使用聚二甲基硅氧烷薄膜自动形成脂双层膜

摘要

我们展示了一种可储存、可运输的脂双层形成系统。当冷冻的膜前体恢复至室温后，可在1小时内形成脂双层膜，成功率超过80%。该系统将减少与离子通道研究相关的繁琐操作和对专业技术的依赖。

摘要

人工脂双层膜（即黑脂膜，BLM）是研究离子通道、蛋白质相互作用以及生物传感器应用的有力工具。然而，传统的BLM制备技术存在多种缺陷，通常需要特定的专业知识和繁琐的操作流程。特别是，传统BLM的形成成功率较低，且成膜时间不稳定。本文展示了一种可储存、可运输的BLM制备系统，通过将传统使用的薄膜材料（如聚四氟乙烯、聚甲醛、聚苯乙烯）替换为聚二甲基硅氧烷（PDMS），实现了对膜减薄时间的可控性，并提高了BLM的形成效率。在本实验中，采用具有多孔结构的聚合物，例如PDMS薄膜。此外，与传统使用的低粘度溶剂不同，使用角鲨烯可通过PDMS缓慢吸收溶剂，从而实现对减薄时间的控制，并延长膜的寿命。同时，通过使用角鲨烯与十六烷的混合物，提高了脂质溶液的凝固点（约16 °C），并制备出可无限期储存且便于运输的膜前体。这些膜前体将BLM的形成时间缩短至<1小时，并实现了约80%的BLM形成率。此外，利用短杆菌肽A进行的离子通道实验验证了该膜系统的可行性。

引言

人工脂双层膜，又称黑脂膜（BLM），是阐明细胞膜和离子通道机制以及理解离子通道与离子/分子之间相互作用的重要工具。^1-7 尽管膜片钳技术通常被视为细胞膜研究的金标准，但其操作繁琐，且对离子通道的测量需要技术娴熟的操作人员。⁸ 虽然人工重建的脂双层膜已作为离子通道研究的替代工具出现，^9,10 但其同样涉及复杂的操作流程和特定的专业知识。此外，这类膜易受机械扰动的影响。因此，迄今为止所提出的脂双层技术在实际应用中仍存在局限性。¹¹

为了增强脂双层膜的稳定性和寿命，Costello 等¹² 以及 Ide 和 Yanagida¹³ 设计了一种由水凝胶支撑的自支撑脂双层膜。尽管其寿命有所延长（< 24 小时），但膜的机械强度并未得到改善。Jeon 等¹⁴ 开发了一种水凝胶封装膜（HEM），实现了水凝胶与脂双层之间的紧密接触，从而显著延长了膜的寿命（可达数天）。为进一步延长 HEM 的使用寿命，Malmstadt 和 Jeon 等 通过原位共价偶联（in-situ covalent conjugation）构建了具有水凝胶-脂质结合的水凝胶封装膜（cgHEM）¹⁵。在这两种系统中，膜的寿命均显著增加（> 10 天）。然而，这些膜....

方案

1. 溶液配制

1. 缓冲液的配制：
   1. 配制缓冲液：将1 M KCl（氯化钾）、10 mM Tris-HCl（三羟甲基氨基甲烷盐酸盐）和1 mM EDTA（乙二胺四乙酸）溶于蒸馏水中，并调节pH至8.0。
   2. 使用 0.20 µm 滤器过滤溶液。为达到灭菌目的，将溶液在 121 °C 下高压灭菌 15 分钟。
2. 预涂脂质溶液的制备：
   1. 为配制用于预涂覆的脂质溶液，将3% DPhPC（1,2-二植烷酰基-sn-甘油-3-磷脂酰胆碱）脂质（w:v），按2:8比例混合 n-癸烷与十六烷（体积比）混合，使用旋转器搅拌过夜。
3. 用于膜形成的脂质溶液制备：
   1. 为制备用于膜形成的脂质溶液，将0.1% DPhPC（1, 2-二植烷酰基-sn-甘油-3-磷脂酰胆碱）脂质（w:v），溶于体积比为2:8的角鲨烯与十六烷混合液中。使用旋转仪搅拌过夜。

2. PDMS 薄膜的形成

1. 将PDMS与固化剂按9:1（w/w）的比例在混合杯中混合，制备PDMS预聚物。取5 g PDMS预聚物加入培养皿中，形成PDMS薄膜（厚度200–250 µm）。使用旋涂仪以800 rpm转速旋涂10秒，使PDMS预....

结果

优化 MPES 溶液组成
为成功从 MPES 重建脂双层膜，测试了不同组成的脂质和溶剂。含有 3% DPhPC¹⁴ 的 n-十二烷与十六烷混合物组成的 MP 体系，其成膜成功率较低（约 27%）。此外，由于 PDMS 薄膜会持续萃取脂质溶液，因此有必要优化溶剂组成以维持完整的脂双层膜结构。因此，采用黏度为 12 cP（20 °C 时）¹⁸ 的角鲨烯替代黏度为 0.92 cP（20 °C 时）¹⁹ 的 n-十二烷。使用角鲨烯后，由于 PDMS 对溶剂的吸收速率降低，膜的稳定性和寿命均得到提高。表 1 比较了不同溶剂组成下膜的变薄时间、寿命和成膜成功率。

当使用正癸烷（n-decane）时，由于聚二甲基硅氧烷（PDMS）薄膜对溶剂的快速吸收，膜的形成不一致，且膜经.......

讨论

我们的BLM形成技术为细胞膜和离子通道研究提供了一种强有力的工具，与传统技术相比，后者在工业应用方面潜力有限。我们采用PDMS薄膜开发了一种膜前体，并设计出一种可快速自组装的冷冻膜前体。

与传统的疏水膜形成方法（仅通过膜与脂质溶液之间的表面相互作用形成膜）不同²⁰，在聚二甲基硅氧烷（PDMS）薄膜上，膜的变薄过程不仅依赖于表面相互作用，还涉及PDMS薄膜对溶剂的萃取作用。溶剂渗入PDMS的孔隙以及在PDMS薄膜表面的润湿，促进了脂质双层快速且一致地形成。此外，通过结合高黏度的角鲨烯和高凝固点的十六烷，可实现对膜形成时间的可控调节。利用该系统，我们能够在提高双层脂膜（BLM）形成成功率（< 80%）的同时，显著缩短膜形成时间（< 40 分钟）。由于使用了高凝固点的溶剂，膜前体可被储存和运输。此外，由于在加入缓冲液后膜的形成过程可自动进行，我们 Eliminated 对高度专业训练人员依赖的复杂成膜操作步骤。

在本实验方案中，制备了一种带有500 µm孔径的聚二甲基硅氧烷（PDMS）薄膜，并在该孔.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
氯化钾	Sigma-Aldrich	P9333	用于缓冲液溶液
三羟甲基氨基甲烷盐酸盐	Sigma-Aldrich	1185-53-1	用于缓冲液溶液
乙二胺四乙酸	Sigma-Aldrich	60-00-4	用于缓冲液溶液
n-十二烷	Sigma-Aldrich	44074-U	用于脂质溶液
十六烷	Sigma-Aldrich	544-76-3	用于脂质溶液
角鲨烯	Sigma-Aldrich	S3626	用于脂质溶液
短杆菌肽A	Sigma-Aldrich	11029-61-1	膜蛋白
1,2-二植烷酰基-sn-甘油-3-磷脂酰胆碱	Avanti Polar Lipids, Inc.	850356	用于膜形成
Sylgard 184a 和 184b 弹性体试剂盒	Dow Corning Asia		用于制备PDMS薄膜
0.2 μm 滤膜	Sartorius stedim	16534----------K	用于过滤缓冲液溶液
旋转混合仪	FinePCR	AG	用于均匀溶解脂质
高压灭菌器	Biofree	BF-60AC	用于灭菌缓冲液溶液
旋涂仪	Shinu Mst	SP-60P	用于涂布PDMS预聚物
真空干燥器	Welch	2042-22	用于去除PDMS预聚物中的气泡
500 μm 打孔器	Harris Uni-Core	0.5	用于在PDMS薄膜上创建孔径
数控机床	SME trading	SME 2518	用于制造膜形成腔室
卤素光纤照明器	Motic	MLC-150C	用于光学观察PDMS薄膜孔径的照明
数字显微镜	Digital blue	QX-5	用于光学观察脂双层膜的形成
电极	A-M Systems		用于电学监测膜的形成
微电极放大器（Axopatch放大器）	Axon Instruments	Axopatch 200B Amplifier	用于测量膜的电容（在文稿中描述为微电极放大器）