方法文章

角膜上皮伤口愈合过程中的热休克蛋白27的功能为基础的RNA干扰研究

DOI：

10.3791/54280

⸱

2016年9月27日

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Ophthalmology, Saevit Eye Hospital, 2Department of Ophthalmology, University of Ulsan College of Medicine, Asan Medical Center

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

在此，我们提出了一种使用热休克蛋白 27 （HSP27） 特异性小干扰 RNA 来评估 HSP27 在角膜上皮伤口愈合过程中的功能的方案。RNA 干扰是有效敲低基因表达以研究各种细胞类型中蛋白质功能的最佳方法。

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

小干扰 RNA （siRNA） 是用于短期沉默蛋白质编码基因的最广泛使用的 RNA 干扰方法之一。siRNA 是一种合成的 RNA 双链体，用于特异性靶向 mRNA 转录本以诱导其降解，它已被用于识别各种细胞过程中的新途径。关于磷酸化热休克蛋白 27 （HSP27） 在角膜上皮伤口愈合中的作用的报道很少。在此，将培养的人角膜上皮细胞分为加扰对照 siRNA 转染组和 HSP27 特异性 siRNA 转染组。然后进行划痕诱导的定向损伤测定、蛋白质印迹和流式细胞术。我们得出结论，HSP27 在角膜上皮伤口愈合中发挥作用，这可能涉及上皮细胞凋亡和迁移。这里提供了样品制备和研究方案的分步描述。

引言

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

角膜上皮细胞（CEC上）不断脱落到泪膜，而他们同时由角膜缘和角膜上皮基底层细胞所替代。1各种外在压力能促使中欧国家的凋亡和脱屑。2热休克蛋白（HSP）是高度保守的，并且可以根据分子大小被分为两个家族。3最大HSP家族包括HSP90，HSP70和HSP60，而较小的家族包括HSP27 4 HSP27的磷酸化是已知在细胞存活中起重要作用和所需的细胞迁移，因为这种蛋白在肌动蛋白重塑的作用。5-7。因此，我们试图测试上皮伤口愈合的体外模型HSP27磷酸化在CEC迁移和凋亡的潜在作用。

RNA干扰或者使用小或短干扰RNA（RNAi）技术（siRNA）的有GE在基础和应用生物学nerated兴趣，因为它可能允许击倒任何感兴趣的基因的表达。8在此，我们使用的特定HSP27-siRNA转以评估HSP27的给CEC伤口愈合和细胞凋亡的贡献。传统的RNAi方法在细胞中的基因敲除使用合成的RNA双链体，包括可组装到创建的siRNAs 2未修饰21聚体寡核苷酸。所述RNAi的siRNA，我们在此本研究中使用的是转染细胞的简单高效的方法，以及该试剂可与各种永生化细胞系。在此研究中，我们证明用于该分析的方法，包括一个刮诱导定向伤口测定法，western印迹，siRNA转染测定法，免疫荧光测定法，和流式细胞术。

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方案

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1.细胞系

  1. 培养10 6端粒酶永生化人角膜上皮在一个6孔板的细胞（HCECs）:在37℃培养箱中使用支气管上皮细胞生长培养基（BEGM）于5％CO 2气氛（密度1039.9细胞/毫米2），直到他们达到95％汇合。

2. Western印迹分析创建上皮擦伤伤口后，

  1. 横跨汇合培养HCECs的阱的表面上的条纹无菌200μl的枪头每个培养皿四次在生物安全柜（II级，A2型）和在37℃培养箱用5％ 的 CO 2气氛中分别孵育HCECs 1，5，10，30，60，和120分钟。
  2. 根据角膜上皮创伤后的孵育时间用一个6孔板为六个不同的样品。
  3. 洗负伤HCEC单层三次用1×PBS，然后加入2.0毫升的BEGM到每个孔中。
  4. 分离使用2 HCECs毫升0.25％胰蛋白酶 - 乙二胺四乙酸（EDTA），每孔5分钟，离心，在900×g离心在一个15毫升管5分钟，并吸出胰蛋白酶-EDTA使用1毫升吸移管。
  5. 暂停HCECs用1ml 1×PBS中，并将它们传送到1.5ml管中。
  6. 以10,000×g离心15秒离心机HCECs和吸出1×PBS中使用1毫升吸管。
  7. 悬浮HCECs在100μl冰冷的裂解缓冲液（10mM的Tris，10 mM氯化钠，2mM EDTA的，25毫氟化钠，2毫的Na 3 VO 4，1mM的苯甲基磺酰氟[PMSF]，蛋白酶抑制剂[1μM的胃酶抑素A， 1μM的亮肽素，和0.1μM的抑肽酶]和0.5％的Triton X-100 [pH为7]），并将它们混合均匀。
  8. 孵育细胞30分钟，在冰上以诱导细胞裂解。
  9. 离心裂解物在10,000×g离心15分钟，4℃，然后上清液转移至新的1.5毫升管（90微升等份），并将它们存储在-80℃。
  10. 确定使用Bradford PR细胞裂解物的总蛋白浓度otein检测。9
  11. 负载30微克总细胞蛋白质成10％或12％丙烯酰胺凝胶进行十二烷基硫酸钠 - 聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE），然后电泳转移分离蛋白带向硝酸纤维素滤膜用200毫安的电流1小时，在4℃ C到免疫印迹试验使用。
  12. 块硝酸纤维素滤膜，用5％脱脂在Tris缓冲盐水乳用吐温20（TBST）1小时后，添加初级兔多克隆抗体对非磷酸化的HSP27（1:1000稀释）或抗磷酸HSP27初级兔多克隆抗体（1 :1,000稀释度），在5％牛血清白蛋白（BSA），并在4℃在摇床上过夜孵育该膜。
  13. 用TBST洗涤后5％BSA的10分钟3次:检测用辣根过氧化物酶缀合的山羊抗 - 兔抗体免疫反应条带（10,000稀释1）。
  14. 在免疫印迹鲁米诺试剂孵化膜（6-7米升每10cm×5厘米膜），在室温下1分钟。
  15. 移除试剂溶液的膜，除去多余的液体，具有吸收巾，并将其放置在一个塑料片保护。
  16. 在黑暗的房间提供一个安全的工作灯，将覆盖膜在胶卷暗盒与蛋白质的一面朝上。
  17. 放置在膜顶部X射线胶片和暴露1分钟。

3. siRNA转染分析10

  1. 在5×10 5细胞培养HCECs /孔在37℃孵化用BEGM直到他们达到95％汇合于5％CO 2气氛中的6孔板中。
  2. 稀释转染试剂（2.5或7.5微升）与转（稀释倍数为41或14.3）100微升减少血清中和溶解HSP27特异性的，并在100微升炒对照siRNA降低血清中创建的10或50纳米HSP27特异性和炒对照siRNA。
  3. 混合100μ;用100μl稀释转染试剂升siRNA溶液（1:1的比例），并孵育混合物在室温下15分钟。
  4. 所述siRNA脂质复合物添加到细胞中。然后经过4小时改变介质在37℃下完成BEGM孵育细胞2天。
  5. 通过Western印迹分析转染细胞从4.1节所述4.7。

4. Western blot检测用于siRNA转染细胞11

  1. 提取HSP27特异性和使用100μl的冰冷的裂解缓冲液（10mM的Tris，10 mM氯化钠，2mM的乙二胺四乙酸（EDTA），25mM的氟化钠，2毫的Na 3 VO加扰对照siRNA转染HCECs在生物安全柜4，1mM的苯甲基磺酰氟（PMSF），蛋白酶抑制剂，和0.5％的Triton X-100，pH 7）中。
  2. 孵育细胞30分钟，在冰上以诱导细胞裂解。
  3. 以10,000 xg离心沉淀裂解物15分钟，然后上清转移至新的1.5mL桶ES（90微升等份），并将它们存储在-80℃。
  4. 确定使用Bradford蛋白测定的细胞裂解物的蛋白浓度。9
  5. 与在10％或12％丙烯酰胺凝胶等量总细胞蛋白的负荷样品，若使凝胶进行SDS-PAGE，并电泳以200毫安的电流，在4℃下传送所分离的蛋白带向硝酸纤维素滤膜1小时至在免疫印迹试验使用。
  6. 块硝酸纤维素滤膜，用5％脱脂在Tris缓冲盐水乳用吐温20（TBST）1小时后，添加抗磷酸和未磷酸化HSP27初级抗体（1:1000稀释度），磷酸化Akt（1:1,000稀释度），非磷酸化的Akt（1:1000稀释，用作细胞存活标记物），Bcl-2的相关X蛋白（1:1000稀释，用作促凋亡蛋白），和甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH; 1 1:200稀释，用作上样对照）的5％牛血清白蛋白（BSA），并过夜孵育所述膜于4℃在振荡器上。
  7. 检测用辣根过氧化物酶缀合的山羊抗 - 兔抗体免疫反应条带（1:10,000稀释），在5％的BSA洗涤后用TBST 3次，每次10分钟洗涤。
  8. 在室温下1分钟孵育的印迹鲁米诺试剂膜（6-7毫升每10cm×5厘米膜）。
  9. 移除试剂溶液的膜，除去多余的液体，具有吸收巾，并将其放置在一个塑料片保护。
  10. 在黑暗的房间提供一个安全的工作灯，将覆盖膜与蛋白质面朝上胶片盒。
  11. 放置在膜的顶部X射线胶片和暴露1分钟。

5.划痕引起的定向伤人分析评估细胞迁移12

  1. 在生物安全柜，通过在表面上拖动的汇合培养物的孔中的一个无菌枪头使伤口HSP27特异性siRNA转染或炒对照siRNA转染HCECs。
  2. 伤人后立即，洗细胞两次用1×磷酸盐缓冲盐水（PBS），并保持它们在BEGM培养在37℃培养箱用5％ 的 CO 2气氛中24小时伤人后。
  3. 照片使用正置显微镜放大100倍的图像HCEC伤后24小时，进行使用过滤背景压扁 在图像分析软件命令。
  4. 使用选择测量命令，确定利息（AOI）与同尺寸的多边形形状，可以从一端垂直覆盖，结束初期伤口的区域，并在每个样品的受伤面积确定三个不同的AOI。
  5. 自动计数使用计算/尺寸测量菜单选项在各个领域的手机号码。

凋亡6.流式细胞仪分析

  1. 文化HSP27特异性siRNA转染和CONTROL S的iRNA转染的含有各10nM的siRNA的HCECs在/孔在6孔板5×10 5个细胞的浓度，直到细胞达到在37℃培养箱中，在BEGM一个5％CO 2气氛中95％汇合。
  2. 使用1毫升吸管分离使用每孔2mL 0.25％胰蛋白酶-EDTA HCECs 5分钟，离心，在900×g离心在一个15毫升管5分钟，并吸出胰蛋白酶-EDTA。
  3. 用冷PBS洗涤细胞两次，然后以10 6个细胞/ ml的浓度重悬在1×细胞结合缓冲液（0.1M HEPES /氢氧化钠[pH为7.4]，1.4 M氯化钠，和25mM 氯化钙 ）。
  4. 转移100μl的细胞悬浮液（1×10 5个细胞）到5ml的培养管中。
  5. 添加5μl的异硫氰酸荧光素缀合的膜联蛋白V和5μl碘化丙啶。
  6. 轻轻涡旋细胞，并培育他们在黑暗中室温下15分钟。
  7. 通过流动Ç加入200μl1X结合缓冲液中向每个管和分析细胞1小时内ytometer。

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结果

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在5，10磷酸化HSP27的表达显著上升，划痕后30分钟，未受伤的HCECs 13伤人比较。免疫印迹分析表明，磷酸HSP27和磷酸化Akt的表达均被显著降低，而Bax的表达在特定HSP27-siRNA转染HCECs（ 图1A-E）中的显著增加。减少了30％，在10nM的40％和HSP27特异性为50nM的siRNA转染的细胞，分别与对照siRNA转染的细胞，但磷酸化HSP27表达相比没有减少（ 图1A-B中的磷酸化的HSP27表达）。此外，降低了非磷酸HSP27表达了20％和30％中为10nM和50nM HSP27特异性siRNA转染的细胞，分别，但非磷酸HSP27表达没有减少（ 图1A和C的</ STRONG>）。

刮擦诱导定向伤人分析表明，在伤人，...

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讨论

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在本研究中，我们使用 体外 方法评估了 HSP27 在角膜上皮损伤中的潜在作用。关键步骤包括 siRNA 转染以敲低 HSP27，以观察 HSP27 在受胁迫细胞中的功能。值得注意的是，这些实验揭示了 HSP27 在角膜上皮伤口愈合过程中上皮细胞迁移和细胞灭亡中的作用。与之前使用大鼠HSP27特异性siRNA转染血管平滑肌细胞的研究10 不同，我们使用siRNA转染技术来修饰人CEC中的基因表达，以有效敲低HSP27特异性基因表达并研究HSP27功能。尽管我们使用的靶序列以及细胞密度、最终 siRNA 浓度和孵育时间存在差异，但明确遵循了制造商推荐的方案。在替代方法方面，HSP27敲除小鼠可用于显示HSP27磷酸化是否涉及上皮迁移和细胞凋亡。然而，在小鼠模型中很难监测HSP27磷酸化的变化，因为它的磷酸化发生在上皮伤口愈合过程中的很短的时间内。

本研究有几个局限性。首先，我们培养人 CEC 的 体外 环境肯定与人 CEC 的 体内 环境不同，尤其是在细胞存活方面。其次，本研究中使用的 siRNA 对 HSP...

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披露

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

笔者在本研究中提及的任何材料或方法没有财务或专有权益。

致谢

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

这项研究是由医学，韩国首尔，蔚山大学学院的学生研究资助（13-14），并从峨山生命科学研究所，韩国首尔赠款（2014-464）的支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
生物安全柜CHC LAB Co.Ltd， 大田市 大韩民国 CHC-777A2-06II 类，A2 型 
Stealth RNAi™ siRNAThermo Fisher Scientific， Inc.， Waltham， MARNAi siRNA;加扰对照 siRNA 和 HSP27 特异性 siRNA
BEGMTMLonza， Inc.， Walkersville， MDCC-3171， CC4175支气管上皮生长培养基 
蛋白酶抑制剂 Sigma-Aldrich， Inc.， 圣路易斯， MOP8340 ，P76261 μM 胃蛋白酶抑制剂 A， 1 μM 亮肽素，0.1 μM 抑肽酶
Bradford 蛋白测定 Bio-Rad Laboratories，Hercules，CA#500-0001Bradford 蛋白检测 
硝酸纤维素过滤器 Amersham， Little Chalfont， UKRPN3032DWestern 印迹膜
非磷酸化 HSP27 Abcam Inc.，马萨诸塞州剑桥市ab123511：1,000 稀释度（总 HSP27）
磷酸化 HSP27 （Ser85）Abcam Inc.，马萨诸塞州剑桥ab55941：1,000 稀释度 HSP27 在 Ser85 处被磷酸化
Lipofectamine® RNAiMAX 试剂 Invitrogen，加利福尼亚州卡尔斯巴德13-778-075转染试剂
磷酸化 Akt （Ser473）Cell Signaling Technology，马萨诸塞州丹佛斯No. 40601：1,000 稀释度 Akt 在 Ser473（细胞存活标志物）处被磷酸化
Akt 非磷酸化 Akt Cell Signaling Technology，丹佛斯，MANo. 40611：1,000 稀释度（总 Akt）
Bcl-2 相关 X 蛋白 Cell Signaling Technology，丹佛斯，马萨诸塞州No. 40621：1,000（抗凋亡蛋白标记物）
GAPDHSanta Cruz Biotechnology，圣克鲁斯，CANo. 40631：1,000 加载对照标记物（管家基因）
辣根过氧化物酶偶联的山羊抗兔抗体Thermo Fisher Scientific， Inc.，马萨诸塞州沃尔瑟姆NCI1460KR1：10,000 稀释度
OPTI-MEMInvitrogen，卡尔斯巴德，加利福尼亚州31985用于转染的减血清培养基
图像分析软件Olympus， Inc.，日本东京Image-Pro Plus 5.0
脱脂奶粉 Carl Roth GmbH + Co. KG， Karlstruhe， 德国T145.2
Tris Amresco LCC， Inc. Solon， OHNo-0497
氯化钠 Amresco LCC， Inc. Solon， OHNo-0241
六孔培养板Thermo Fisher Scientific， Inc.， Waltham， MA14067535.00 mm 直径/孔
24 孔培养皿Thermo Fisher Scientific， Inc.， Waltham， MA142475
轨道摇床N-Bioteck， Inc.， Seoul， South KoreaNB1015
牛血清白蛋白Santa Cruz Biotechnology， 圣克鲁斯， CAsc-2323 
BDFACSCantoTM IIBD Biosciences，新泽西州流式细胞术
X 射线胶片柯达，罗切斯特，纽约医用 X 射线盒，带绿色 400 屏幕 
蛋白质印迹鲁米诺试剂Santa Cruz Biotechnology， Santa Cruz， CAsc-2048 
FITC 膜联蛋白 V 细胞凋亡检测试剂盒 IBD Biosciences，新泽西州富兰克林湖556547
市 富兰克林湖 州

参考文献

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Dua, H. S., Gomes, J. A., Singh, A. Corneal epithelial wound healing. Br. J. Ophthalmol. 78 (5), 401-408 (1994).
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siRNA Bradford SDS PAGE

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