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方法文章

睑刷区域的印迹细胞学

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DOI：

10.3791/54261

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2016年8月9日

 ,  ,  , 
1Centre for Contact Lens Research, University of Waterloo

本文内容

摘要

我们采集了人类受试者眼睑内侧结膜处的细胞，并对其进行染色和成像。通过表征细胞形态和代谢活性，该方法可能增进我们对干眼症的理解，并揭示眼球表面之间摩擦在感知眼部不适中的作用。

摘要

关于眼睑内表面睑缘擦拭区（LW）细胞解剖结构的研究报道较少，仅有一篇文献采用了细胞学方法。本研究描述了一种利用印迹细胞学（IC）技术采集、染色和成像LW区域细胞的方法优化过程。通过亲水性聚四氟乙烯（PTFE）膜从人眼上睑内表面采集细胞，并使用细胞学染料进行染色，以显示杯状细胞、黏蛋白、细胞核以及不同程度的前角化和旁角化状态。采用免疫细胞化学染料结合共聚焦激光扫描显微镜检测细胞酯酶活性及细胞膜完整性受损情况。每个样本最多可采集100张显微数字图像，并拼接成覆盖整个IC区域的高分辨率、大尺度图像。我们证明了该方法的敏感性高于以往报道，适用于识别LW区域的细胞形态和代谢活性。据我们所知，这是首次使用此类荧光染料对LW区IC膜进行成像。该实验方案将有助于未来研究揭示LW区域尚未记录的细节，例如评估佩戴角膜接触镜者或干眼症及睑缘擦拭区上皮病变患者细胞的特异性变化。

引言

人类上眼睑每天大约会眨眼10,000次1，其间仅有1–2 mm宽的狭窄结膜区域与眼球表面相对。由于在眨眼过程中该区域具有擦拭动作，因此这部分睑缘被称为"睑刷"区域2。通常认为，在日常眨眼过程中，由于眼睑在眼球表面擦拭，该区域的摩擦力会增加，这可能在眼部舒适度中发挥重要作用。佩戴角膜接触镜的人群尤其容易出现眼部不适，这也是导致停戴镜片的主要原因之一3。当角膜接触镜置于眼睛上时，镜片材料与眼表之间的摩擦系数已被证实会发生改变4。有证据表明，干眼症状可能与这种摩擦特性的改变有关2,5,6。

这种关联也可能在临床可观察到的现象中有所体现，尤其是睑缘上皮病变（LWE），也称为上睑缘染色（ULMS）6。LWE 是眼表刺激的早期征象，也可能是干眼病的潜在预测指标。该病变通过活体染色法对上下睑缘区域进行观察和评估。尽管该分级系统2及其临床有效性（即与主观症状的相关性）仍存在争议，但眼部不适对临床医生和科研人员而言仍是一个难题，更重要的是，它给患者带来了显著的不便。

迄今为止，关于睑缘擦拭区（lid wiper area）的（亚）细胞解剖学和生理学在临床上的相关变异知之甚少7，仅有一篇文献报道采用了细胞学方法8。印迹细胞学（impression cytology, IC）已应用超过40年，通过使用膜材贴附于球结膜或睑结膜的上皮表面以收集细胞9,10。移除膜材后，附着的细胞可进行细胞学染色并进行显微成像。由于睑缘擦拭区域在解剖结构和细胞组成上的特殊性，该技术在此区域的应用需要优化。

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方案

伦理声明：在从人体受试者采集细胞之前，必须获得知情同意书和伦理审批。

1. 准备染色液

注意：在实验当天配制染色液。

  1. 在15 ml离心管中，向2.5 ml磷酸盐缓冲液（PBS）加入5 µl溴化乙锭（或4 µM）和5 µl钙黄绿素AM（或4 µM）；混匀。用铝箔包裹以避光，室温保存备用。

2. 收集细胞

  1. 从包装中取出细胞培养小室，并为待取样的每个眼睑进行标记。使用永久性记号笔在膜的塑料支架侧面标记细胞采集的方向。通过裂隙灯在中等放大倍数（约20倍）下检查，确认拟进行IC的区域健康状况适宜。
  2. 向每只眼睛的下结膜囊内滴加一滴局部麻醉剂（0.5%盐酸丙帕卡因），并指导受试者闭眼一分钟。
  3. 翻转上眼睑，并用睫毛固定其位置；避免接触睑缘擦拭区。
    可选：此步骤可能需要第二位研究人员协助完成。
  4. 将膜垂直轻压于睑缘擦拭区中央部位，施加最小压力。
  5. 保持膜位置固定3至5秒。观察膜在接触区域逐渐变为半透明。此时，轻柔取下膜，并允许受试者眼睑"翻转"回原位。
  6. 立即向样本滴加一滴PBS，防止其干燥。膜应保持半透明状态，任何时候均不应变为不透明，若出现浑浊则提示已干燥。应由第二位研究人员立即开始样本处理（第3节）。
  7. 进行最终眼部检查，确保结膜完整性。滴加眼部润滑剂，并指导受试者在麻醉作用消退前避免揉眼（约15分钟）。

3. 样品处理

  1. 使用显微剪刀将膜沿细胞收集区域的中点垂直切成两半（每半用于后续不同的分析）。沿其中一半膜的外缘剪切，将其从塑料支架上分离；操作时避免接触膜上的收集细胞，确保膜不会发生自我折叠。
  2. 在完全脱离支架前，先用镊子固定膜。将膜放入已标记的2 ml离心管中，管内含500 µl 95% (v/v) 乙醇，固定时间至少20分钟，最长不超过2小时，随后进行后续处理（第4.2节）。
  3. 立即分离膜的另一半（如第3.2节所述），并迅速进入第4.1节操作步骤。

4. 样品染色

  1. 免疫细胞化学染色
    1. 将膜小心地放置于35 mm玻璃底培养皿中，采集面朝下；确保膜完全展平。
    2. 用移液器将第1节中配制的20 µl免疫细胞化学染色液滴加到膜上。若样品卷曲，可用一次性移液器吸头轻轻按压膜边缘使其展平。避免接触细胞采集区域。
    3. 用玻璃盖玻片轻轻覆盖膜表面。避免样品不必要的移动。用培养皿盖盖好，并在边缘用实验室封膜密封。注意不要遮挡培养皿的透光面（顶部和底部）以及样品的可视区域。用实验室标记笔做好标记。
    4. 立即进行成像（第5.1节），然后返回第4.2节，继续对膜的另一半进行细胞学染色。
  2. 细胞学染色
    1. 通过缓慢向第3.4节固定所用的离心管中加入500 µl蒸馏水，逐步使膜水化。用移液器吸头反复吸取数次以混匀，然后移除液体。
    2. 加入500 µl蒸馏水，静置数秒后移除。加入500 µl阿利新蓝染液（Alcian Blue stain），染色3分钟。移除染液后，用500 µl蒸馏水连续冲洗三次，或直至冲洗液澄清。
    3. 加入500 µl苏木精染液 #1，染色3分钟。移除染液后，用500 µl蒸馏水连续冲洗三次，或直至冲洗液澄清。通过吸除上清液进行脱水（与第4.2.1节相反步骤）。
    4. 加入500 µl巴氏OG-6染液（Papanicolaou OG-6 stain），染色3分钟。移除染液后，用500 µl 95% (v/v) 乙醇冲洗一次。
    5. 加入500 µl巴氏EA-65染液（Papanicolaou EA-65 stain），染色3分钟。移除染液后，用500 µl 95% (v/v) 乙醇连续冲洗三次。
    6. 使用三次连续的500 µl 100%乙醇冲洗完成彻底脱水。用镊子将样品从溶液中取出；避免触碰细胞采集区域。
    7. 将膜放置于载玻片上；确保细胞采集线与载玻片边缘平行或垂直，以便成像时更容易对齐。
    8. 滴加一滴100%乙醇，盖上盖玻片。立即进行成像（第5.2节）。

5. 样品成像

  1. 荧光免疫细胞化学染色成像
    1. 使用共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）11 或荧光显微镜12配备数字彩色相机，并连接至运行图像采集软件的计算机。由于样本置于培养皿中，可能需要使用倒置显微镜。
    2. 设置显微镜11,12 根据碘化丙啶同二聚体-1（在DNA存在下激发/发射最大值为528/617 nm）和钙黄绿素AM（激发/发射最大值为494/517 nm）的吸收和发射光谱。
    3. 选择显微镜的最低放大倍数（例如， 2.5倍物镜）并启动数字成像系统；观察计算机显示器上显示的样品。
    4. 检查样本中感兴趣的细胞特征。
    5. 选择所需的显微镜放大倍数，并使用成像软件采集图像。
    6. 以显微镜原生文件格式或无压缩文件格式保存文件（例如，*.raw，*.tiff）
  2. 成像细胞学染色
    1. 使用配备数码彩色相机的标准实验室明场显微镜，不使用滤光片，并连接至运行图像采集软件的计算机。
    2. 将步骤4.2.8中的玻璃载玻片放置于显微镜载物台上并固定。在整个成像过程中，根据需要使用100%乙醇对样本进行再水化。
    3. 选择显微镜的最低放大倍数（例如，2.5倍物镜）并启动数字成像系统；在计算机显示器上观察样品。
    4. 确保细胞收集方向与显微镜载物台控制的X轴或Y轴对齐。如有需要，可移除盖玻片，使用移液器吸头或镊子旋转样品进行调整。
    5. 使用成像软件，以最低的显微镜放大倍数拍摄整个样品的图像。
    6. 切换至中等显微镜放大倍数（例如， 10 - 20倍物镜）并调节显微镜光源及软件成像参数（曝光、对比度、白平衡， 等等。），并禁用其自动化软件计量功能。保存这些设置以供将来使用。
    7. 确定扫描的起始点和终止点（例如细胞采集区域的左上角和右下角
    8. 使用成像软件，采集起始点与终点之间整个细胞收集区域的图像。确保所有相邻图像之间左右及上下均具有20%的重叠区域。
    9. 使用显微镜原生文件格式或无压缩文件格式保存文件（例如、*.raw、*.tiff）
    10. 使用选定的自动拼接软件生成最终全景图像（例如， Adobe Photoshop Elements）。使用第 5.2.5 步拍摄的参考图像，确认最终图像中自动拼接的准确性。

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结果

将细胞培养膜覆盖于塑料支架上，是一种便捷的手持式采集睑缘擦拭结膜上皮细胞的工具。该方法无需使用额外的灭菌器械，而这类器械通常用于制备和操作IC膜。图1展示了使用细胞培养插入物对睑缘擦拭区域进行IC取样的情况。我们优化了两种相互补充的染色方案，以新颖的方式对睑缘擦拭区域的上皮细胞进行表征。荧光免疫细胞化学染料可显示酯酶活性（细胞活性的指标）以及核酸（其染色反映细胞膜完整性受损情况），如图2所示。细胞学染色方案可精细区分不同程度的角化状态。图3展示了睑板结膜低度角化向睑缘擦拭结膜及表皮高度角化的过渡过程。对细胞学染色样本进行全景成像，可实现对整个采集区域的分析，而非仅限于选定的兴趣区域。图像分辨率足以放大至细胞核水平，可精确判断细胞形态。图4展示了经约100个独立高分辨率图像拼接而成的细胞学染色细胞采集最终图像。这些工具可用于以新颖的方式评估摩擦和/或干眼的影响。

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讨论

印迹细胞学通常在球结膜上进行，使用混合纤维素酯膜。样品由大张材料裁剪而成，经灭菌后用镊子贴附并从结膜表面取下。利用相同的膜材料，最近设计出一种由活塞控制的印迹细胞学装置，可匹配球结膜的表面几何形状，并在多次操作中保持一致的压力13。然而，这些方法对于狭窄且曲率明显的睑缘擦拭区效率较低（见图1）。此外，混合纤维素酯膜无法提供必要的透明度，在需要明场显微镜观察以在荧光成像前对样本进行定位的实验设置中存在局限。本方案中提出的细胞培养插入式装置使用方便，因其已预先灭菌、尺寸适宜，且可直接手动操作，无需额外设备，从而实现快速取样。该装置的膜由亲水性聚四氟乙烯（PTFE）制成，具有足够的透明度，适用于共聚焦显微镜分析。

总体而言，所收集细胞的形态学特征与以往文献报道一致7,8,14,15。用阿尔新蓝替代常用的（且染色强度很高）过碘酸-雪夫（PAS）染色法，可使后续的巴氏染色呈现出更精细的色彩差异，从而比以往报道更详细地反映细胞角化程度7,8。

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披露

作者没有相关资金支持或利益冲突需要披露。

致谢

我们谨感谢同事 Jalaiah Varikooty 博士，他在眼睑擦拭器（lid wiper）研究领域提供了深刻的见解和专业知识，极大地支持了本项研究工作。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
3% 乙酸中的 1% 阿利新蓝SigmaB8438-250ML
吉氏苏木精染液 1 号SigmaGHS116-500ML
巴氏染色液，OG-6SigmaHT40116-500 ml
改良伊红-酒精染色液（Modified EA）SigmaHT40232-1L
活/死细胞活力/细胞毒性检测试剂盒Life TechnologiesL-3224含有乙锭同二聚体-1 和钙黄绿素 AM 染料
阿莱恩（0.5% 盐酸丙帕卡因）Alcon
Millicell 细胞培养小室，12 mm，亲水性聚四氟乙烯，0.4 µmEMD MilliporePICM01250 
35 mm 玻底培养皿MatTek CorporationP35G-0-20-C

参考文献

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