在基于钛宝石和光参量振荡器激光器的标准激光扫描显微镜上实现相干反斯托克斯拉曼散射（CARS）系统

摘要

基于分子键固有振动的相干反斯托克斯拉曼散射（CARS）显微技术，能够实现无需标记的化学选择性活细胞成像。本文介绍了在基于飞秒钛宝石激光器和OPO激光器的标准多光子激光扫描显微镜上，实现一种互补显微技术的方法。

摘要

结合飞秒钛宝石激光器与光学参量振荡器（OPO）以复制激光谱线的激光扫描显微镜已向生物学家开放使用。这些系统主要设计用于多通道双光子荧光显微成像。然而，在无需任何改装的情况下，该装置还可用于其他互补的非线性光学显微技术，如二次谐波产生（SHG）或三次谐波产生（THG），从而实现对有序分子结构或水相-脂质界面的无标记成像。这些技术非常适合于 体内 观察具有局限性，但在化学特异性方面存在不足。基于拉曼散射的固有振动信号可实现化学选择性成像。共聚焦拉曼显微技术可提供三维空间分辨率，但需要较高的平均功率和较长的采集时间。为克服这些困难，近年来激光技术的进步推动了非线性光学振动显微技术的发展，尤其是相干反斯托克斯拉曼散射（CARS）。因此，CARS显微技术已成为生物样本和活细胞成像的有力工具，能够通过化学映射脂质（通过C-H伸缩振动）、水（通过O-H伸缩振动）、蛋白质或DNA实现可视化。本文中，我们描述了在标准OPO耦合的多光子激光扫描显微镜上实现CARS技术的方法。该方法基于调节其中一路激光光束的光程长度，实现两束激光线在时间上的同步。我们逐步展示了在现有多光子系统上实施该技术的具体步骤。具备基本的实验光学背景知识将有助于操作，且所介绍的系统无需昂贵的附加设备。我们还展示了在啮齿类动物坐骨神经髓鞘上获得的CARS成像结果，并证明该成像可与其他非线性光学成像技术（如标准双光子荧光技术和二次谐波生成）同时进行。 关键词：CARS显微技术，相干反斯托克斯拉曼散射，多光子显微镜，非线性光学成像，化学特异性成像，髓鞘，OPO，拉曼散射，振动显微技术，活细胞成像

引言

光学显微技术已成为以亚细胞分辨率无损观测活体生物系统中动态过程的主要手段。由于具有高特异性和高灵敏度，荧光显微技术目前是活细胞成像中最常用的成像对比方法¹。大量荧光探针已被开发出来（包括外源性染料、基因编码蛋白和半导体纳米颗粒）。基于不同样品照明方式的荧光成像技术也迅速发展（如共聚焦显微或双光子显微技术），以实现三维成像并减轻该技术的主要缺陷——光漂白²。其他局限性包括需要荧光标记，因为大多数分子本身不具备荧光特性，因此必须人为地将这些荧光基团引入待成像样品中。这种人为操作可能对小分子产生干扰，或引发潜在的光毒性。这些因素使得荧光显微技术不太适用于活体（in-vivo）观测。因此，在生物医学研究中，迫切需要发展无需使用荧光分子、但仍具备高灵敏度和特异性分子对比能力的光学成像技术。

多种无需标记或染色的非线性光学成像技术相继出现，包括二次谐波产生（SHG）^3,4 和三次谐波产生（THG）⁵二次谐波显微技术已被用于成像微管或胶原蛋白等超分子水平的结构排列。⁶三倍频光由光学非均匀性产生，例如水相介质与脂质之间的界面⁷. THG 还被证明可用于成像髓鞘^8,9两种技术均可在双光子荧光显微镜上实现，且仅需一束激光。然而，它们需要较高的激光功率密度（通常在860 nm波长下为50 mW，用于SHG）¹⁰

方案

图1. 实验装置的示意图。 装置包括钛宝石激光器（680 – 1,080 nm）和OPO激光器（1,050 – 1,300 nm）、由四面反射镜（M₁ 至 M₄）构成的延迟线、高速示波器、光电二极管以及两个固定的虹膜光阑 I₁ 和 I₂。反射镜 M₂ 和 M₃ 安装在直线平移台上，可通过微米级分辨率调节延迟线的长度。在用于CARS成像的光电倍增管（PMT）前方放置了一个660 – 685 nm的带通滤光片。请点击此处查看该图的放大版本。

1. 激光系统的启动

1. 确认钛宝石激光器的波长设置为800....

结果

标准钛宝石激光器的脉冲序列频率通常约为80 MHz。由于OPO由钛宝石激光器泵浦，其频率与之相同。因此，需要至少200 MHz的高速示波器。还需要一个响应波长范围为600至1,100 nm的高速光电探测器。当钛宝石激光与OPO信号之间的时移达到1/(2×80×10⁶) = 6.2纳秒时，出现最大的时间偏移，这对应于最大1.9米的光程差。图2显示了从OPO激光束记录的脉冲序列（A），以及未加延迟线（B）和调整延迟线后（C）的钛宝石激光束脉冲序列。因此，如图2A和2C所示，通过引入延迟线，两个脉冲序列在时间上基本实现了同步。

讨论

工作中最具挑战性的部分是激光束的时间同步。首先需要使用快速光电二极管结合快速示波器进行操作，但最初只能实现时间上的粗略重叠。随后需进行数厘米范围内的进一步调整。最后，通过线性平移台进行微米级移动，对延迟线长度进行最终精细调节，以触发CARS信号。通过调节平移台的微米驱动装置可观察到，该信号维持在约20微米的窄范围内，这对应于激光脉冲重叠时间偏移约半个脉冲周期。 即， 140飞秒。产生CARS信号所需的两束光的空间重叠，类似于此类激光扫描显微系统中的常规光束准直。

对于具备基础实验光学知识的生物学家，或在与物理学家合作的情况下，延迟线的搭建可在数周内完成。在选择反射镜时需格外谨慎，以尽量减少反射损耗。尽管搭建延迟线所需的大部分材料价格较为合理，但所需的示波器并非标准型号。因此，由于完成时间同步校准仅需数天，从物理实验室借用示波器似乎是最佳选择。空间重叠过程可能较为耗时，因其需要调节多个反射镜和透镜（具体取决于激光扫描系统，这些元件可配备电机驱动）。早期基于两台电子同步的钛宝石激光器的CARS激光系统，在长期运行（数十分钟至数小时）中存在脉冲时间重叠不稳定的问题。该问.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
示波器	Tektronix	TDS 520D	500 MHz
光电探测器	Thorlabs	DET08C/M, T4290	5 GHz InGaAs，800 - 1,700 nm
Ti:Sapphire 激光器 Chameleon Ultra Family II	Coherent
光学参量振荡器 OPO Compact Family	APE Berlin
Axio Examiner 显微镜 LSM 7 MP	Carl Zeiss
电动潜望镜	Newport
物镜 W Plan-Apochromat 20X/1.0	Carl Zeiss
光束合束器	Carl Zeiss
声光调制器	Carl Zeiss
OPO 功率衰减器	Carl Zeiss
光电倍增管	Carl Zeiss
ZEN 软件	Carl Zeiss
带通滤光片	Carl Zeiss	LSM BiG 1935-176	400 - 480 nm；500 - 550 nm；465 - 610 nm
二向色镜	Carl Zeiss		截止波长 760 nm
银镜	Newport	10D20ER.2	λ/10，480 - 20,000 nm，数量 4
带标准千分尺的单轴平移台	Thorlabs	PT1/M	数量 1
铝制光学平台	Thorlabs	MB1015/M	数量 1
镜片安装架	Thorlabs	KMSS/M	数量 4
用于 Ø1" 光学元件的镜片夹持器	Thorlabs	MH25	数量 4
可调光阑	Thorlabs	ID8/M	数量 3
防护箱	Thorlabs	TB4, XE25L900/M, T205-1.0, RM1S	数量 1
光学支架杆	Thorlabs	TR40/M, PH50/M, PH75/M, BA2/M	数量 8（长度根据装置配置而定）
661 - 690 nm 带通滤光片	Semrock	676/29 nm BrightLine® 单通带带通滤光片	数量 1
荧光微球	ThermoFisher	TetraSpeck™ 荧光微球尺寸套装
激光观察卡	Thorlabs		红外激光观察卡
激光防护眼镜	Newport	LV-F22.P5L07
FluoroMyelin™ 红色荧光髓鞘染色剂	ThermoFisher	F34652