我们展示了一种可储存、可运输的脂双层形成系统。当冷冻的膜前体恢复至室温后，可在1小时内形成脂双层膜，成功率超过80%。该系统将减少与离子通道研究相关的繁琐操作和对专业技术的依赖。
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摘要
摘要
人工脂双层膜（即黑脂膜，BLM）是研究离子通道、蛋白质相互作用以及生物传感器应用的有力工具。然而，传统的BLM制备技术存在多种缺陷，通常需要特定的专业知识和繁琐的操作流程。特别是，传统BLM的形成成功率较低，且成膜时间不稳定。本文展示了一种可储存、可运输的BLM制备系统，通过将传统使用的薄膜材料（如聚四氟乙烯、聚甲醛、聚苯乙烯）替换为聚二甲基硅氧烷（PDMS），实现了对膜减薄时间的可控性，并提高了BLM的形成效率。在本实验中，采用具有多孔结构的聚合物，例如PDMS薄膜。此外，与传统使用的低粘度溶剂不同，使用角鲨烯可通过PDMS缓慢吸收溶剂，从而实现对减薄时间的控制，并延长膜的寿命。同时，通过使用角鲨烯与十六烷的混合物，提高了脂质溶液的凝固点（约16 °C），并制备出可无限期储存且便于运输的膜前体。这些膜前体将BLM的形成时间缩短至<1小时，并实现了约80%的BLM形成率。此外，利用短杆菌肽A进行的离子通道实验验证了该膜系统的可行性。
引言
人工脂双层膜，又称黑脂膜（BLM），是阐明细胞膜和离子通道机制以及理解离子通道与离子/分子之间相互作用的重要工具。1-7 尽管膜片钳技术通常被视为细胞膜研究的金标准，但其操作繁琐，且对离子通道的测量需要技术娴熟的操作人员。8 虽然人工重建的脂双层膜已作为离子通道研究的替代工具出现，9,10 但其同样涉及复杂的操作流程和特定的专业知识。此外，这类膜易受机械扰动的影响。因此，迄今为止所提出的脂双层技术在实际应用中仍存在局限性。11
为了增强脂双层膜的稳定性和寿命，Costello 等12 以及 Ide 和 Yanagida13 设计了一种由水凝胶支撑的自支撑脂双层膜。尽管其寿命有所延长（< 24 小时），但膜的机械强度并未得到改善。Jeon 等14 开发了一种水凝胶封装膜（HEM），实现了水凝胶与脂双层之间的紧密接触，从而显著延长了膜的寿命（可达数天）。为进一步延长 HEM 的使用寿命，Malmstadt 和 Jeon 等 通过原位共价偶联（in-situ covalent conjugation）构建了具有水凝胶-脂质结合的水凝胶封装膜（cgHEM）15。在这两种系统中，膜的寿命均显著增加（> 10 天）。然而，这些膜形成系统仍不够稳定，无法进行储存或运输，因而难以推广使用，限制了脂双层技术的广泛应用。
脂质双层平台的开发主要围绕提高人工脂双层膜（BLMs）的稳定性和寿命展开。尽管近年来BLMs的寿命已得到显著改善，但由于缺乏可运输性和可储存性，其应用仍受到限制。为解决这些问题，Jeon 等 创建了一种可储存的膜系统，并引入了膜前体（MP）。16 为了构建一个MP，他们准备了一种混合物 n-含有3% DPhPC（1,2-二植烷酰基-磷脂酰胆碱）的癸烷和十六烷sn-甘油-3-磷脂酰胆碱）以调控脂质溶液的冰点，使其在约14 °C时冻结（低于室温，高于普通冰箱温度）。在本实验中，将微孔（MP）覆盖于聚四氟乙烯（PTFE）膜上的小孔处，随后在4 °C冰箱中冷冻。当MP被转移至室温时，MP解冻并自动形成脂双层，从而避免了传统膜形成过程中所需的专业技术。然而，由MP制备的双层脂膜（BLM）成功率仅为约27%，且成膜时间不一致（30分钟至24小时），限制了其实际应用。
在本研究中，采用聚二甲基硅氧烷（PDMS）薄膜替代传统的疏水性薄膜（如聚四氟乙烯、聚甲醛、聚苯乙烯），以（a）控制制备时间，以及（b）提高双层脂膜（BLM）形成的成功率，该方法此前已被Ryu et al.17 报道。在此，由于PDMS具有多孔特性，可促进溶剂的萃取，从而促进膜的形成，并成功实现了对成膜时间的控制。在该系统中，随着脂质溶液被吸收进入PDMS薄膜，成膜时间保持一致。此外，由于在脂质溶液中添加了角鲨烯，减缓了溶剂向PDMS薄膜中的吸收速率，从而延长了膜的寿命。我们进行了光学和电学测量，以验证利用该技术形成的膜适用于离子通道研究。
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方案
1. 溶液配制
- 缓冲液的配制：
- 配制缓冲液：将1 M KCl（氯化钾）、10 mM Tris-HCl（三羟甲基氨基甲烷盐酸盐）和1 mM EDTA（乙二胺四乙酸）溶于蒸馏水中，并调节pH至8.0。
- 使用 0.20 µm 滤器过滤溶液。为达到灭菌目的，将溶液在 121 °C 下高压灭菌 15 分钟。
- 预涂脂质溶液的制备：
- 为配制用于预涂覆的脂质溶液，将3% DPhPC（1,2-二植烷酰基-sn-甘油-3-磷脂酰胆碱）脂质（w:v），按2:8比例混合 n-癸烷与十六烷（体积比）混合，使用旋转器搅拌过夜。
- 用于膜形成的脂质溶液制备：
- 为制备用于膜形成的脂质溶液，将0.1% DPhPC（1, 2-二植烷酰基-sn-甘油-3-磷脂酰胆碱）脂质（w:v），溶于体积比为2:8的角鲨烯与十六烷混合液中。使用旋转仪搅拌过夜。
2. PDMS 薄膜的形成
- 将PDMS与固化剂按9:1（w/w）的比例在混合杯中混合，制备PDMS预聚物。取5 g PDMS预聚物加入培养皿中，形成PDMS薄膜（厚度200–250 µm）。使用旋涂仪以800 rpm转速旋涂10秒，使PDMS预聚物均匀铺展成薄膜。
- 将培养皿置于真空干燥器中，在100 mTorr压力下抽真空2小时，以去除气泡。为使预聚物薄膜聚合，在70 °C下烘烤5小时。
- 为了制备方形PDMS薄膜，将固化的PDMS薄膜切割成2 x 2 cm2 方块。使用500 µm的微型打孔器在PDMS薄膜中心打孔。用3% DPhPC脂质溶液（溶于2:8的氯仿-甲醇混合液）预先涂覆孔洞 n-癸烷和十六烷
3. 腔室的制备与组装
- 为制备双层脂膜（BLM）腔室，使用三维绘图软件设计两个对称的腔室部件，外部尺寸为 4 cm × 1.5 cm × 1 cm，内井尺寸为 1.5 cm × 1.3 cm × 0.8 cm17。
- 使用聚四氟乙烯（PTFE）块并通过数控（CNC）机床加工腔室，同时遵循制造商的操作说明。
4. 反应室组装
- 组装腔室时，将预涂覆的PDMS薄膜置于两个PTFE块之间，使PDMS薄膜上的孔与腔室中的孔对齐。
- 使用涂有润滑脂的盖玻片密封腔室的外缘（便于光学观察）。用螺母和螺栓固定组装好的腔室。
注意：确保腔室密封良好，无液体泄漏。
5. 快速自组装膜前体（MPES）的形成
- 使用移液器将 0.5 µl 的 0.1% DPhPC 脂质（溶于 2:8 n-十二烷:十六烷）滴加到与腔室组装好的 PDMS 薄膜孔径上。
- 使用前，将腔室储存在低于 10 °C 的冰箱或冷冻柜中。
6. 膜的形成与验证
- 使用 MPES 制备双层脂膜（BLM）时，先将腔室从冰箱中取出，并在腔室两侧各加入 2 ml 缓冲溶液。将腔室静置 < 10 分钟，直至冷冻的膜前体完全融化。
- 将腔室置于显微操作器上，以精确控制其相对于光源和显微镜的高度。使用卤素光纤光源照射腔室的一侧，作为照明光源，使 PDMS 薄膜上的小孔区域变亮，以便通过光学手段观察双层脂膜的形成过程。
- 在另一侧，将数字显微镜垂直于光源方向放置，用于观察双层脂膜的形成（放大倍数为 200 倍）。
- 为确认双层脂膜的形成，观察小孔中心区域，当该区域颜色比环状区域更亮时，表明膜已形成。
7. 电生理记录
- 进行电学测量时，使用直径为 208 µm 的银丝制备 Ag/Cl 电极，并将其浸入次氯酸钠溶液中漂白，时间需超过 > 1 分钟。将 Ag/Cl 电极分别插入 chamber 两侧，插入深度应足以使其浸入缓冲液中。
- 将电极连接至微电极放大器。通过电生理学软件，在膜两侧施加 ±10 mV 的三角波电压，以获取方波信号。通过点击 V_clamp (mV) 上标注的箭头来设定施加的电压值。
- 点击记录按钮（红色圆点图标）开始记录膜的电学特性。持续记录直至观察到稳定的方波信号，随后点击黑色方块图标停止记录。
8. 离子通道的整合
注意：当形成双层脂膜（BLM）时，短杆菌肽A（gA）会自发掺入，因为gA被直接加入脂质溶液中。
- 为观察gA通道活性，以5 kHz的采样率在膜两侧施加100 mV电压，以测量膜的钳制电位。通过点击V_clamp（mV）上指示的箭头来设定施加的电压。
- 通过点击记录按钮（红色圆点图标）记录gA整合的电学特性。持续记录直至观察到电流跳跃。通过点击黑色方块图标结束记录。
- 电学数据采集完成后，使用电生理学软件将数据通过100 Hz的低通贝塞尔滤波器进行滤波。
- 在滤波后的钳制电位数据中观察电流跳跃（每次电流跳跃约0.15 nS，代表一个gA离子通道的二聚化），以验证gA的整合。
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结果
优化 MPES 溶液组成
为成功从 MPES 重构脂双层膜，测试了不同组成的脂质与溶剂。含有 n-癸烷和十六烷并添加 3% DPhPC14 的 MP 体系，其成膜成功率较低（约 27%）。此外，由于 PDMS 膜会持续萃取脂质溶液，因此有必要优化溶剂组成以维持脂双层膜的完整性。因此，采用黏度为 12 cP（20 °C 时）18 的角鲨烯替代黏度为 0.92 cP（20 °C 时）19 的 n-癸烷。使用角鲨烯后，由于 PDMS 对溶剂的吸收速率降低，膜的稳定性和寿命均得到提高。表 1 比较了不同溶剂组成下膜的变薄时间、寿命和成膜成功率。
当 n-使用正癸烷时，由于聚二甲基硅氧烷（PDMS）薄膜快速吸收溶剂，膜的形成不一致，且膜通常在短时间内频繁破裂。而使用角鲨...
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讨论
我们的BLM形成技术为细胞膜和离子通道研究提供了一种强有力的工具，与传统技术相比，后者在工业应用方面潜力有限。我们采用PDMS薄膜开发了一种膜前体，并设计出一种可快速自组装的冷冻膜前体。
与传统的疏水膜形成方法（仅通过膜与脂质溶液之间的表面相互作用形成膜）不同20，在聚二甲基硅氧烷（PDMS）薄膜上，膜的变薄过程不仅依赖于表面相互作用，还涉及PDMS薄膜对溶剂的萃取作用。溶剂渗入PDMS的孔隙以及在PDMS薄膜表面的润湿，促进了脂质双层快速且一致地形成。此外，通过结合高黏度的角鲨烯和高凝固点的十六烷，可实现对膜形成时间的可控调节。利用该系统，我们能够在提高双层脂膜（BLM）形成成功率（< 80%）的同时，显著缩短膜形成时间（< 40 分钟）。由于使用了高凝固点的溶剂，膜前体可被储存和运输。此外，由于在加入缓冲液后膜的形成过程可自动进行，我们 Eliminated 对高度专业训练人员依赖的复杂成膜操作步骤。
在本实验方案中，制备了一种带有500 µm孔径的聚二甲基硅氧烷（PDMS）薄膜，并在该孔...
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
本研究工作得到了韩国国家研究基金会先锋研究中心项目（NRF-2012-0009575）和国家研究基金会资助项目（NRF-2012R1A1B4002413、NRF-2014R1A1A2059341）的支持。本研究工作还部分得到了仁荷大学研究基金的资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 氯化钾 | Sigma-Aldrich | P9333 | 用于缓冲液溶液 |
| 三羟甲基氨基甲烷盐酸盐 | Sigma-Aldrich | 1185-53-1 | 用于缓冲液溶液 |
| 乙二胺四乙酸 | Sigma-Aldrich | 60-00-4 | 用于缓冲液溶液 |
| n-十二烷 | Sigma-Aldrich | 44074-U | 用于脂质溶液 |
| 十六烷 | Sigma-Aldrich | 544-76-3 | 用于脂质溶液 |
| 角鲨烯 | Sigma-Aldrich | S3626 | 用于脂质溶液 |
| 短杆菌肽A | Sigma-Aldrich | 11029-61-1 | 膜蛋白 |
| 1,2-二植烷酰基-sn-甘油-3-磷脂酰胆碱 | Avanti Polar Lipids, Inc. | 850356 | 用于膜形成 |
| Sylgard 184a 和 184b 弹性体试剂盒 | Dow Corning Asia | 用于制备PDMS薄膜 | |
| 0.2 μm 滤膜 | Sartorius stedim | 16534----------K | 用于过滤缓冲液溶液 |
| 旋转混合仪 | FinePCR | AG | 用于均匀溶解脂质 |
| 高压灭菌器 | Biofree | BF-60AC | 用于灭菌缓冲液溶液 |
| 旋涂仪 | Shinu Mst | SP-60P | 用于涂布PDMS预聚物 |
| 真空干燥器 | Welch | 2042-22 | 用于去除PDMS预聚物中的气泡 |
| 500 μm 打孔器 | Harris Uni-Core | 0.5 | 用于在PDMS薄膜上创建孔径 |
| 数控机床 | SME trading | SME 2518 | 用于制造膜形成腔室 |
| 卤素光纤照明器 | Motic | MLC-150C | 用于光学观察PDMS薄膜孔径的照明 |
| 数字显微镜 | Digital blue | QX-5 | 用于光学观察脂双层膜的形成 |
| 电极 | A-M Systems | 用于电学监测膜的形成 | |
| 微电极放大器（Axopatch放大器） | Axon Instruments | Axopatch 200B Amplifier | 用于测量膜的电容（在文稿中描述为微电极放大器） |
参考文献
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