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方法文章

测量人血液中粒细胞和单核细胞的吞噬作用及氧化爆发活性

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DOI：

10.3791/54264

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2016年9月12日

 ,  ,  ,  , 
1Human Performance Laboratory, North Carolina Research Campus, Appalachian State University, 2Department of Biology, Appalachian State University, 3David H. Murdock Research Institute

本文内容

摘要

本论文的目的是介绍一种用于测定人血液样本中单核细胞和粒细胞吞噬作用及氧化爆发活性的方法。

摘要

粒细胞和单核细胞的吞噬作用及氧化爆发（OB）活性检测可用于研究先天免疫系统。本文提供了将该检测方法纳入运动免疫学研究工具所需的方法学。该检测的第一步是制备两份全血（肝素抗凝）样品（分别标记为“H”和“F”）。然后向H份样品中加入二氢乙啶，将两份样品均在温水浴中孵育，随后转移至冷水浴。接下来，向H份样品中加入金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus，S. aureus），向F份样品中加入异硫氰酸荧光素标记的S. aureus（细菌：吞噬细胞 = 8:1），两份样品再次在温水浴中孵育后转移至冷水浴。随后，向每份样品中加入台盼蓝以淬灭胞外荧光，细胞用磷酸盐缓冲液洗涤。接着裂解红细胞，并固定白细胞。最后，使用流式细胞仪及相应的分析软件检测粒细胞和单核细胞的吞噬作用及OB活性。该检测方法已应用超过20年。在经历剧烈且长时间的运动后，运动员的吞噬作用会出现显著但短暂的升高，而OB活性则出现持续性下降。运动后吞噬作用的升高与炎症反应相关。与正常体重个体相比，超重和肥胖个体的粒细胞和单核细胞吞噬作用长期处于升高状态，且与C反应蛋白呈轻度相关。综上所述，这一基于流式细胞术的检测方法可评估吞噬细胞的吞噬作用和OB活性，可作为运动和肥胖诱导炎症的附加评估指标。

引言

粒细胞和单核细胞的吞噬作用/氧化爆发（OB）活性检测是一种简单直接的技术，常用于获取长时间高强度运动后先天免疫功能的相关信息。1-4 在研究免疫系统对刺激的反应时，粒细胞和单核细胞尤为值得关注，因为它们在宿主防御中起核心作用，并且是最早在感染部位聚集的免疫细胞。5 中性粒细胞作为粒细胞的一种，是在高强度运动后最先迁移至受损肌肉组织的细胞。6 吞噬作用和氧化爆发活性是评估粒细胞和单核细胞功能最常用的指标7，由于其在感染过程和修复过程中均发挥关键作用，因此被优先选作先天免疫细胞功能的指示参数。

本论文所述的方法利用基础流式细胞仪，对全血中粒细胞和单核细胞的吞噬作用及氧化爆发（OB）活性进行定量测定。该技术采用全血具有优势，因为它无需耗时的细胞纯化步骤即可完成检测。本方法可轻松调整，以适应多种研究设计和实验室条件。例如，Liao et al. 采用类似技术发现，创伤性脑损伤后中性粒细胞的OB活性升高，而吞噬功能下降。8 另一个例子中，McFarlin et al. 报道了对该技术的一项精巧改进，即使用别藻蓝蛋白（APC）偶联的CD66b抗体以及高性能APC串联偶联的CD45抗体，并结合基于成像的流式细胞术，对粒细胞的吞噬活性和OB活性进行分类分析。7,9

近20年来，我们的研究团队已将该技术的多种改进方法用于评估超重、肥胖及运动员人群中先天免疫功能的指标。10,11 下文将为读者提供执行该检测的逐步操作说明，并指出读者可根据自身研究需求进行调整的环节。

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方案

注意：所有血液采集程序均遵循阿巴拉契亚州立大学（ASU）机构审查委员会（IRB）制定的指南进行。

1. 检测准备

  1. 收集、准备并整理该实验步骤所需的材料（详见特定材料/设备列表）。
    1. 标记12 x 75 mm试管。
      1. 为每位参与者标记两支试管：一支用于吞噬作用检测（用黑色墨水标记该试管并标注“F”） "F" 用于异硫氰酸荧光素 [FITC]）以及一个用于氧化爆发（OB）活性检测的试管（用红色墨水标记该试管并标注 "H" 用于二氢乙啶 [HE]。
        注意：建议使用无菌的12 x 75 mm试管，以尽量减少非预期的细胞活化及相关背景信号的升高。
      2. 为实验对照标记三支试管：一支用于吞噬作用检测（FITC对照：用黑色墨水标记该试管并标注 "F"），一管用于氧化爆发（OB）活性检测（HE对照：用红墨水标记此管并标注 "H"），以及一管用于阴性对照（仅血液：用绿色墨水标记该管） "仅血液").
    2. 至少在实验前一天配制储备液。
      1. 制备无菌磷酸盐缓冲液（PBS）。将100 ml的10倍浓缩PBS与900 ml的18.2 MΩ·cm超纯水混合稀释。Ω H2O. 使用0.2 μm滤器过滤除菌 µm 滤膜。4℃保存 °直至使用前均置于 C 保存。
      2. 配制无菌 PBS-葡萄糖溶液。将 1.0 g 葡萄糖溶解于 100 ml PBS 中，使用 0.2 μm 滤器过滤除菌。 µm 滤膜。4℃保存 °直至使用前均置于 C 保存。
      3. 配制无菌的 0.1 M 柠檬酸盐缓冲液。将 1.2 g 柠檬酸和 1.1 g 柠檬酸钠溶解于 100 ml 的 18.2 M 水中。Ω H2O. 将 pH 调至 4.0。使用 0.2 µm 滤膜。4℃保存 °直至使用前均置于 C 保存。
      4. 配制 HE 储存液。将 1.0 mg HE 溶于 1.0 ml 二甲基亚砜（DMSO）中，轻轻混匀，分装后于 -20 ℃ 保存。 °直至使用前均置于 C 保存。
      5. 制备荧光素异硫氰酸酯标记的 金黄色葡萄球菌 (S. aureus) 储备液 (2 × 109 颗粒/毫升）。重悬10 mg FITC标记的 S. aureus 在1.5 ml（或适量）PBS中，分装为三份，每份500 µl 分装并根据制造商的建议进行超声处理。分装后于 -20 保存 °直至使用前均置于 C 保存。
      6. 制备未标记的 S. aureus 储存液（2 × 109 颗粒/毫升）。重悬100毫克未标记的 S. aureus 在15 ml（或适量）PBS中，分装为三十份，每份500 µl 分装并根据制造商的建议进行超声处理。分装后于 -20 保存 °直至使用前均置于 C 保存。
    3. 在实验当天配制新鲜的工作液。
      1. 配制HE工作液。转移10 µ微升解冻的HE储备液加入990 µ1 mL PBS-葡萄糖。避光并置于冰上直至使用。
      2. 制备荧光素异硫氰酸酯标记的 S. aureus 工作溶液（133,333 个颗粒/μL）µl）转移 70 µμl 解冻的 FITC 标记 S. aureus 将贮存液稀释至980 µl PBS。避光并置于冰上直至使用。
      3. 准备未标记的 S. aureus 工作液（133,333 个颗粒/μL）µl) 转移 70 µ解冻的未标记的 l S. aureus 将贮存液稀释至980 µl PBS。避光并置于冰上直至使用。
      4. 配制淬灭溶液。加入750 µ将0.4%台盼蓝溶液加入11.25 ml无菌0.1 M柠檬酸盐缓冲液中。置于冰水浴中保存，直至使用。
    4. 由经认证的采血员按照世界卫生组织的采血指南采集血液。
      1. 将血液抽入一支含有K的4 ml采血管中2EDTA。根据制造商说明倒置采血管。将采血管置于室温下的台式摇床上，直至使用。此血液用于步骤1.2.1中所述的白细胞（WBC）分类计数的全血细胞计数（CBC）。
      2. 将血液采集至一支含锂肝素的4 ml采血管中。根据制造商说明将采血管轻轻颠倒混匀。将采血管置于室温下的台式摇床上，直至使用。此血液用于步骤2中所述的单核细胞和粒细胞吞噬作用及OB活性检测。
  2. 确定细菌的数量（即, S. aureus完成每个样本检测所需的材料。
    1. 使用血细胞分析仪，按照制造商说明书对血液进行全血细胞计数（CBC）并完成白细胞分类分析。记录白细胞计数（单位：个细胞/ml）、中性粒细胞百分比（%Neutrophil）和单核细胞百分比（%Monocyte）的数值。
    2. 使用以下公式计算每个样本的中性粒细胞和单核细胞数量。
      中性粒细胞计数（细胞/毫升）= 中性粒细胞百分比 × 白细胞（单位：个细胞/毫升）
      单核细胞计数（细胞/毫升）= 单核细胞百分比 × 白细胞（单位：个细胞/毫升）
    3. 使用以下公式计算每个样本的吞噬细胞数量以及100个吞噬细胞中所含的吞噬细胞数目 µ样本的升数
      吞噬细胞计数（个细胞/毫升）= 中性粒细胞计数（个细胞/毫升）+ 单核细胞计数（个细胞/毫升）
      100个吞噬细胞的数量 µl =（吞噬细胞计数（单位：个细胞/毫升））/10
    4. 使用以下公式确定细菌数量（即, S. aureus每个样本所需量以及FITC标记的 S. aureus 或未标记的 S. aureus 工作溶液（133,333 个颗粒/毫升），应添加至每支试管中。
      注意：目标细菌与吞噬细胞的比例为 8:1。
      所需细菌数量 = 100 个吞噬细胞中的吞噬细胞数量 µl × 8
      FITC标记或未标记工作液所需体积（单位： µl) = (所需细菌数量)/(133,333 粒子/µl)

2. 进行实验

  1. 为实验准备全血。
    1. 每位参与者及对照管均使用加长型移液器吸头转移 100 µ从锂肝素采血管中取适量全血加入到标记妥当的12 x 75 mm试管底部。盖上管盖。
      注意：小心避免将血液沾到12 x 75 mm试管的管壁上。
    2. 使用微量移液器加入10 µ将100 μl HE工作液加入用红墨水标记的试管中，并加入 "H"，包括HE对照管。盖上管盖并短暂涡旋振荡。
    3. 将所有试管在37℃水浴中孵育 °在37°C水浴中孵育15分钟。然后，立即将所有试管转移至冰水浴中孵育12分钟。
      注意：使用开放式金属架，并每隔 5 分钟轻轻摇动架子，以确保试管迅速且充分地升温或降温。
  2. 加入细菌（即, S. aureus) 加入样本管和对照管中。
    1. 使用微量移液器加入适量未标记的（在步骤1.2.4中计算） S. aureus 将工作液加入用红墨水标记的试管中，并进行 "H"，包括HE对照管。盖上管盖并短暂涡旋振荡。
    2. 使用微量移液器加入适量（按步骤1.2.4计算）的FITC标记的 S. aureus 将工作液加入用黑色墨水标记的试管中，并加入 "F"，包括 FITC 对照管。盖上管盖并短暂涡旋振荡。
    3. 涡旋混合 "仅血液" 对照管，但不加入任何类型的细菌（即, S. aureus) 加入其中。
    4. 将所有试管在 37 °37°C 水浴中孵育 20 分钟。使用开放式金属架，并每 5 分钟轻轻摇动一次，以确保试管迅速且充分地升温。孵育结束后，立即将所有试管转移至冰水浴中，持续 1 分钟。
  3. 洗涤细胞。
    1. 使用重复移液器加入100 µ向所有试管中加入冰冻淬灭溶液1毫升。盖上管盖，短暂涡旋混匀，然后将所有试管置于冰上孵育1分钟。
    2. 使用多通道移液器向所有试管中加入1 ml预冷的PBS。短暂涡旋振荡后，再向所有试管中加入2 ml预冷的PBS，并盖上管盖。将所有试管在4 °C下以离心力离心5 min。 °C 和 270 × g 离心，然后吸除上清液。
    3. 重复步骤 2.3.2 一次（共洗涤 2 次）。
  4. 为流式细胞术准备样品。
    1. 使用重复移液器加入 50 µ向所有试管中加入冰冻胎牛血清1升。短暂涡旋振荡所有试管。
    2. 将所有试管转移至合适的转盘中，并使用配备红细胞（RBC）裂解液和白细胞（WBC）固定液的自动细胞裂解制备工作站，按照制造商说明书所述步骤裂解红细胞并固定白细胞。
    3. 自动化细胞裂解制备工作站运行结束后，用铝箔包裹试管并置于4℃保存 °C冰箱中，直至进行流式细胞术分析。

3. 流式细胞术数据采集

  1. 设置流式细胞仪系统。
    1. 按照制造商提供的用户手册说明启动流式细胞仪系统并进行预热。然后检查试剂和废液罐的液位。如有需要，补充试剂罐和/或清空废液罐。
    2. 使用 "清洁面板" 运行系统清洗循环功能。然后运行校准和流路验证用荧光微球，并确保每个检测器的半峰变异系数（HPCV）处于制造商提供的质量控制（QC）规程所规定的预设范围内。
  2. 创建针对该检测的采集和仪器设置方案。
    1. 为吞噬作用和氧化爆发活性检测建立特定的采集方案。
      注意：此处所述的采集方案可适用于任何配备蓝色激光（488 nm）、FITC滤光片（530/30）和HE滤光片（575/26）的流式细胞仪。
      1. 打开流式细胞仪系统采集软件并创建一个新文件 "新方案".
      2. 选择 "FL1参数" 吞噬作用检测（FITC）和氧化爆发活性检测 "FL2 参数" 用于氧化爆发活性检测（HE）。
      3. 创建图表（即，前向散射 [FSC] 与 侧向散射[SSC]点图、FL1直方图、FL2直方图）采集所需。
      4. 在FSC上为白细胞（WBC）、粒细胞和单核细胞群体创建多边形区域 与 SSC 散点图，并在 FL1 和 FL2 直方图上创建线性区域。设置一个 "停止计数" 采集白细胞门控的50,000个事件。
      5. 使用与检测方法相对应的特定名称保存实验方案。
    2. 为吞噬作用和氧化爆发活性检测建立特定的仪器设置方案。
      1. 拖放 "特异性检测获取方案" （在步骤 3.2.1 中定义）的 "资源探索器" 到 "采集管理器" 在流式细胞仪系统的数据采集软件上。
        注意：以这种方式添加的信息将始终显示在工作列表的末尾。
      2. 将样本信息输入工作列表，并保存该工作列表。
      3. 从4℃环境中取出对照样本管 °将C冰箱中的样本取出，在室温下平衡15分钟。然后，短暂涡旋振荡每个对照样本管。
      4. 使用 "特异性检测获取方案" 在步骤3.2.1中定义，用于运行阴性对照样本（即，仅血液）和阳性对照样本（即，HE 对照，FITC 对照）通过流式细胞仪系统进行检测。查看直方图，并根据需要调整 FITC 和藻红蛋白（PE）通道的光电倍增管（PMT）电压。
      5. 涡旋混匀对照样品，并根据工作列表上的顺序将其转移至流式细胞仪系统的样品盘中。然后，将样品盘放入进样室，并点击细胞仪工具栏 "开始" 按钮以获取对照样本的数据。保存 "xxx 设置专业版" 设定实验方案。
  3. 在流式细胞仪系统上获取研究样本。
    1. 从4℃水浴中取出研究样本管 °将样品置于4°C冰箱中，取出后于室温平衡15分钟。
    2. 在样本平衡的同时，将预定义的特定研究采集方案拖动到工作列表区域，以创建项目工作列表。
    3. 确认 "设定实验方案" 与……相关联 "特异性实验设置方案" 在步骤 3.2.2 中定义。然后，输入识别信息（例如，研究名称，采样编号，访视编号，受试者编号）填入每支试管的工作列表中。
    4. 15分钟平衡期结束后，涡旋震荡研究样本，并根据工作列表上的顺序将其转移至流式细胞仪系统的样本架中。然后，将样本架放入进样室，并点击细胞仪工具栏 "开始" 单击按钮以获取研究样本的数据。
    5. 通过检查每个样本报告面板上的红细胞裂解效率、白细胞亚群分布、比例、绝对计数及荧光强度，评估数据质量。
      注意：如果所有这些标准均处于其预设限值范围内，则认为数据质量可接受。若未满足全部标准，则应重新处理样本。
    6. 清洁并关闭流式细胞仪系统。将流式细胞术数据存储在两个不同的计算机驱动器上，以防止意外数据丢失。

4. 数据分析

  1. 进行吞噬作用分析。
    1. 整合所有吞噬作用（即将F标记样本和对照列表模式数据（LMD）文件放入同一个文件夹中。然后打开流式细胞术分析软件，将文件拖入样本区域。
    2. 设定白细胞、粒细胞、单核细胞和淋巴细胞门控。
      1. 双击文件名以打开其中任意一个 "FITC 对照样品". 使用下拉菜单将 x 轴设置为 "FSC" 和 "线性" 和y轴到 "SSC" 和 "线性".
      2. 使用 "多边形门控选择器" 用于圈定总白细胞群体的门控。
        注意：务必包含图表边缘的所有细胞。将此门标记为 "白细胞".
      3. 双击 "新的白细胞门控" 并使用下拉菜单将 x 轴设置为 "FSC" 和 "线性" 和y轴到 "SSC" 和 "线性".
      4. 使用 "多边形门控选择器" 设定 "粒细胞门控" 和单核细胞门"，然后使用 "椭圆门控选择器" 设定 "淋巴细胞门控". 相应地标记每个门。拖动 "设门数据（%）" 移至一侧，以便于观察细胞。
    3. 设定 "吞噬作用阳性门控" 以及 "吞噬作用阴性门控" 用于粒细胞和单核细胞群体。
      1. 双击 "FITC 对照样品" 用于步骤 4.1.2.1。然后，单击 "粒细胞门控" 并使用下拉菜单将 x 轴设置为 "FL1" 和 "记录" 和y轴到 "SSC" 和 "线性".
      2. 使用 "方形门控选择器" 设定一个 "吞噬作用阴性门控" 和一个 "吞噬作用阳性门控".
        注意：由于FITC对照样品未接受细菌（即, S. aureus）刺激下，理论上所有细胞均应为吞噬阴性。在确定这些细胞群的界限时，需谨慎判断。
      3. 对单核细胞群体重复步骤 4.1.3.1 和步骤 4.1.3.2。
    4. 添加统计信息 "% 白细胞", "荧光强度"，以及 "%吞噬细胞阳性细胞" 用于粒细胞和单核细胞群体。
      1. 点击 "FITC 对照样品" 用于步骤 4.1.2.1。选中 "粒细胞门控"，然后点击 "工作区" 和 "添加统计"高亮 "几何平均数" 和 "FL1 对数" 并点击 "添加"。然后选择 "亲代频率" 统计并点击 "添加".
        注意：这将给出整个粒细胞群体的荧光强度（几何均值）以及占白细胞（母群）百分比的粒细胞比例。
      2. 点击 "FITC 对照样品" 用于步骤 4.1.2.1。选中 "吞噬作用阳性门控" 粒细胞群体，然后单击 "工作区" 和 "添加统计". 突出显示 "几何平均数" 和 "FL1 对数" 并点击 "添加"。然后选择 "亲代频率" 统计与点击 "添加".
        注意：这将给出吞噬阳性粒细胞的荧光强度（几何均值）以及粒细胞（母群）中吞噬阳性细胞的百分比。
      3. 对单核细胞群体重复步骤 4.1.4.1 和步骤 4.1.4.2。
      4. 点击 "FITC 对照样品" 用于步骤 4.1.2.1。选中 "淋巴细胞门控"，然后点击 "工作区" 和 "添加统计". 突出显示 "亲代频率" 统计并点击 "添加".
        注意：这将给出淋巴细胞占白细胞（父群）的百分比。
      5. 高亮所有在4.1.2.1步骤中使用的FITC对照样本中创建的门控和统计结果。将它们拖入 "所有样本" 在 "组别" 屏幕顶部的面板
        注意：这将把这些设置应用到所有研究样本。
      6. 将工作区保存为 .wsp 文件，并命名后存放在包含 LMD 文件夹的同一文件夹中。
    5. 调整各个样本的门控参数。
      1. 点击 "第一个样本" 在数据集中确认白细胞门（WBC gate）在屏幕上的细胞分布是否合适。若不合适，点击并拖动门的边缘，调整该样本的门。点击 "右箭头" (即， "˃") 以进入下一个样本。重复此步骤，直至所有样本均被审阅完毕。
      2. 点击 "白细胞门控" 数据集中第一个样本，并确认 "粒细胞门控", "单核细胞门控"，以及 "淋巴细胞门控" 为每个样本适当地调整屏幕上细胞分布的显示，必要时进行调节。单击 "右箭头" (即， "˃") 以进入下一个样本。
      3. 重复步骤 4.1.5.2，直至所有样本均被检视完毕。然后，点击 "保存".
    6. 在电子表格程序中显示数据。
      1. 点击 "表格编辑器" 屏幕顶部的图标。点击 "编辑", "关键词"，以及 "$DATE" 在最终的电子表格中包含采样日期。然后，单击 "编辑", "关键词"，以及 "@SAMPLEID1" 在最终的电子表格中包含采样编号。重复以上步骤 "@SAMPLEID2", "@SAMPLEID3"，以及 "@SAMPLEID4".
      2. 调节 "表格编辑器" 屏幕和 "样本" 屏幕，以便两者均可在计算机屏幕上查看。选择任意 "样本" 在样本表上，然后将每个感兴趣的统计量拖至 "表格编辑器".
        1. 拖动 "亲代频率" 统计列在下方的 "粒细胞门控" 到 "表格编辑器". 类型 "% 白细胞中的粒细胞" 在……的条件下 "中性粒细胞和单核细胞吞噬及氧化爆发活性检测" 列的 "表格编辑器".
        2. 拖动 "几何平均数" 统计值列在下方 "粒细胞门控" 到 "表格编辑器". 类型 "粒细胞几何平均荧光强度" 在……的条件下 "名称" 列的 "表格编辑器".
        3. 拖动 "亲代频率" 统计列在下方的 "粒细胞/吞噬作用阳性门控" 到 "表格编辑器". 类型 "% 吞噬阳性粒细胞" 在……的条件下 "名称" 列的 "表格编辑器".
        4. 拖动 "几何平均数" 统计列在下方的 "粒细胞/吞噬作用阳性门控" 到 "表格编辑器". 类型 "几何平均荧光强度，吞噬阳性粒细胞" 在……的条件下 "名称" 列的 "表格编辑器".
        5. 拖动 "亲代频率" 统计列在下方的 "单核细胞门控" 到 "表格编辑器". 类型 "% 白细胞中的单核细胞比例" 在……的条件下 "名称" 列的 "表格编辑器".
        6. 拖动 "几何平均数" 统计列在下方的 "单核细胞门控" 到 "表格编辑器". 类型 "单核细胞几何平均荧光强度" 在……的条件下 "名称" 列的 "表格编辑器".
        7. 拖动 "亲代频率" 统计列在下方的 "单核细胞/吞噬作用阳性门控" 到 "表格编辑器". 类型 "单核细胞吞噬阳性率百分比" 在……的条件下 "名称" 列的 "表格编辑器".
        8. 拖动 "几何平均数" 统计列在下方的 "单核细胞/吞噬作用阳性门控" 到 "表格编辑器". 类型 "几何平均荧光强度，吞噬阳性单核细胞" 在……的条件下 "中性粒细胞和单核细胞吞噬及氧化爆发活性检测" 列的 "表格编辑器".
        9. 拖动 "亲代频率" 统计列在下方的 "淋巴细胞门控" 到 "表格编辑器". 类型 "% 淋巴细胞占白细胞比例" 在……的条件下 "中性粒细胞和单核细胞吞噬及氧化爆发活性检测" 列的 "表格编辑器".
      3. 拖拽可见的参数到 "表格编辑器" 直到它们按理想顺序排列。
      4. 点击 "保存"然后，点击 "创建表格" 以表格格式显示数据。单击 "保存为" 将工作另存为 .xlsx 文件并命名。
  2. 重复第4.1步以进行氧化爆发（OB）活性检测即，H标记）样品和对照LMD数据文件。
    注意：请务必将所有关于吞噬作用的表述替换为关于氧化爆发（OB）活性的表述。

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结果

长时间且高强度的运动对先天免疫功能具有显著影响，包括自然杀伤细胞功能、巨噬细胞通过细胞因子介导的抗病毒感染反应，以及粒细胞和单核细胞的吞噬作用和氧化爆发（OB）活性。多项研究表明，运动后粒细胞和单核细胞的吞噬作用显著增强，反映出由肌肉损伤和代谢需求所引发的炎症反应。相反，运动后粒细胞和单核细胞的OB活性下降，这可能是感染易感性增加的一个免疫学指标。例如，图1显示，在完成75公里自行车骑行（70% VO2MAX）后，粒细胞对S. aureus的吞噬作用立即升高，并在1.5小时后仍保持升高，至次日早晨恢复至正常水平。单核细胞的吞噬作用也受到类似程度运动的相似影响。图2显示，粒细胞的OB活性在75公里骑行后至少持续降低21小时。单核细胞的OB活性在75公里骑行后同样下降。

粒细胞和单核细胞对S. aureus的吞噬作用与全身性炎症生物...

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讨论

本论文提供了一种测定粒细胞和单核细胞功能两项指标的逐步操作方案。我们已确定该实验成功所必需的若干关键步骤。其中一个关键步骤是在添加细菌前立即进行冰浴孵育。充分冷却所有样品可最大限度地减少温度对吞噬作用和氧化爆发（OB）活性的影响。另一个关键步骤是向每个样品中加入细菌。采用8:1的细菌：吞噬细胞比例可获得最佳结果；但其他研究人员可能会发现需要调整此比例以获得理想结果。另一个关键步骤是使用红细胞裂解液和白细胞固定液来裂解红细胞并固定白细胞。使用此类试剂可确保红细胞完全裂解，并使研究人员能够将处理后的样品安全地在4 °C下过夜保存，然后于次日进行流式细胞术检测。此前的未发表研究结果表明，使用红细胞裂解和白细胞固定方法可将固定样品的流式细胞术检测延迟长达12小时，而不会影响数据的完整性。

该实验方案可根据研究者的能力和兴趣进行灵活调整，但需要强调的是，任何修改均需进行必要的优化。已有报道中一些最常见的调整包括目标细菌、标记物/探针以及孵育时间。研究者在调整这些参数时已获得了优异的结果。 大肠杆菌7,8 代替 S. aureus 作为...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

作者谨此感谢 Zack Shue、Casey John 和 Lynn Cialdella-Kam 在本实验方案优化过程中提供的协助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
12 x 75 mm 带盖试管VWR20170-579每个样本需要 2 支试管（“H”和“F”），每批次额外需要 3 支试管（用于检测对照；“F”、“H”和“仅血液”）。
PBS（10 倍浓度），pH 7.4Life Technologies70011-044
瓶顶式 0.2 µm 醋酸纤维素滤器（500 ml 容量）Fisher Scientific09-741-07 
葡萄糖，粉末Life Technologies15023-021
柠檬酸（无水，经细胞培养测试，植物细胞培养测试）Sigma-AldrichC2404-100G
三水合柠檬酸钠二水合物Sigma-AldrichS4641-25G
二氢乙啶（氢乙啶）（HE）Life TechnologiesD11347
无水二甲基亚砜（DMSO）Life TechnologiesD12345
金黄色葡萄球菌 （不含蛋白 A 的 Wood 菌株）BioParticles，荧光素偶联物（FITC）Life TechnologiesS2851
金黄色葡萄球菌 （不含蛋白 A 的 Wood 菌株）BioParticles，未标记Life TechnologiesS-2859
0.4% 台盼蓝溶液Life Technologies15250-061
4.0 ml 真空采血管，含 7.2 mg 喷雾干燥 K2EDTAVWRBD367861每个样本需要 1 支 K2EDTA 血液采集管。
4.0 ml 真空采血管，内壁喷雾涂覆含 68 USP 单位锂肝素VWRBD367884每个样本需要 1 支锂肝素血液采集管。
COULTER Ac·T 5diff CPBeckman Coulter6605705即，血细胞分析仪
COULTER Ac·T 5diff RinseBeckman Coulter8547167
COULTER Ac·T 5diff FixBeckman Coulter8547171
COULTER Ac·T 5diff WBC LyseBeckman Coulter8547170
COULTER Ac·T 5diff Hgb LyseBeckman Coulter8547168
COULTER Ac·T 5diff Cal 校准品Beckman Coulter7547175
COULTER Ac·T 5diff Control PlusBeckman Coulter7547198
AcT 5diff 稀释液Beckman Coulter8547169
200 µl 加长型移液器吸头VWR37001-526
隔热冰盘VWR89198-980用于冰水浴。
开放式金属试管架VWR60916-702
胎牛血清Life Technologies26140-111
TQ-Prep 工作站Beckman Coulter6605429即，自动化细胞裂解制备工作站
ImmunoPrep 试剂系统Beckman Coulter7546999即，红细胞裂解/白细胞固定试剂系统
Cytomics FC500 MCL 流式细胞仪系统，配备 CXP 软件Beckman Coulter626553
IsoFlow 包围液Beckman Coulter8547008
COULTER CLENZBeckman Coulter8546929
Flow-Check 荧光微球 Beckman Coulter6605359即，用于校准和流路验证的荧光微球
FlowJo 软件FlowJoFlowJo即，流式细胞术分析软件
Excel 软件MicrosoftMicrosoft Excel即，电子表格程序

参考文献

  1. Nieman, D. C., et al. Influence of pistachios on performance and exercise-induced inflammation, oxidative stress, immune dysfunction, and metabolite shifts in cyclists: a randomized, crossover trial. PLoS One. 9, e113725(2014).
  2. Knab, A. M., et al. Effects of a freeze-dried juice blend powder on exercise-induced inflammation, oxidative stress, and immune function in cyclists. Appl Physiol Nutr Metab. 39, 381-385 (2014).
  3. Konrad, M., et al. The acute effect of ingesting a quercetin-based supplement on exercise-induced inflammation and immune changes in runners. Int J Sport Nutr Exerc Metab. 21, 338-346 (2011).
  4. Nieman, D. C., et al. Immune and inflammation responses to a 3-day period of intensified running versus cycling. Brain Behav Immun. 39, 180-185 (2014).
  5. Nieman, D. C., et al. Carbohydrate supplementation affects blood granulocyte and monocyte trafficking but not function after 2.5 h of running. Am J Clin Nutr. 66, 153-159 (1997).
  6. Tidball, J. G. Inflammatory cell response to acute muscle injury. Med Sci Sports Exerc. 27, 1022-1032 (1995).
  7. McFarlin, B. K., Williams, R. R., Venable, A. S., Dwyer, K. C., Haviland, D. L. Image-based cytometry reveals three distinct subsets of activated granulocytes based on phagocytosis and oxidative burst. Cytometry A. 83, 745-751 (2013).
  8. Liao, Y., Liu, P., Guo, F., Zhang, Z. Y., Zhang, Z. Oxidative burst of circulating neutrophils following traumatic brain injury in human. PLoS One. 8, e68963(2013).
  9. McFarlin, B. K., Venable, A. S., Prado, E. A., Henning, A. L., Williams, R. R. Image-based flow cytometry technique to evaluate changes in granulocyte function in vitro. J Vis Exp. , (2014).
  10. Nieman, D. C., et al. Immune response to obesity and moderate weight loss. Int J Obes Relat Metab Disord. 20, 353-360 (1996).
  11. Nieman, D. C., et al. Immune function in female elite rowers and non-athletes. Br J Sports Med. 34, 181-187 (2000).
  12. Ichii, H., et al. Iron sucrose impairs phagocytic function and promotes apoptosis in polymorphonuclear leukocytes. Am J Nephrol. 36, 50-57 (2012).
  13. Gomes, A., Fernandes, E., Lima, J. L. Fluorescence probes used for detection of reactive oxygen species. J Biochem Biophys Methods. 65, 45-80 (2005).
  14. Gruger, T., et al. Negative impact of linezolid on human neutrophil functions in vitro. Chemotherapy. 58, 206-211 (2012).
  15. Dementhon, K., El-Kirat-Chatel, S., Noel, T. Development of an in vitro model for the multi-parametric quantification of the cellular interactions between Candida yeasts and phagocytes. PLoS One. 7, e32621(2012).

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测量人血液中粒细胞和单核细胞的吞噬作用及氧化爆发活性
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