示的图谱代表了此前已报道的至少六项独立实验的结果，这些实验均使用来自六名或更多参与者的全血样本进行10。图1A显示了基于细胞散射特性对单核细胞进行初步门控，并通过选择CD3-细胞群排除T细胞。随后单独检测CD14表达，或联合检测CD16表达，以鉴定总单核细胞或单核细胞亚群，如图1B和图1C所示。在分析单核细胞亚群时，应采用此前描述的命名规则12：经典型单核细胞（CD14++CD16-）的CD14 MFI应比同型对照高约100倍，而CD16 MFI应与同型对照相近；中间型单核细胞（CD14++CD16+）的CD14 MFI应比同型对照高约100倍，CD16 MFI应比同型对照高约10倍；非经典型单核细胞（CD14

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讨论

本文所述方案详细介绍了一种简便的方法，用于检测全血中单核细胞及其亚群的葡萄糖转运蛋白表达及荧光葡萄糖类似物的摄取情况。通过评估全血中2-NBDG的摄取，该技术可实现接近生理条件下的分析 体内一项先前的研究通过密度梯度离心法从全血中分离单核细胞，并检测了其对6-NBDG的摄取17然而，该研究未考察单核细胞亚群，且从全血中分离单核细胞可能改变某些细胞表面分子的表达19放射性葡萄糖示踪剂也已被用于测量单核细胞对葡萄糖的摄取20,21但该方法需预先分离单核细胞，且涉及放射性物质的使用，需要采取严格的安全防护措施。本方案采用常规生物安全操作，操作步骤简便，可在模拟体内条件下，通过流式细胞术检测单核细胞及其亚群对2-NBDG的摄取。

2-NBDG 可进入糖酵解途径，并已被证明会被细胞代谢为非荧光性分子22。因此，在 2-NBDG 孵育后，必须将细胞保持在 4 °C 的低温环境中，以限制其代谢。6-NBDG 是另一种可用的荧光葡萄糖类似物，但其应用价值较低，因为它无法进入糖酵解途径，因而不能...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

本研究由澳大利亚艾滋病和肝炎病毒学研究中心（ACH2）以及华盛顿大学艾滋病研究中心（CFAR）于2010年提供的发展基金（CNIHR）资助。CFAR是美国国立卫生研究院（NIH）资助的项目，资助编号为AI027757，由以下NIH研究所和中心支持（NIAID、NCI、NIMH、NIDA、NICHD、NHLBI、NIA）。C.S.P. 获得了CNIHR和ACH2基金的资助。SMC获得了澳大利亚国家卫生与医学研究理事会（NHMRC）主要研究学者基金。作者谨此感谢伯内特研究所获得的维多利亚州运营基础设施支持计划对本研究工作的贡献。我们感谢AMREP流式细胞术核心设施的Geza Paukovic和Eva Orlowski-Oliver在流式细胞术培训和技术咨询方面提供的帮助。我们感谢Angus Morgan在媒体指导和视频拍摄组织方面给予的支持。  我们向Jesse Masson和Jehad Abdulaziz K. Alzahrani在视频拍摄期间提供的实验室协助表示感谢。 我们感谢澳大利亚新南威尔士大学医学科学学院David Simar博士提供的关键性方法学建议。C.S.P. 谨此感谢www.nice-consultants.com在图形设计方面的咨询支持。

作者贡献：

C.S.P. 构思了项目，设计并实施了实验，分析和解释了数据，并撰写了手稿。J.J.A. 解释了数据并撰写了手稿。T.R.B. 撰写了手稿。J.M.M. 解释了数据，提出了关键性的学术建议，并审阅了手稿。S.M.C. 解释了数据，提出了关键性的学术建议，并审阅了手稿。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
9 ml VACUETT ACD-B 抗凝管Greiner Bio-One GmbH455094
5 ml 无菌聚丙烯管BD Biosciences352063
牛血清白蛋白（BSA）Sigma-AldrichA7906
16% 甲醛溶液Electron Microscopy Science15710
BD FACS 溶血溶液（10x）BD Biosciences349202用去离子水将 BD FACS 溶血溶液按 1/10 稀释，得到工作浓度溶液（4 °C 下可保存至多 1 周）
anti-CD3-PEBD Biosciences555340
anti-CD14-APCBD Biosciences555399
anti-CD16-PECy7BD Biosciences557744
anti-Glut1-FITCR & D SystemsFAB1418F
IgG2b-FITCR & D SystemsIC0041F
2-NBDGLife technologiesN13195将 5 mg 2-NBDG 溶于 1 ml 去离子水中，配制成 14.60 mM 的储存液（4 °C 下可保存至多 6 个月）。使用时将储存液用 1x DPBS 按 1/100 稀释，得到工作浓度溶液。用铝箔包裹避光（4 °C 下可保存至多 1 周）
Dulbecco’s 磷酸盐缓冲液（1x）Life technologies14190-144配制洗涤液时，每 100 ml DPBS 中加入 0.5 g BSA（4 °C 下可保存至多 2 周）

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标签

2 NBDG CD14 CD16 HIV

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