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方法文章

昆虫-机器混合系统：自由飞行甲虫（Mercynorrhina torquata）的远程无线电控制

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DOI：

10.3791/54260

⸱

2016年9月2日

 , 
1School of Mechanical and Aerospace Engineering, Nanyang Technological University

本文内容

摘要

本方案描述了构建昆虫-机器混合系统的过程，并对控制飞行昆虫转向运动所需的飞行肌进行无线电刺激。

摘要

无线电技术驱动的数字电子设备的发展，推动了小型无线神经肌肉记录仪和刺激器在飞行昆虫行为研究中的应用。该技术使得利用本方案中描述的活体昆虫平台构建昆虫-机器混合系统成为可能。此外，本方案还介绍了系统配置及自由飞行实验的操作流程，用于评估无束缚昆虫飞行肌肉的功能。作为示例，我们靶向第三腋骨片（3Ax）肌肉，以控制飞行甲虫向左或向右转向。在甲虫身体两侧的3Ax肌肉上分别植入细银丝电极，并将其连接至安装于甲虫前胸背板上的无线背包（即神经肌肉电刺激器）的输出端。在自由飞行过程中，通过交替刺激侧别（左侧或右侧）或改变刺激频率来激活肌肉。当刺激肌肉时，甲虫会向同侧转向，并且其转向角度随刺激频率的增加而呈梯度性变化。植入操作以及三维运动捕捉相机系统的体积校准需谨慎进行，以避免损伤肌肉或丢失标记点信号。该方法对昆虫飞行研究具有重要价值，有助于揭示目标飞行肌肉在自由飞行状态下的具体功能。

引言

昆虫-机器混合系统，通常被称为细胞机器人（cyborg insect）或生物机器人（biobot），是将活体昆虫平台与微型电子装置相结合的产物。该电子装置可由远程用户无线控制，通过植入式导线电极向昆虫的神经肌肉位点施加电信号，从而电刺激这些位点，诱导出用户期望的运动行为和动作。在该研究领域的早期阶段，研究人员仅能利用由表面贴装元件组成的简单模拟电路，对昆虫肌肉活动进行无线记录1-3。随着具备射频功能的片上系统技术的发展，不仅实现了对神经肌肉信号的无线记录，还实现了对活体昆虫神经肌肉位点的电刺激。目前，内置的无线微控制器已足够小型化，可安装在活体昆虫体表，且不会对其运动造成任何阻碍4-13。

内置无线电微控制器的开发使研究人员能够确定电刺激方案，以诱导期望的运动行为，从而控制目标昆虫的运动。在地面运动控制方面，研究人员已通过刺激蟑螂4,12,14、蜘蛛15和甲虫16,17的神经肌肉位点实现了行走控制。在空中飞行控制方面，通过不同方法实现了飞行的启动与停止，例如刺激甲虫的视叶（复眼中的大型神经簇）7,9以及蜜蜂的脑部亚区18；而转向控制则通过刺激蛾类的触角肌肉及腹部神经系统11,19，以及甲虫的飞行肌肉7,9,13得以实现。在大多数情况下，内置无线电微控制器被集成在定制设计的印刷电路板上，构成微型无线刺激器（即“背包”），并安装在目标昆虫体上。这使得能够对自由行走或飞行的昆虫实施无线电刺激。此类搭载微控制器的昆虫被称为昆虫-机器混合系统。

本研究描述了构建昆虫-机器混合系统的实验方案，其中以活体甲虫作为昆虫平台，并指导如何操作该机器人及其飞行控制系统的测试。选择第三腋片骨化区（3Ax）肌肉作为电刺激的目标肌肉，用于演示向左或向右转向控制13。将一对细银丝电极植入左侧和右侧的3Ax肌肉中。此外，在活体甲虫背部安装了一个背包。电极导线的另一端连接至微控制器的输出引脚。该背包体积足够小，可在甲虫飞行时携带。因此，实验人员能够远程刺激飞行中昆虫的目标肌肉，并观察其对刺激的反应。

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方案

1. 研究动物

  1. 将每只长臂金龟（Mecynorrhina torquata，体长6 cm，体重8 g）单独饲养在装有木屑垫料的塑料容器中。
  2. 每隔3天为每只甲虫提供一份糖胶（12 ml）作为食物。
  3. 保持饲养环境的温度和湿度分别为25 °C和60%。
  4. 在植入细导线电极前，测试每只甲虫的飞行能力。
    1. 轻轻将甲虫抛向空中。若该甲虫在连续5次试验中每次均能飞行超过10秒，则判定其具备正常的飞行能力，可用于后续飞行实验。为回收甲虫，可关闭房间内所有灯光使其处于黑暗状态，这将导致甲虫终止飞行。
      注意：甲虫被释放到空中后会自发开始飞行。建议在较大的封闭房间内进行飞行实验，例如如图1所示的房间（尺寸为16 x 8 x 4 m3，其中动作捕捉空间为12.5 x 8 x 4 m3），因为飞行中的甲虫速度很快（约3–5 m/sec），且在空中转弯时会划出较大的弧线。

2. 电极植入

  1. 将甲虫放入充满CO2的塑料容器中1分钟，以进行麻醉13,16,20-24。
  2. 将牙科蜡浸入热水中10秒以软化。将麻醉后的甲虫放置在木块上，并用软化的牙科蜡将其固定。牙科蜡会在数分钟内自然冷却并固化。
  3. 将绝缘银丝（裸丝直径127 µm，涂覆全氟烷氧基后直径178 µm）剪成25 mm长的段，作为植入用的细导线电极。
  4. 用火焰灼烧每根导线两端的绝缘层，使两端各露出3 mm长的裸露银丝。
  5. 使用尖头剪刀解剖甲虫体壁的上表面，在后胸侧板处开一个约4 × 4 mm的小窗口（图2c）。注意：此时会暴露出柔软的棕褐色体壁，如图2c–e所示。3Ax肌位于该柔软体壁下方。
  6. 使用昆虫针（00号）在暴露的棕褐色体壁上刺出两个小孔，两孔间距为2 mm（图2d）。
  7. 小心地将两根导线电极（包括步骤2.4中制备的一根工作电极和一根回路电极）穿过小孔，分别植入两侧3Ax肌中，植入深度为3 mm。
  8. 将熔化的蜂蜡滴在小孔处，以固定植入的电极并防止其接触造成短路。如有需要，可用热的电烙铁尖端轻触蜂蜡，使其在体壁上重新流动并覆盖更完整。蜂蜡迅速固化，从而加强电极的固定效果。
    注意：为验证植入是否正确，可抬起甲虫的鞘翅，在电刺激过程中观察3Ax肌是否产生运动。

3. 无线背包组装

注意：该背包由一块4层FR-4电路板（1.6 × 1.6 cm2）上的集成无线电微控制器构成。背包由一块锂聚合物微型电池（3.7 V，350 mg，10 mAh）驱动。包含电池在内的背包总质量为1.2 ± 0.26 g，低于甲虫的有效载荷能力（10 g体重的30%）。该背包预先编程以接收无线通信信号，并具有两个输出通道。

  1. 使用双面胶带清洁鞘翅目昆虫前胸背板表面（去除角质层上的蜡质层），然后用一块双面胶带将背包装置固定在昆虫的前胸背板上。
  2. 将植入式电极的末端连接至背包装置的输出端口。
  3. 将反光胶带缠绕在微型电池周围，以形成可供动作捕捉相机识别的标记点。
  4. 使用一块双面胶带将微型电池固定在背包顶部，确保反光胶带可被动作捕捉相机检测到。

4. 无线控制系统

注意：本例中，无线控制系统包括遥控器的接收器、用于运行定制飞行控制软件的笔记本电脑、基站、背包以及运动捕捉系统。

  1. 通过 USB 端口将遥控器的基站和接收器连接到笔记本电脑。
  2. 启动动作捕捉系统，并通过以太网端口将其连接到笔记本电脑。
  3. 通过挥动校准棒（由动作捕捉系统供应商提供）完整覆盖动作捕捉空间，执行容积校准。
    1. 从笔记本电脑桌面打开动作捕捉软件。在 "资源"面板的 "系统"菜单中，单击并拖动以选中所有摄像头。
    2. 单击 "3D 透视"菜单，并选择 "摄像头"以切换至摄像头视图。在 "工具"面板的 "摄像头"选项卡中单击，以显示校准设置。在 "创建摄像头遮罩"菜单中单击 "开始"以消除摄像头噪声，待噪声区域变为蓝色后，单击 "停止"。
    3. 在 "摄像头"选项卡的 "校准棒"菜单和 "L 形框架"菜单中，单击并选择 "5 标记校准棒 & L 形框架"。将 "校准棒计数"设置为 2,500，然后在 "校准摄像头"菜单中单击 "开始"，并在整个动作捕捉空间内挥动校准棒。当校准棒计数达到 2,500 时，校准过程自动结束。
    4. 如果在 "工具"面板的 "摄像头"选项卡底部显示的图像误差（Image Error）高于 0.3，则需重复校准过程。校准完成后，将校准棒平放在动作捕捉空间中央的地面，然后在 "设置容积原点"菜单中单击 "开始"，以设定动作捕捉空间的原点。
  4. 使用虚拟测试检查动作捕捉系统的覆盖范围：在动作捕捉空间内挥动一个标记，记录其运动轨迹，确认该标记是否被检测并持续跟踪。如果在检测过程中频繁丢失标记，则需重复容积校准，直至虚拟测试成功。
    1. 在 "工具"面板中单击 "采集"选项卡，然后在 "采集"菜单中单击 "开始"，随后在整个动作捕捉空间内挥动测试标记以记录其轨迹。
    2. 记录完成后，单击 "运行重建流程"以重建标记的位置，并检查记录质量。
  5. 将微型电池（在步骤 3.4 中已安装至背包）的端子连接至背包的电源引脚。
  6. 使用定制的飞行控制软件测试笔记本电脑与背包之间的无线通信。在软件中单击 "开始"命令，并检查显示的连接状态。

5. 自由飞行实验

  1. 在尺寸为 16 x 8 x 4 m3 的飞行实验场中进行自由飞行实验。
  2. 在飞行控制软件中输入适当的参数（电压、脉冲宽度、频率和刺激持续时间）。注意：作为演示，我们将电压固定为 3 V，脉冲宽度为 3 msec，刺激持续时间为 1 sec，并将频率从 60 Hz 变化至 100 Hz。
    1. 在软件界面上，于命令窗口的 "电压"框中输入 3（表示 3 V），在 "刺激持续时间"框中输入 1,000（表示 1,000 msec），在 "脉冲宽度"框中输入 3（表示 3 ms），并在 "频率"框中输入所需的频率值（单位为 Hz）。
  3. 将搭载背包的甲虫释放到空中，使其在飞行实验场内自由飞行。当甲虫进入运动捕捉区域时，手动触发刺激。按下遥控器上相应的指令按钮（左或右），以刺激甲虫左侧或右侧的目标肌肉。
    注意：一旦按下按钮，运行在笔记本电脑上的飞行控制软件将生成指令并将其发送至背包装置，背包随后向目标肌肉（左侧或右侧）输出电刺激信号。
  4. 在刺激过程中实时观察甲虫的反应，并使用 3D 绘图软件重建数据。
    1. 在 "甲虫显示"窗口的数据列表中选择一次试验记录，点击 "导出 Panda"，将该次试验的数据复制到分析文件夹中，并运行 3D 绘图模块。
    2. 按下键盘上的 "N" 键，将刺激信号与记录的轨迹合并。按下 I 键以显示甲虫轨迹，并高亮标注刺激时间段。

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结果

电极植入过程如图2所示。将细银丝电极通过肌肉软角质层上的微小穿孔植入甲虫的3Ax肌中（图2d-e）。该软角质层位于后胸侧骨前部去除后暴露出的基底肌腱膜上方（图2d-c）。随后使用蜂蜡固定电极（图2f）。

图3展示了利用完整甲虫构建昆虫-机器混合系统的操作流程。图2和图3b展示了将细金属导线（刺激电极）植入目标肌肉（例如，在图2中，本研究使用了3Ax肌肉）以及将背包固定在甲虫前胸背板上的方法。导线的自由端插入背包上跳线连接器的孔中，这些孔与背包上集成的微控制器的输入/输出引脚实现电连接（图3c

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讨论

植入过程非常重要，因为它会影响实验的可靠性。电极应插入肌肉，深度不超过3 mm，具体深度需根据甲虫的大小调整（避免与邻近肌肉接触）。如果电极接触到邻近肌肉，可能因邻近肌肉收缩而引发不必要的运动行为。两个电极应保持良好对齐，以确保不会发生短路。使用电烙铁熔化并重熔蜂蜡时，实验人员必须小心操作，并尽可能快速完成焊接，因为肌肉长时间接触高温可能导致灼伤，进而引起肌肉功能障碍。尽管需要去除表皮以接触3Ax肌，但插入和封合过程耗时不到一分钟，且操作过程中已尽量减少对肌肉的损伤。实验结束后，昆虫被送回饲养室，可继续存活长达3个月（直至其生命周期结束）。为了维持甲虫的良好性能，建议每进行20次连续实验后，喂食并让甲虫休息3至4小时，因为连续进行40至50次飞行实验后，昆虫可能会疲劳，无法正常展开翅膀。

对于自由飞行实验，必须对运动捕捉系统进行体积校准，因为这会影响轨迹跟踪的准确性。校准时，应确保所有相机视野中均充满校准棒反射出的光波，且每台相机的图像误差小于0.3，以保证运动追踪系统的精度。此外，标记点表面应保持清洁，否则3D运动捕捉系统可能会频繁丢失标记点信号。校准完成后，应使用包裹有反光胶带...

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披露

作者声明不存在利益冲突。

致谢

本材料基于南洋助理教授计划（NAP，M4080740）、新加坡科技研究局（A*STAR）公共部门研究基金（PSF，M4070190）、A*STAR与日本科学技术振兴机构（JST）联合资助项目（M4070198）以及新加坡教育部（MOE2013-T2-2-049）支持的研究工作。作者谨此感谢南洋理工大学机械与航空航天工程学院（School of MAE）的Roger Tan Kay Chia先生、Low Kin Huat教授、Poon Kee Chun先生、Chew Hock See先生、Lam Kim Kheong先生以及Mao Shixin博士在研究设施的搭建与维护过程中提供的支持。作者感谢加州大学伯克利分校（U.C. Berkeley）的Michel Maharbiz教授提供的建议与讨论，同时感谢Kris Pister教授及其研究团队为本研究所提供的GINA设备支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
Mecynorrhina torquata 甲虫中国台湾甲虫王国10 克，8 厘米，有效载荷能力为体重的 30%
新加坡农粮局（AVA；HS编码：01069000，产品编码：ALV002）对进口和使用的批准
无线背包刺激器定制TI CC2431 微控制器
该电路板是基于Kris Pister教授的GINA电路板定制而成’s 实验室。GINA 电路板的布局可在    https://openwsn.atlassian.net/wiki/display/OW/GINA
Wii 遥控器任天堂蓝牙遥控器向操作员笔记本电脑发送指令
BeetleCommander v1.8加州大学伯克利分校Maharbiz团队与台湾大学Sato团队定制建立背包与操作员笔记本电脑之间的无线通信。配置刺激参数并记录位置数据。可视化飞行数据。
GINA 基站加州大学伯克利分校Kris Pister团队TI MSP430F2618 和 AT86RF231
运动捕捉系统VICONT16012.5 米 × 8 米 × 4 米飞行区域的 8 台相机
运动捕捉系统VICONT40s12.5 × 8 × 4 米飞行区域的12台相机
微型电池Fullriver 201013HS10C 3.7V，10 mAh
反光胶带反光材料V92-1549-010150V92 反光胶带，银色
PFA绝缘银线 A-M 系统786000127 µm 裸，177.8 µm镀层，3 mm裸露银丝，尖端露出火焰
SMT 微型连接器 SAMTECFTSH-110-01-L-DV0.3 mm × 6 mm，弯曲制成 3 mm 长的滑块，用于将电极固定在 PCB 插座中。
蜂蜡固定电极
牙科蜡顶点固定甲虫
昆虫固定针ROBOZRS-6082-30尺寸  00；杆直径 0.3 mm；尖端宽度 0.03 mm；长度 38 mm 
在角质层上制作电极导向孔
镊子DUMONTRS-5015模式 #5；0.05 mm × 0.01 mm 尖端尺寸；110 mm 长度
解剖与植入
剪刀ROBOZRS-5620Vannas 微型解剖弹簧剪；直型；3 mm 刃口；0.1 mm 尖端宽度；3" 总体长度 
解剖与植入
便携式电烙铁DAIYODS241回流蜂蜡
热板 康宁PC-400D融化蜂蜡和牙科蜡
荧光灯飞利浦TL5 14W用30块（60 × 60 cm）面板照亮整个飞行区域2每个面板有3个灯。
14 W，549 mm × 17 mm 

参考文献

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