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方法文章

在基于钛宝石和光参量振荡器激光器的标准激光扫描显微镜上实现相干反斯托克斯拉曼散射（CARS）系统

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DOI：

10.3791/54262

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2016年7月17日

 ,  ,  ,  , 
1INSERM U1051, Institut des Neurosciences de Montpellier (INM), Université de Montpellier, 2Université de Nîmes, 3CNRS, IES, UMR 5214, 4Aix-Marseille Université, CNRS, École Centrale Marseille, Institut Fresnel, UMR 7249, 5Montpellier RIO Imaging (MRI)

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

基于分子键固有振动的相干反斯托克斯拉曼散射（CARS）显微技术，能够实现无需标记的化学选择性活细胞成像。本文介绍了在基于飞秒钛宝石激光器和OPO激光器的标准多光子激光扫描显微镜上，实现一种互补显微技术的方法。

摘要

结合飞秒钛宝石激光器与光学参量振荡器（OPO）以复制激光谱线的激光扫描显微镜已向生物学家开放使用。这些系统主要设计用于多通道双光子荧光显微成像。然而，在无需任何改装的情况下，该装置还可用于其他互补的非线性光学显微技术，如二次谐波产生（SHG）或三次谐波产生（THG），从而实现对有序分子结构或水相-脂质界面的无标记成像。这些技术非常适合于 体内 观察具有局限性，但在化学特异性方面存在不足。基于拉曼散射的固有振动信号可实现化学选择性成像。共聚焦拉曼显微技术可提供三维空间分辨率，但需要较高的平均功率和较长的采集时间。为克服这些困难，近年来激光技术的进步推动了非线性光学振动显微技术的发展，尤其是相干反斯托克斯拉曼散射（CARS）。因此，CARS显微技术已成为生物样本和活细胞成像的有力工具，能够通过化学映射脂质（通过C-H伸缩振动）、水（通过O-H伸缩振动）、蛋白质或DNA实现可视化。本文中，我们描述了在标准OPO耦合的多光子激光扫描显微镜上实现CARS技术的方法。该方法基于调节其中一路激光光束的光程长度，实现两束激光线在时间上的同步。我们逐步展示了在现有多光子系统上实施该技术的具体步骤。具备基本的实验光学背景知识将有助于操作，且所介绍的系统无需昂贵的附加设备。我们还展示了在啮齿类动物坐骨神经髓鞘上获得的CARS成像结果，并证明该成像可与其他非线性光学成像技术（如标准双光子荧光技术和二次谐波生成）同时进行。 关键词：CARS显微技术，相干反斯托克斯拉曼散射，多光子显微镜，非线性光学成像，化学特异性成像，髓鞘，OPO，拉曼散射，振动显微技术，活细胞成像

引言

光学显微技术已成为以亚细胞分辨率无损观测活体生物系统中动态过程的主要手段。由于具有高特异性和高灵敏度，荧光显微技术目前是活细胞成像中最常用的成像对比方法1。大量荧光探针已被开发出来（包括外源性染料、基因编码蛋白和半导体纳米颗粒）。基于不同样品照明方式的荧光成像技术也迅速发展（如共聚焦显微或双光子显微技术），以实现三维成像并减轻该技术的主要缺陷——光漂白2。其他局限性包括需要荧光标记，因为大多数分子本身不具备荧光特性，因此必须人为地将这些荧光基团引入待成像样品中。这种人为操作可能对小分子产生干扰，或引发潜在的光毒性。这些因素使得荧光显微技术不太适用于活体（in-vivo）观测。因此，在生物医学研究中，迫切需要发展无需使用荧光分子、但仍具备高灵敏度和特异性分子对比能力的光学成像技术。

多种无需标记或染色的非线性光学成像技术相继出现，包括二次谐波产生（SHG）3,4 和三次谐波产生（THG）5二次谐波显微技术已被用于成像微管或胶原蛋白等超分子水平的结构排列。6三倍频光由光学非均匀性产生，例如水相介质与脂质之间的界面7. THG 还被证明可用于成像髓鞘8,9两种技术均可在双光子荧光显微镜上实现，且仅需一束激光。然而，它们需要较高的激光功率密度（通常在860 nm波长下为50 mW，用于SHG）10，1180 nm 处 25 - 50 mW 用于三次谐波产生9），这对活体样品有害，且无法提供明确成像特定生物结构所需的化学特异性。

基于拉曼散射的固有分子振动信号可获得化学选择性成像。当一束光照射到物质上时，光子会被原子或分子吸收并发生散射。大多数散射光子具有相同的能量， 即， 频率与入射光子相同。这一过程称为瑞利散射。然而，有少量光子会被散射至与入射光子频率不同的光学频率。 即， 通过一种称为拉曼散射的非弹性散射过程实现。能量差异源于分子结构和环境依赖的振动模式的激发。因此，自发拉曼散射能够提供化学选择性成像，因为不同分子具有特定的振动频率。然而，由于其信号极其微弱，该技术受到限制。共聚焦拉曼显微技术已被开发出来，可提供三维空间分辨率，但需要较高的平均功率和较长的采集时间11为克服这些困难，激光技术的最新进展推动了非线性光学振动显微技术的发展，特别是相干反斯托克斯拉曼散射（CARS）11,12,13.

相干反斯托克斯拉曼散射（CARS）是一种三阶非线性光学过程。三束激光——包括频率为 ωP 的泵浦光束、频率为 ωS 的斯托克斯光束以及一束探针光束（通常与泵浦光束相同）——被聚焦到样品中，产生频率为 ωAS = (2ωP - ωS)14 的反斯托克斯光束。当泵浦光束与斯托克斯光束之间的频率差被调节至与分子的拉曼振动频率 ΩR = (ωP - ωS) 一致时，反斯托克斯信号可显著增强。CARS 信号基于多光子相互作用，因此产生的信号是相干的，其强度比自发拉曼散射高出数个数量级。

相干反斯托克斯拉曼散射（CARS）显微技术最初由Duncan et al.15 首次通过实验实现。Zumbusch et al. 随后改进了该技术，采用两个聚焦的近红外飞秒激光束，并结合高数值孔径的物镜，从而满足CARS的相位匹配条件，并避免双光子非共振背景信号16。因此，CARS显微技术已成为活细胞和组织成像的有力工具，可对脂质（通过C-H伸缩振动）17,18、水（通过O-H伸缩振动）、蛋白质、DNA等分子进行化学检测19,20，还可用于检测药物21和化妆品应用中的氘标记化合物22。

非线性显微技术的主要局限源于光学光源的复杂性和高昂成本。相干反斯托克斯拉曼散射（CARS）系统需要两台波长可调、脉冲持续时间短且脉冲序列在时间和空间上同步的激光器。早期的CARS显微镜基于两台同步的皮秒级Ti:sapphire激光器。20CARS成像还使用单个飞秒钛宝石激光器产生的超连续光源获得23近年来，由单个飞秒钛宝石激光器泵浦可调谐光学参量振荡器（OPO）构成的激光光源已被用于相干反斯托克斯拉曼散射（CARS）显微成像。该装置可提供本征时间同步的光束，其泵浦光与斯托克斯光之间的频率差可覆盖整个分子振动光谱范围。24此外，基于即插即用型飞秒激光器和光参量振荡器（OPO）的激光扫描显微镜现已面向非物理专业人员提供，主要用于双光子荧光（TPF）成像。通过整合其他非线性光学成像模式，可在无需额外投资的情况下显著提升此类系统的潜力，因为每种非线性光学（NLO）成像模式对特定结构或分子具有敏感性。因此，多模态NLO成像能够充分挖掘非线性光学显微技术在复杂生物样品研究中的潜力25这些技术的结合使得许多生物学问题得以研究，特别是在脂质代谢、皮肤及癌症发育方面26骨骼肌发育27动脉粥样硬化病变28此外，结合受激拉曼散射（CARS）的激光束扫描技术可实现高速成像， 即， 研究动态过程的一种理想工具 在体.

本研究的目的是展示在标准多光子激光扫描显微镜上实现CARS技术的每一步操作。该显微镜基于一台飞秒钛宝石激光器和一台由钛宝石激光器泵浦的光参量振荡器（OPO），并由面向生物学家设计的软件进行控制。通过调节其中一束激光的光路长度，使两束激光在时间上实现同步，从而完成系统集成。本文详细描述了该技术的逐步实现过程，仅需具备基础的实验光学知识即可操作。我们还展示了在啮齿类动物坐骨神经髓鞘上获得的CARS成像结果，并证明该成像可与其他非线性光学成像技术（如标准双光子荧光技术和二次谐波产生）同时进行。

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方案

飞秒激光光谱装置示意图，包含钛宝石激光器、OPO光束、二向色镜、光电倍增管、吸收测量。
图1. 实验装置的示意图。 装置包括钛宝石激光器（680 – 1,080 nm）和OPO激光器（1,050 – 1,300 nm）、由四面反射镜（M1 至 M4）构成的延迟线、高速示波器、光电二极管以及两个固定的虹膜光阑 I1 和 I2。反射镜 M2 和 M3 安装在直线平移台上，可通过微米级分辨率调节延迟线的长度。在用于CARS成像的光电倍增管（PMT）前方放置了一个660 – 685 nm的带通滤光片。请点击此处查看该图的放大版本。

1. 激光系统的启动

  1. 确认钛宝石激光器的波长设置为800 nm，或在钛宝石激光器电源控制器上设定该波长。将钥匙从待机（Standby）转至开启（On）以启动钛宝石激光器。
  2. 打开OPO控制器后部的OPO激光器，并打开钛宝石激光电源控制器上的钛宝石激光快门。
  3. 打开平板电脑以启动OPO。点击平板上的OPO Connected和Remote Connected图标。等待30 - 40分钟进行预热。
  4. 打开显微镜计算机并开启“显微镜组件”开关。通过双击桌面上的图标启动软件。
  5. 进入软件的采集选项卡，打开 激光工具 在 设置管理器 从软件操作两台激光器。选择钛宝石激光器 在 和OPO激光器 开启检查光学激光功率的数值（在800 nm处典型值为3,700 mW，在1,000 nm处为700 mW）。
  6. 配置光路和激光器时，打开 光路工具 在 设置管理器工具 组和复选框 第一个光电倍增管 (PMT)
  7. 为检查物镜输出端的钛宝石激光光斑，打开 通道工具 在 采集参数工具 组。将钛宝石激光器的功率设置为较低值（约 1%），将增益降至0（此阶段无需图像），然后单击 连续的 单击按钮以启动扫描程序，使激光束通过显微镜物镜。将红外激光观察卡置于空气显微镜物镜（10X）输出端，通过直接观察检查是否存在红斑。
  8. 为检查OPO激光光斑，通过单击停止钛宝石激光的扫描 停止 按钮。选择 OPO 功率 在较低值时 通道窗口 并点击 连续的 按钮。

2. 显微镜设置

  1. 手动将截止波长为760 nm的二向色镜放置于物镜转盘上方无限远空间的侧端滑块中，以在非共聚焦检测（NDD）模式下，将来自样品的波长不超过760 nm的光引导至光电倍增管（PMTs）。
  2. 将PMT1前方NDD反射镜转轮中的窄带通滤光片设置为660 - 685 nm，以仅记录670 nm处的CARS信号，从而重现本文所示结果。
  3. 在PMT3前方的NDD反射镜立方体中放置一个500至550 nm的窄带滤光片，用于观察髓鞘的荧光。在PMT4前方的反射镜立方体中放置一个565至610 nm的窄带滤光片，用于二次谐波生成（SHG）观察。
  4. 在软件中选择检测器上信号的记录 特设的 带通滤波器，打开 光路工具 在 设置管理器菜单 在 采集选项卡. 激活所需的PMT（勾选复选框），并为该通道选择一种颜色。本研究中，CARS选用绿色，荧光选用红色，SHG选用品红色。

3. 时间同步

注意：两束激光来自同一台钛宝石激光器，但OPO激光束在产生时存在延迟，因此当两束光到达显微镜时在时间上不同步。此处的目标是延迟其中一束光，以在它们到达显微镜之前重新实现时间上的同步。

  1. 使用 BNC 电缆将示波器的输入通道 CH1 连接到激光器的 BNC 电信号输出端（Sync. Out）。将示波器的输入通道 CH2 连接到光电二极管，并通过按下 TRIGGER MENU，然后选择主菜单中的 Source 按钮，再选择对应于所选通道 CH1 的侧边菜单按钮，将 CH1 通道设为触发通道。
  2. 使用光学安装支架将光电二极管定位并固定在空气物镜（10X）的焦平面，或在移除物镜后固定于显微镜光路中。注意：如有必要，移除聚光镜及其支架。
  3. 在 Channels 工具（Acquisition Parameter tool 组）中，将钛宝石激光器的波长设定为 830 nm，并设置为低功率（即 全功率的 1% 以下）。在 Acquisition Mode tool 中，将扫描区域缩小至单点，以便用最细的光束照射光电二极管。点击 Continuous button 开启激光扫描。
  4. 按下示波器前面板上的 AUTOSET 按钮，并手动移动光电二极管的位置，使脉冲序列显示在屏幕上。按下 RUN/STOP 按钮以冻结显示。
    1. 如需保存示波器显示图像，可将一张 3.5 英寸软盘插入软驱，或通过后面板的 GPIB 接口连接计算机。然后按下 SHIFT HARDCOPY MENU，按下 FORMAT（主菜单）选择 TIFF 图像格式，并在 Port 菜单中指定输出通道。按下 HARDCOPY 按钮，记录钛宝石激光器脉冲序列的示波器图像。
  5. 点击 Stop 按钮关闭钛宝石激光扫描。点击 Channels tool，设定 OPO 信号波长为 1,107 nm 并设为低功率。开启 OPO 激光扫描，并在示波器上记录 OPO 激光的脉冲序列。随后关闭 OPO 激光扫描。
  6. 比较钛宝石激光与 OPO 激光信号之间的时间偏移。
    注：该时间偏移 tshift 对应所需引入的延迟线长度 LDelayLine，其计算公式为：LdelayLine = c × tshift，其中 c 为光速。
  7. 选择其中一条激光线路。
    注：本研究中选择了钛宝石激光线路，因为该线路附近有可用的自由空间。此外，此选择可利用可见光激光实现激光线路的重新准直。
  8. 在将要安装延迟线的位置，移除保护套管以打开激光线路。
    注意！ 佩戴合适的安全护目镜，并取下手腕上的手链或手表。
  9. 在软件的 Channels tool 中选择一个可见光波段的波长（例如 700 nm，低功率），以便于观察激光光束。开启激光扫描。
  10. 沿打开的激光线路使用光学安装支架放置并固定两个虹膜光阑。将其中一个光阑置于延迟线出口处，另一个置于潜望镜入口处。
    注：潜望镜通过由软件控制的两个电动镜片，调节激光束进入激光扫描显微镜扫描头的入射角度。
  11. 缩小虹膜光阑孔径，并调整光阑位置使其与激光光路对齐。将它们固定在光学平台上。使用第三个可移动的虹膜光阑调整其垂直位置，在依次安装延迟线的四面反射镜时检查激光束的高度。
    注：这些虹膜光阑将在重新准直过程中作为路径参考。
  12. 将安装在紧凑型运动学镜架上的反射镜 M1 放置在延迟线入口处（如 Figure 1 所示），并调整其位置和取向，利用可移动虹膜光阑保持光束高度。将反射镜 M2 和 M3（同样安装在紧凑型运动学镜架上）以 90° 角安装在平移台中部位置。调整其位置以匹配先前计算的延迟线长度。
  13. 利用可移动虹膜光阑调整 M2 和 M3 的取向。将 M4（同样固定在紧凑型镜架上）置于延迟线出口处（如 Figure 1 所示，紧邻光阑 I1），并仔细调整其位置和角度，使激光光束通过两个固定的虹膜光阑。
  14. 将激光观察卡置于显微镜物镜输出端，点击 Continuous 开启激光扫描，检查激光束的光斑轮廓。应观察到一个均匀明亮的圆形光斑。如有必要，轻微调整 M4 的取向。
  15. 再次将快速光电二极管置于显微镜样品焦平面的激光束下方。在示波器上观察钛宝石激光束与 OPO 激光束之间的时间偏移。
    注：如有必要，通过移动安装在平移台上的 M2 和 M3 整体系统（不改变平移台的调谐状态）来调整延迟线长度，以实现两个脉冲的同步。可能需要进行数厘米的调整。

4. 光束的空间重叠

注意：要产生CARS信号，需要两束激光束在空间上重叠。通过交替照射用两种不同荧光染料均匀染色的同一微珠，可以指示空间位移。随后通过微调反射镜的位置来最小化该位移。

  1. 使用预装荧光微球，或按以下方法将悬浮微球装载于洁净的显微镜载玻片上：
    1. 取样前，将珠子溶液在涡旋混合器上混匀或通过超声处理，以确保珠子均匀悬浮。
    2. 应用 5 μl 将珠悬浮液滴加到载玻片表面，并用移液器吸头铺匀。等待液滴干燥后，再施加 5 μl 加入封片剂，例如甘油、水或浸油，覆盖干燥的珠样样品。盖上盖玻片，并用快干胶或熔化的石蜡密封盖玻片。
  2. 将固定在显微镜载玻片上的荧光聚苯乙烯微球置于20倍水浸物镜下。滴加数滴水以浸没物镜。
  3. 为实现对珠子的聚焦，打开 定位 软件中的选项卡，通过按下按钮从激光扫描模式切换至用肉眼直接观察样本 在线 按钮。打开 眼科工具 以选择 临时的 过滤器 并点击打开卤素灯 图标.
  4. 手动移除无限远空间侧端口滑块中的二向色镜，通过目镜观察微珠，使用显微镜的聚焦驱动装置对样品平面进行聚焦。随后重新装回二向色镜。
  5. 在 定位标签，通过按下切换到激光扫描模式 离线 按钮。转到 采集选项卡 设置扫描参数：选择帧尺寸为512像素，扫描速度为9，平均次数为1，位深度为8位，并将扫描区域增大至最大。
  6. 在 通道工具 的 采集选项卡，如果尚未创建轨道，则添加一个轨道（轨道 1）。选择钛宝石激光束的波长为 830 nm，并设置为低功率。 蜱虫 将通道窗口中“Track 1”框的颜色以及光路窗口中 PMT3 或 PMT4 框的颜色设置为绿色。
  7. 在 通道工具 的 采集选项卡，添加第二个轨道（轨道 2）。选择 OPO 激光束的波长为 1,107 nm，并设置为低功率。在轨道 2 的设置框中勾选红色作为显示颜色 通道窗口 以及 PMT3 框中的 光路窗口.
  8. 将两条通道的增益均调整为600。然后，通过单击依次对样品施加两束激光的扫描 连续的.
  9. 观察屏幕区域中二维视图的图像。在 显示视图选项 对照组块，调节显示强度。
    注意：如有必要，可轻微移动调焦驱动装置以找到微珠的焦平面。调整裁剪区域，并对单个微珠或相邻微珠群进行图像缩放。
  10. 使用潜望镜控制器在 x-y 平面内使光束重叠。在软件中，打开 保持标签页. 点击 系统选项 并显示 电动潜望镜工具 使用钛宝石激光束的潜望镜反射镜的粗调和微调，以在空间上同步两个图像。
  11. 对于潜望镜调节，使用第一组调节杆控制激光束的垂直方向，第二组调节杆控制水平方向。调节输入镜以移动光束，直至图像略微可见，然后通过点击“input”和“output”调节潜望镜的输出镜，补偿激光强度。
  12. 为了使光束在垂直方向上重叠，在 保持标签页，打开 准直器工具 并调节钛宝石激光束的焦距数值。
  13. 轻轻移动物镜的垂直位置，以检查两幅图像的焦距差异。或者，在采集选项卡中打开Z-栈工具，设置不同参数（范围、切片数量），对样品进行Z栈采集。在图像显示区域点击正交视图（Ortho），以观察光束的轴向截面。通过重复多次上述操作，使Z方向重叠达到最大化。

5. 最终调整及橄榄油液滴的相干反斯托克斯拉曼散射（CARS）信号观测

  1. 在玻璃载片上滴加一滴橄榄油，并用盖玻片覆盖。加入少量水以浸没20倍水浸物镜。使用目镜对准盖玻片边缘（如前文4.2节所述）。
  2. 在采集选项卡的通道工具中，于通道1选择Ti:蓝宝石激光波长为830 nm，OPO激光波长为1,107 nm。在通道1中同时选中两种激光，以实现双激光同步扫描。初始时将激光功率设为较低值。
  3. 在光路窗口中选择PMT1。点击连续扫描按钮以开启激光扫描。轻微调节焦平面，使激光聚焦进入油层的薄层区域。
  4. 如有必要，逐步增加两种激光的光功率。调节显示视图选项控制块中的显示强度。缓慢移动延迟线的平移台，直至信号显著增强。
  5. 完成精细调节后，验证是否确实为CARS信号：轻微移动平移台，信号强度应明显减弱；和/或关闭其中一束激光（Ti:蓝宝石激光或OPO）。此时信号强度应较CARS信号显著下降。
  6. 为获得最大CARS信号，选择软件中的选项以获取整幅图像的平均强度值（在屏幕区域选项卡的Histo视图中）。微调波长（数纳米），然后调节聚焦光束的x、y、z位置，使平均强度值最大化。

6. 延迟线光路的封闭

  1. 由于最终系统面向非物理专业人员，需用管材或封闭箱体将延迟线的光路封闭，以避免直接接触有害的不可见高峰值功率激光束。注意应保留对平移台旋钮的访问通道。

7. CARS 的波长调谐

  1. 使用该方程 光学频率混合方程，ΩR=1/λP-1/λS，涉及钛宝石激光器和OPO波长。 调节激光波长以匹配所需的拉曼振动。为重现本研究中展示的结果，需对C-H键的CARS信号进行成像，其伸缩振动波数为3015 cm⁻¹。-1，选择 λTi:蓝宝石 = 830 nm 和 λOPO = 1,095 nm
    注意：在生物样品（如水、C-H 键）中观察到的拉曼特征振动频率可参见 Evans 等13 或在 Ellis 等29.
  2. 使用该方程式 CARS 波长公式用于 λ 计算；光学光谱法；科学方程。 以确定CARS信号的发射波长。进行C-H键的CARS成像时，选择670 nm的窄带滤光片，因为λ相干反斯托克斯拉曼散射 = 670 nm，激光波长参见7.1节
    注意：可使用手机应用程序计算 λ相干反斯托克斯拉曼散射 从 λP 和 λS 值（参见参考文献30）。

8. 坐骨神经切片中CARS信号与染色髓鞘的观察

注意：所有动物实验均按照机构规定进行。

  1. 按照 Ozçelik et al.31 中所述方法，在显微镜载玻片上制备坐骨神经的轴向和纵向切片。
  2. 将氟代髓鞘红染色原液用 PBS 稀释 300 倍，配制染色工作液。将切片浸入染色液中，在室温下染色 20 分钟。移除染色液后，用 PBS 洗涤 3 次，每次 10 分钟。
  3. 将切片置于 20X 水浸物镜下，加盖盖玻片。滴加数滴 PBS 以浸没物镜，并调节物镜焦距，通过目镜观察获得清晰的切片图像（如 4.2 节所述）。
  4. 在通道 1 中，选择钛宝石激光器和 OPO 激光器，并将其波长分别设定为 830 nm 和 1,095 nm。在 光路窗口 中，选择 PMT1 并设置为绿色。
  5. 在通道 2 中，仅选择 OPO 激光器（波长设为 1,095 nm）。在 光路窗口 中，选择 PMT4 并设置为红色。
  6. 对两个激光器均选择低功率，并将增益初始设为 600。开启激光扫描，调节以下参数以优化 CARS 和荧光信号的对比度：激光功率、平移台旋钮（轻微调节）、波长（数纳米范围内调整）以及显示强度。
  7. 为以高分辨率记录最终图像，在 采集模式工具 中设置以下参数：帧尺寸为 1,024 像素，扫描速度为 7，平均次数为 4。点击“Snap”按钮以采集单幅图像。将图像以专有格式保存，以同时记录图像及完整的采集参数。

9. 坐骨神经切片中CARS与SHG信号的观察

  1. 按照 Ozçelik 中所述方法制备坐骨神经 等31.
  2. 按照第8部分所述步骤操作，通过目镜获取图像，并选择CARS信号参数（Track 1）。
  3. 在 Track 2 中，仅选择 OPO 激光器（波长为 1095 nm）。在 光路窗口，选择 PMT3 和品红色。
  4. 按照第8部分所述步骤开启激光扫描，并保存高分辨率图像。

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结果

标准钛宝石激光器的脉冲序列频率通常约为80 MHz。由于OPO由钛宝石激光器泵浦，其频率与之相同。因此，需要至少200 MHz的高速示波器。还需要一个响应波长范围为600至1,100 nm的高速光电探测器。当钛宝石激光与OPO信号之间的时移达到1/(2×80×106) = 6.2纳秒时，出现最大的时间偏移，这对应于最大1.9米的光程差。图2显示了从OPO激光束记录的脉冲序列（A），以及未加延迟线（B）和调整延迟线后（C）的钛宝石激光束脉冲序列。因此，如图2A和2C所示，通过引入延迟线，两个脉冲序列在时间上基本实现了同步。

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讨论

工作中最具挑战性的部分是激光束的时间同步。首先需要使用快速光电二极管结合快速示波器进行操作，但最初只能实现时间上的粗略重叠。随后需进行数厘米范围内的进一步调整。最后，通过线性平移台进行微米级移动，对延迟线长度进行最终精细调节，以触发CARS信号。通过调节平移台的微米驱动装置可观察到，该信号维持在约20微米的窄范围内，这对应于激光脉冲重叠时间偏移约半个脉冲周期。 即， 140飞秒。产生CARS信号所需的两束光的空间重叠，类似于此类激光扫描显微系统中的常规光束准直。

对于具备基础实验光学知识的生物学家，或在与物理学家合作的情况下，延迟线的搭建可在数周内完成。在选择反射镜时需格外谨慎，以尽量减少反射损耗。尽管搭建延迟线所需的大部分材料价格较为合理，但所需的示波器并非标准型号。因此，由于完成时间同步校准仅需数天，从物理实验室借用示波器似乎是最佳选择。空间重叠过程可能较为耗时，因其需要调节多个反射镜和透镜（具体取决于激光扫描系统，这些元件可配备电机驱动）。早期基于两台电子同步的钛宝石激光器的CARS激光系统，在长期运行（数十分钟至数小时）中存在脉冲时间重叠不稳定的问题。该问...

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披露

作者声明不存在任何竞争性经济利益。

致谢

作者感谢法国蒙彼利埃 IES（UM）的 Philippe Combette 博士提供高速示波器，并感谢蒙彼利埃 RIO 成像中心（MRI）提供的经费支持。HR 感谢法国生物成像（France Bio Imaging，ANR-10-INSB-04-01）和法国生命成像（France Life Imaging，ANR-11-INSB-0006）基础设施网络对相干拉曼成像技术发展的支持。本研究主要由欧洲研究理事会资助项目（FP7-IDEAS-ERC 311610）以及法国国家健康与医学研究院（INSERM）—AVENIR 资助项目支持，资助对象为 NT。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
示波器TektronixTDS 520D500 MHz 
光电探测器ThorlabsDET08C/M, T42905 GHz InGaAs，800 - 1,700 nm
Ti:Sapphire 激光器 Chameleon Ultra Family IICoherent
光学参量振荡器 OPO Compact FamilyAPE Berlin
Axio Examiner 显微镜 LSM 7 MPCarl Zeiss
电动潜望镜Newport
物镜 W Plan-Apochromat 20X/1.0Carl Zeiss
光束合束器Carl Zeiss
声光调制器Carl Zeiss
OPO 功率衰减器Carl Zeiss
光电倍增管Carl Zeiss
ZEN 软件Carl Zeiss
带通滤光片Carl ZeissLSM BiG 1935-176400 - 480 nm；500 - 550 nm；465 - 610 nm
二向色镜Carl Zeiss截止波长 760 nm
银镜Newport10D20ER.2 λ/10，480 - 20,000 nm，数量 4
带标准千分尺的单轴平移台ThorlabsPT1/M数量 1
铝制光学平台ThorlabsMB1015/M 数量 1
镜片安装架ThorlabsKMSS/M 数量 4
用于 Ø1" 光学元件的镜片夹持器 ThorlabsMH25数量 4
可调光阑 ThorlabsID8/M数量 3
防护箱ThorlabsTB4, XE25L900/M, T205-1.0, RM1S数量 1
光学支架杆ThorlabsTR40/M, PH50/M, PH75/M, BA2/M数量 8（长度根据装置配置而定）
661 - 690 nm 带通滤光片Semrock676/29 nm BrightLine® 单通带带通滤光片数量 1
荧光微球ThermoFisherTetraSpeck™ 荧光微球尺寸套装
激光观察卡Thorlabs红外激光观察卡
激光防护眼镜NewportLV-F22.P5L07 
FluoroMyelin™ 红色荧光髓鞘染色剂 ThermoFisherF34652

参考文献

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在基于钛宝石和光参量振荡器激光器的标准激光扫描显微镜上实现相干反斯托克斯拉曼散射（CARS）系统
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