基于RNA干扰的热休克蛋白27在角膜上皮伤口愈合过程中功能的研究

摘要

本文介绍了一种利用热休克蛋白27（HSP27）特异性小干扰RNA评估HSP27在角膜上皮伤口愈合过程中功能的实验方案。RNA干扰是研究多种细胞类型中蛋白质功能时，有效敲低基因表达的最佳方法。

摘要

小干扰RNA（siRNA）是RNA干扰技术中最常用的方法之一，可用于短期沉默蛋白质编码基因。siRNA是一种人工合成的RNA双链，可特异性靶向mRNA转录本并诱导其降解，已被广泛用于揭示多种细胞过程中的新信号通路。目前关于磷酸化热休克蛋白27（HSP27）在角膜上皮损伤修复中作用的研究报道较少。本文中，将培养的人角膜上皮细胞分为两组：一组转染随机对照siRNA，另一组转染HSP27特异性siRNA。随后进行划痕诱导的定向损伤实验、蛋白质印迹分析（Western blotting）以及流式细胞术检测。我们得出结论：HSP27在角膜上皮损伤修复过程中发挥作用，可能涉及上皮细胞的凋亡与迁移。本文提供了样本制备及研究方案的逐步详细说明。

引言

角膜上皮细胞（CECs）会持续脱落进入泪膜，同时由角膜缘和角膜上皮基底层的细胞不断补充。¹ 多种外源性应激因素可诱导角膜内皮细胞（CECs）的凋亡与脱落。² 热休克蛋白（HSPs）具有高度保守性，可根据分子大小分为两个家族。³ 最大的热休克蛋白家族包括 HSP90、HSP70 和 HSP60，较小的家族包括 HSP27。⁴ HSP27的磷酸化在细胞存活中起重要作用，并因其在肌动蛋白重塑中的作用而成为细胞迁移所必需的过程。^5-7 因此，我们尝试检测HSP27磷酸化在CEC迁移和凋亡中的潜在作用 体外 上皮伤口愈合模型

利用小干扰RNA（small interfering RNA, siRNA）的RNA干扰（RNAi）技术在基础生物学和应用生物学领域均引起了广泛关注，因为它有望实现对任意目标基因表达的抑制。⁸ 本研究中，我们采用特异性靶向HSP27的siRNA，评估HSP27在角膜内皮细胞（CEC）伤口愈合及细胞凋亡过程中的作用。传统的细胞基因沉默RNAi方法通常使用合成的RNA双链体，包括两条未经修饰的21个核苷酸长度的寡核苷酸，可退火形成siRNA。本研究所采用的RNAi siRNA是一种简便且高效的细胞转染方法，该试剂适用于多种永生化细胞系。在本研究中，我们展示了相关分析所采用的技术方法，包括划痕诱导的定向伤口愈合实验、蛋白质....

方案

1. 细胞系

1. 在37 °C、5% CO₂ 培养箱中，使用支气管上皮细胞生长培养基（BEGM），将10⁶个端粒酶永生化的人角膜上皮细胞（HCECs）接种于6孔板中（密度：1039.9 个细胞/mm²），培养至细胞融合度达到95%。

2. 建立上皮划痕伤口后的蛋白质印迹分析

1. 在生物安全柜（II级，A2型）中，用无菌的200 µl移液枪头在汇合培养的人角膜上皮细胞（HCEC）培养板孔表面划线，每皿划四次，并将HCEC分别在37 °C、5% CO₂的培养箱中孵育1、5、10、30、60和120分钟。
2. 根据角膜上皮损伤后的不同孵育时间，使用一个6孔板处理六个不同的样本。
3. 用1× PBS清洗受损的HCEC单层细胞三次，然后向每个孔中加入2.0 ml BEGM培养基。
4. 每孔加入2 ml 0.25%胰蛋白酶-乙二胺四乙酸（EDTA）消化5分钟，将细胞悬液转移至15 ml离心管中，在900 × g下离心5分钟，并用1 ml移液枪吸除胰蛋白酶-EDTA溶液。
5. 用1 ml 1× PBS重悬HCEC，并将其转移至1.5 ml离心管中。
6. 在10,000 × g下离心15秒，用1 ml移液枪吸除1× PBS。
7. 将HCEC重悬于100 µl....

结果

与未划痕损伤的HCECs相比，划痕损伤后5、10和30分钟时磷酸化HSP27的表达显著增加¹³。Western印迹分析显示，在转染HSP27特异性siRNA的HCECs中，磷酸化HSP27和磷酸化Akt的表达均显著降低，而Bax的表达则显著升高（图1A-E）。与转染对照siRNA的细胞相比，转染10 nM和50 nM HSP27特异性siRNA的细胞中磷酸化HSP27的表达分别减少了30%和40%，但对照组中磷酸化HSP27的表达未见降低（图1A-B）。此外，转染10 nM和50 nM HSP27特异性siRNA的细胞中非磷酸化HSP27的表达分别减少了20%和30%，而对照组中非磷酸化HSP27的表达未见减少（图1A和C）。

划痕诱导的定向损伤实验表明，在损伤后24小时，转染了特异性针对HSP2.......

讨论

在本研究中，我们利用角膜上皮损伤模型评估了HSP27的潜在作用 体外 方法。关键步骤包括使用siRNA转染以敲低HSP27，从而观察HSP27在应激细胞中的功能。值得注意的是，这些实验揭示了HSP27在角膜上皮损伤修复过程中对上皮细胞迁移和凋亡的作用。与以往研究不同¹⁰ 使用针对大鼠HSP27特异性siRNA转染血管平滑肌细胞的方法，我们采用siRNA转染技术对人角膜内皮细胞（CECs）进行基因表达修饰，有效敲低HSP27特异性基因表达，以研究HSP27的功能。尽管我们在靶序列、细胞密度、终末siRNA浓度及孵育时间等方面存在差异，但仍严格遵循制造商推荐的实验方案。在替代方法方面，可使用HSP27基因敲除小鼠模型，以验证HSP27磷酸化是否参与上皮细胞迁移和细胞凋亡过程。然而，在小鼠模型中监测HSP27磷酸化变化较为困难，因其磷酸化仅在上皮损伤修复的极短时间内发生。

本研究存在若干局限性。首先， 体外 我们培养人角膜内皮细胞（CECs）的环境显然不同于 体内 人类角膜内皮细胞生存环境的影响。其次，本研究中使.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
生物安全柜	CHC LAB Co.Ltd,  大田，大韩民国	CHC-777A2-06	II级，A2型
Stealth RNAi™ siRNA	Thermo Fisher Scientific, Inc.，马萨诸塞州沃尔瑟姆		RNAi siRNA；随机对照siRNA和HSP27特异性siRNA
BEGMTM	Lonza, Inc.，马里兰州沃克维尔	CC-3171, CC4175	支气管上皮细胞生长培养基
蛋白酶抑制剂	Sigma-Aldrich, Inc.，密苏里州圣路易斯	P8340 ,P7626	1 μM Pepstatin A，1 μM Leupeptin，0.1 μM Aprotinin
Bradford蛋白测定	Bio-Rad Laboratories，加利福尼亚州赫克力士	#500-0001	Bradford蛋白测定
硝酸纤维素滤膜	Amersham，英国小查尔方特	RPN3032D	Western印迹膜
非磷酸化HSP27	Abcam Inc.，马萨诸塞州剑桥	ab12351	1:1,000稀释（总HSP27）
磷酸化HSP27（Ser85）	Abcam Inc.，马萨诸塞州剑桥	ab5594	1:1,000稀释，HSP27在Ser85位点发生磷酸化
Lipofectamine® RNAiMAX转染试剂	Invitrogen，加利福尼亚州卡尔斯巴德	13-778-075	转染试剂
磷酸化Akt（Ser473）	Cell Signaling Technology，马萨诸塞州丹弗斯	No. 4060	1:1,000稀释，Akt在Ser473位点发生磷酸化（细胞存活标志物）
非磷酸化Akt	Cell Signaling Technology，马萨诸塞州丹弗斯	No. 4061	1:1,000稀释（总Akt）
Bcl-2相关X蛋白	Cell Signaling Technology，马萨诸塞州丹弗斯	No. 4062	1:1,000（抗凋亡蛋白标志物）
GAPDH	Santa Cruz Biotechnology，加利福尼亚州圣克鲁兹	No. 4063	1:1,000上样对照标志物（看家基因）
辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔抗体	Thermo Fisher Scientific, Inc.，马萨诸塞州沃尔瑟姆	NCI1460KR	1:10,000稀释
OPTI-MEM	Invitrogen，加利福尼亚州卡尔斯巴德	31985	用于转染的低血清培养基
图像分析软件	Olympus, Inc.，日本东京	Image-Pro Plus 5.0
脱脂奶粉	Carl Roth GmbH + Co. KG，德国卡尔斯鲁厄	T145.2
Tris	Amresco LCC, Inc.，俄亥俄州索伦	No-0497
氯化钠	Amresco LCC, Inc.，俄亥俄州索伦	No-0241
六孔培养板	Thermo Fisher Scientific, Inc.，马萨诸塞州沃尔瑟姆	140675	每孔直径35.00 mm
24孔培养皿	Thermo Fisher Scientific, Inc.，马萨诸塞州沃尔瑟姆	142475
轨道摇床	N-Bioteck, Inc.，韩国首尔	NB1015
牛血清白蛋白	Santa Cruz Biotechnology，加利福尼亚州圣克鲁兹	sc-2323
BDFACSCantoTM II	BD Biosciences，新泽西州富兰克林湖		流式细胞术
X射线胶片	Kodak，纽约州罗切斯特		带绿色400荧光屏的医用X射线暗盒
Western印迹发光试剂（luminol）	Santa Cruz Biotechnology，加利福尼亚州圣克鲁兹	sc-2048
FITC Annexin V细胞凋亡检测试剂盒I	BD Biosciences，新泽西州富兰克林湖	556547