单核细胞是人类先天免疫系统的重要组成部分，在活化时依赖糖酵解代谢。本文介绍一种流式细胞术方案，用于检测新鲜全血中总单核细胞及单核细胞亚群的葡萄糖转运蛋白表达和葡萄糖摄取能力。
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本文内容
摘要
摘要
单核细胞是天然免疫细胞，可被病原体以及某些慢性炎症性疾病相关的炎症所激活。单核细胞的激活会诱导效应功能，并伴随从氧化代谢向糖酵解代谢的转变，同时葡萄糖转运蛋白的表达增加。单核细胞的训练免疫（一种天然免疫记忆形式）也表现出增强的糖酵解代谢。尽管 体外 已有研究描述了单核细胞葡萄糖转运蛋白表达及葡萄糖摄取的检测方法，但尚无研究采用多参数流式细胞术在全血中进行检测。本文介绍一种多参数流式细胞术检测全血中总单核细胞及经典型单核细胞（CD14++CD16-），中等水平（CD14++CD16+）和非经典（CD14+CD16++单核细胞亚群。该方法可用于检测稳态及炎症性疾病期间总单核细胞和单核细胞亚群的葡萄糖转运蛋白表达及葡萄糖摄取情况，并可经简单修改后用于检测血液中其他白细胞及其亚群的葡萄糖摄取。
引言
单核细胞是人类先天免疫系统的主要组成部分，可迅速迁移至感染和炎症部位1。单核细胞的活化对于限制病原体引起的急性损伤至关重要，同时也参与多种慢性疾病的发生发展过程，包括动脉粥样硬化2、癌症3和艾滋病病毒（HIV）感染4,5。
静息单核细胞与活化单核细胞的代谢方式存在显著差异，静息单核细胞主要依赖氧化代谢，而活化单核细胞则主要依赖糖酵解代谢（即，葡萄糖发酵为乳酸）6单核细胞的活化会诱导葡萄糖转运蛋白的表达，从而促进葡萄糖摄取以支持糖酵解代谢7单核细胞葡萄糖转运蛋白1（Glut1）便是此类在活化过程中上调的转运蛋白之一，其表达已被证实可在体外及肥胖小鼠的脂肪组织中促进促炎性细胞因子的产生8卡波西肉瘤相关疱疹病毒感染单核细胞系导致细胞Glut1表达上调9，我们最近发现，在慢性 HIV 感染期间，未经治疗和接受联合抗逆转录病毒治疗的感染者体内表达 Glut1 的单核细胞比例均有所增加10综上所述，这些研究表明单核细胞的葡萄糖摄取和糖酵解代谢在多种炎症性疾病中具有重要作用。因此，一种能够检测稳态及炎症性疾病状态下单核细胞Glut1表达和葡萄糖摄取的简便方法，可能对广大科研人员具有重要应用价值。
人类单核细胞具有异质性，可....
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方案
注意：HIV 感染者和未感染 HIV 的受试者分别从澳大利亚维多利亚州墨尔本阿尔弗雷德医院的传染病科及当地社区招募。所有参与者均签署了知情同意书，研究已获得阿尔弗雷德医院研究与伦理委员会的批准。
1. 单核细胞及单核细胞亚群中Glut1细胞表面检测
- 使用柠檬酸ACD-B抗凝管采集血液，并在采集后1小时内于生物安全柜中开始实验。
- 将100 µl血液加入聚丙烯管中。在冰上加入2 ml 1x裂解液（见材料表），轻轻吹打混匀。冰上孵育15分钟。以220 × g离心5分钟。
- 弃上清，用约2–4 ml洗涤液（含0.5% BSA的1x PBS）重悬细胞，洗涤两次，每次以220 × g离心5分钟。
- 用移液器小心吸除尽可能多的洗涤液。将管置于冰上，并用100 µl洗涤液重悬细胞。
- 为鉴定特定的单核细胞亚群，使用步骤1.4中制备的每100 µl细胞悬液，加入以下体积的抗体：5 µl anti-CD3-PE、5 µl anti-CD14-APC、5 µl anti-CD16-PECy7、5 µl Glut1-FITC 或 IgG2b-FITC（同型对照管）。
- 避光冰上孵育30分钟，用洗涤液洗涤两次，然后用200–300 µl含0.5%甲醛的1x PBS固定。
- 在24小时内使用可检测4色的流式细胞仪进行分析，激发与发射波长如....
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结果
必须对单个荧光染料进行补偿，以防止荧光溢出。首先根据前向散射和侧向散射进行设门，富集单核细胞。所展示的图谱来自至少六项独立实验，这些实验均如先前报道10那样，使用来自六名或更多参与者的全血样本进行。图1A显示了基于细胞散射特性对单核细胞进行初步设门，并通过在CD3-群体内设门排除T细胞。随后单独根据CD14表达，或结合CD16表达进行设门，以分别鉴定总单核细胞或单核细胞亚群，如图1B和图1C所示。在分析单核细胞亚群时，应采用如下命名法，如先前所述12：经典单核细胞（CD14++CD16-）的CD14 MFI应比同型对照高约100倍，而CD16 MFI应与同型对照相近；中间型单核细胞（CD14++CD16+）的CD14 MFI应比同型对照高约100倍，CD16 MFI应比同型对照高约10倍；非经典单核细胞（CD14
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讨论
本文所述方案详细介绍了一种简便的方法，用于检测全血中单核细胞及其亚群的葡萄糖转运蛋白表达及荧光葡萄糖类似物的摄取情况。通过评估全血中2-NBDG的摄取，该技术可实现接近生理条件下的分析 体内一项先前的研究通过密度梯度离心法从全血中分离单核细胞，并检测了其对6-NBDG的摄取17然而，该研究未考察单核细胞亚群，且从全血中分离单核细胞可能改变某些细胞表面分子的表达19放射性葡萄糖示踪剂也已被用于测量单核细胞对葡萄糖的摄取20,21但该方法需预先分离单核细胞，且涉及放射性物质的使用，需要采取严格的安全防护措施。本方案采用常规生物安全操作，操作步骤简便，可在模拟体内条件下，通过流式细胞术检测单核细胞及其亚群对2-NBDG的摄取。
2-NBDG 可进入糖酵解途径，并已被证明会被细胞代谢为非荧光性分子22。因此，在 2-NBDG 孵育后，必须将细胞保持在 4 °C 的低温环境中，以限制其代谢。6-NBDG 是另一种可用的荧光葡萄糖类似物，但其应用价值较低，因为它无法进入糖酵解途径，因而不能.......
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
本研究由澳大利亚艾滋病和肝炎病毒学研究中心（ACH2）以及华盛顿大学艾滋病研究中心（CFAR）于2010年提供的发展基金（CNIHR）资助。CFAR是美国国立卫生研究院（NIH）资助的项目，资助编号为AI027757，由以下NIH研究所和中心支持（NIAID、NCI、NIMH、NIDA、NICHD、NHLBI、NIA）。C.S.P. 获得了CNIHR和ACH2基金的资助。SMC获得了澳大利亚国家卫生与医学研究理事会（NHMRC）主要研究学者基金。作者谨此感谢伯内特研究所获得的维多利亚州运营基础设施支持计划对本研究工作的贡献。我们感谢AMREP流式细胞术核心设施的Geza Paukovic和Eva Orlowski-Oliver在流式细胞术培训和技术咨询方面提供的帮助。我们感谢Angus Morgan在媒体指导和视频拍摄组织方面给予的支持。 我们向Jesse Masson和Jehad Abdulaziz K. Alzahrani在视频拍摄期间提供的实验室协助表示感谢。 我们感谢澳大利亚新南威尔士大学医学科学学院David Simar博士提供的关键性方法学建议。C.S.P. 谨此感谢www.nice-consultants.com在图形设计方面的咨询支持。
作者贡献：
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 9 ml VACUETT ACD-B 抗凝管 | Greiner Bio-One GmbH | 455094 | |
| 5 ml 无菌聚丙烯管 | BD Biosciences | 352063 | |
| 牛血清白蛋白（BSA） | Sigma-Aldrich | A7906 | |
| 16% 甲醛溶液 | Electron Microscopy Science | 15710 | |
| BD FACS 溶血溶液（10x） | BD Biosciences | 349202 | 用去离子水将 BD FACS 溶血溶液按 1/10 稀释，得到工作浓度溶液（4 °C 下可保存至多 1 周） |
| anti-CD3-PE | BD Biosciences | 555340 | |
| anti-CD14-APC | BD Biosciences | 555399 | |
| anti-CD16-PECy7 | BD Biosciences | 557744 | |
| anti-Glut1-FITC | R & D Systems | FAB1418F | |
| IgG2b-FITC | R & D Systems | IC0041F | |
| 2-NBDG | Life technologies | N13195 | 将 5 mg 2-NBDG 溶于 1 ml 去离子水中，配制成 14.60 mM 的储存液（4 °C 下可保存至多 6 个月）。使用时将储存液用 1x DPBS 按 1/100 稀释，得到工作浓度溶液。用铝箔包裹避光（4 °C 下可保存至多 1 周） |
| Dulbecco’s 磷酸盐缓冲液（1x） | Life technologies | 14190-144 | 配制洗涤液时，每 100 ml DPBS 中加入 0.5 g BSA（4 °C 下可保存至多 2 周） |
参考文献
- Shi, C., Pamer, E. G. Monocyte recruitment during infection and inflammation. Nat Rev Immunol. 11, 762-774 (2011).
- Woollard, K. J., Geissmann, F. Monocytes in atherosclerosis: subsets and functions. Nat Rev Cardiol. 7, 77-86 (2010).
- Richards, D. M., Hettinger, J., ....
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重印与许可
