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方法文章

基于RNA干扰的热休克蛋白27在角膜上皮伤口愈合过程中功能的研究

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DOI：

10.3791/54280

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2016年9月27日

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Ophthalmology, Saevit Eye Hospital, 2Department of Ophthalmology, University of Ulsan College of Medicine, Asan Medical Center

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

本文介绍了一种利用热休克蛋白27（HSP27）特异性小干扰RNA评估HSP27在角膜上皮伤口愈合过程中功能的实验方案。RNA干扰是研究多种细胞类型中蛋白质功能时，有效敲低基因表达的最佳方法。

摘要

小干扰RNA（siRNA）是RNA干扰技术中最常用的方法之一，可用于短期沉默蛋白质编码基因。siRNA是一种人工合成的RNA双链，可特异性靶向mRNA转录本并诱导其降解，已被广泛用于揭示多种细胞过程中的新信号通路。目前关于磷酸化热休克蛋白27（HSP27）在角膜上皮损伤修复中作用的研究报道较少。本文中，将培养的人角膜上皮细胞分为两组：一组转染随机对照siRNA，另一组转染HSP27特异性siRNA。随后进行划痕诱导的定向损伤实验、蛋白质印迹分析（Western blotting）以及流式细胞术检测。我们得出结论：HSP27在角膜上皮损伤修复过程中发挥作用，可能涉及上皮细胞的凋亡与迁移。本文提供了样本制备及研究方案的逐步详细说明。

引言

角膜上皮细胞（CECs）会持续脱落进入泪膜，同时由角膜缘和角膜上皮基底层的细胞不断补充。1 多种外源性应激因素可诱导角膜内皮细胞（CECs）的凋亡与脱落。2 热休克蛋白（HSPs）具有高度保守性，可根据分子大小分为两个家族。3 最大的热休克蛋白家族包括 HSP90、HSP70 和 HSP60，较小的家族包括 HSP27。4 HSP27的磷酸化在细胞存活中起重要作用，并因其在肌动蛋白重塑中的作用而成为细胞迁移所必需的过程。5-7 因此，我们尝试检测HSP27磷酸化在CEC迁移和凋亡中的潜在作用 体外 上皮伤口愈合模型

利用小干扰RNA（small interfering RNA, siRNA）的RNA干扰（RNAi）技术在基础生物学和应用生物学领域均引起了广泛关注，因为它有望实现对任意目标基因表达的抑制。8 本研究中，我们采用特异性靶向HSP27的siRNA，评估HSP27在角膜内皮细胞（CEC）伤口愈合及细胞凋亡过程中的作用。传统的细胞基因沉默RNAi方法通常使用合成的RNA双链体，包括两条未经修饰的21个核苷酸长度的寡核苷酸，可退火形成siRNA。本研究所采用的RNAi siRNA是一种简便且高效的细胞转染方法，该试剂适用于多种永生化细胞系。在本研究中，我们展示了相关分析所采用的技术方法，包括划痕诱导的定向伤口愈合实验、蛋白质印迹（western blotting）、siRNA转染实验、免疫荧光染色以及流式细胞术。

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方案

1. 细胞系

  1. 在37 °C、5% CO2 培养箱中，使用支气管上皮细胞生长培养基（BEGM），将106个端粒酶永生化的人角膜上皮细胞（HCECs）接种于6孔板中（密度：1039.9 个细胞/mm2），培养至细胞融合度达到95%。

2. 建立上皮划痕伤口后的蛋白质印迹分析

  1. 在生物安全柜（II级，A2型）中，用无菌的200 µl移液枪头在汇合培养的人角膜上皮细胞（HCEC）培养板孔表面划线，每皿划四次，并将HCEC分别在37 °C、5% CO2的培养箱中孵育1、5、10、30、60和120分钟。
  2. 根据角膜上皮损伤后的不同孵育时间，使用一个6孔板处理六个不同的样本。
  3. 用1× PBS清洗受损的HCEC单层细胞三次，然后向每个孔中加入2.0 ml BEGM培养基。
  4. 每孔加入2 ml 0.25%胰蛋白酶-乙二胺四乙酸（EDTA）消化5分钟，将细胞悬液转移至15 ml离心管中，在900 × g下离心5分钟，并用1 ml移液枪吸除胰蛋白酶-EDTA溶液。
  5. 用1 ml 1× PBS重悬HCEC，并将其转移至1.5 ml离心管中。
  6. 在10,000 × g下离心15秒，用1 ml移液枪吸除1× PBS。
  7. 将HCEC重悬于100 µl预冷的裂解缓冲液中（10 mM Tris，10 mM NaCl，2 mM EDTA，25 mM NaF，2 mM Na3VO4，1 mM苯甲基磺酰氟[PMSF]，蛋白酶抑制剂[1 µM pepstatin A，1 µM亮抑酶肽，0.1 µM抑肽酶]，以及0.5% Triton X-100 [pH 7]），并充分混匀。
  8. 将细胞在冰上孵育30分钟以诱导细胞裂解。
  9. 在4 °C、10,000 × g条件下离心裂解物15分钟，然后将上清液转移至新的1.5 ml离心管中（每份90 µl），并于-80 °C保存。
  10. 使用Bradford蛋白定量法测定细胞裂解物的总蛋白浓度。9
  11. 将30 µg总细胞蛋白上样至10%或12%丙烯酰胺凝胶进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE），随后在4 °C条件下以200 mA电流电泳1小时，将分离的蛋白条带转移至硝酸纤维素膜，用于后续Western blot分析。
  12. 用含5%脱脂奶粉的Tris-缓冲盐水吐温20（TBST）溶液封闭硝酸纤维素膜1小时；然后在含5%牛血清白蛋白（BSA）的溶液中加入针对非磷酸化HSP27的一抗（兔多克隆抗体，1:1,000稀释）或针对磷酸化HSP27的一抗（兔多克隆抗体，1:1,000稀释），在摇床上4 °C孵育过夜。
  13. 用TBST洗涤膜三次，每次10分钟，然后在含5% BSA的溶液中加入辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔二抗（1:10,000稀释），进行免疫反应条带检测。
  14. 将膜在Western blot发光底物（每张10 cm × 5 cm膜使用6–7 ml）中室温孵育1分钟。
  15. 将膜从试剂溶液中取出，用吸水纸吸去多余液体，并放入塑料膜保护袋中。
  16. 在暗室安全灯下，将包被好的膜放入胶片暗盒中，确保蛋白面朝上。
  17. 将X光胶片覆盖于膜上，曝光1分钟。

3. siRNA 转染实验10

  1. 将HCEC细胞以每孔5×105个细胞的密度接种于6孔板中，在37 °C、5% CO2的培养箱中使用BEGM培养基培养，直至细胞融合度达到95%。
  2. 用100 µl低血清培养基稀释转染试剂（2.5或7.5 µl），使稀释倍数为41或14.3；同时将HSP27特异性siRNA和乱序对照siRNA分别溶于100 µl低血清培养基中，配制成终浓度为10或50 nM的HSP27特异性siRNA和乱序对照siRNA溶液。
  3. 取100 µl siRNA溶液与100 µl稀释后的转染试剂按1:1比例混合，室温孵育15分钟。
  4. 将siRNA-脂质复合物加入细胞中，4小时后更换为完全BEGM培养基，并在37 °C继续培养细胞2天。
  5. 按照第4.1至4.7节所述方法，通过蛋白质印迹法分析转染后的细胞。

4. 针对siRNA转染细胞的蛋白质印迹分析11

  1. 在生物安全柜中，使用 100 µl 冰冷裂解缓冲液（10 mM Tris、10 mM NaCl、2 mM 乙二胺四乙酸（EDTA）、25 mM NaF、2 mM Na3VO4、1 mM 苯甲基磺酰氟（PMSF）、蛋白酶抑制剂和 0.5% Triton X-100，pH 7）提取转染了 HSP27 特异性 siRNA 和阴性对照 siRNA 的 HCEC。
  2. 将细胞在冰上孵育 30 分钟以诱导细胞裂解。
  3. 在 10,000 × g 离心 15 分钟后收集裂解物沉淀，将上清液转移至新的 1.5 ml 离心管中（每份 90 µl），并于 -80 °C 保存。
  4. 使用 Bradford 蛋白质测定法测定细胞裂解物的蛋白浓度。9
  5. 将含有等量总细胞蛋白的样品上样至 10% 或 12% 丙烯酰胺凝胶，进行 SDS-PAGE 电泳，并在 4 °C 条件下以 200 mA 电流将分离的蛋白条带电转移至硝酸纤维素膜 1 小时，用于后续 Western 印迹分析。
  6. 用含 5% 脱脂奶粉的吐温-20 三羟甲基氨基甲烷缓冲盐水（TBST）在室温封闭硝酸纤维素膜 1 小时，然后加入针对磷酸化与非磷酸化 HSP27（1:1,000 稀释）、磷酸化 Akt（1:1,000 稀释）、非磷酸化 Akt（1:1,000 稀释，作为细胞存活标志物）、Bcl-2 相关 X 蛋白（1:1,000 稀释，作为促凋亡蛋白）以及甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH；1:200 稀释，作为上样对照）的一抗，溶于 5% 牛血清白蛋白（BSA）中，在 4 °C 摇床上孵育过夜。
  7. 用 TBST 洗涤膜 3 次，每次 10 分钟，随后加入辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔抗体（1:10,000 稀释），溶于 5% BSA 中，检测免疫反应性条带。
  8. 将膜在 Western 印迹发光试剂（每 10 cm × 5 cm 膜使用 6–7 ml）中室温孵育 1 分钟。
  9. 从试剂溶液中取出膜，用吸水纸吸去多余液体，并将其放入塑料保护膜中。
  10. 在暗室安全灯下，将包覆好的膜放入胶片暗盒中，使蛋白面朝上。
  11. 将 X 光胶片置于膜上方，曝光 1 分钟。

5. 划痕诱导的定向损伤检测法评估细胞迁移12

  1. 在生物安全柜中，用无菌移液器吸头在转染了HSP27特异性siRNA或乱序对照siRNA的HCEC融合培养细胞的孔表面划线，制造伤口。
  2. 损伤后立即用1×磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤细胞两次，并将细胞置于37 °C、5% CO₂培养箱中的BEGM培养基中继续培养。2 损伤后在培养箱中孵育24小时。
  3. 使用直立显微镜在划痕后24小时以100倍放大倍数拍摄HCEC图像，并利用滤镜进行背景平整处理 图像分析软件中的命令。
  4. 使用“选择测量”命令，以相同尺寸的多边形定义兴趣区域（AOI），该多边形应能垂直覆盖初始伤口的整个长度，且在每个样本的损伤区域中确定三个不同的兴趣区域（AOI）。
  5. 使用“计数/尺寸测量”菜单选项自动统计每个视野中的细胞数量。

6. 凋亡的流式细胞术分析

  1. 将转染HSP27特异性siRNA和对照siRNA的HCEC细胞（每孔含10 nM siRNA）以5×105个细胞/孔的密度接种于6孔板中，在含5% CO2的37 °C培养箱中用BEGM培养基培养，直至细胞融合度达到95%。
  2. 每孔加入2 ml 0.25%胰蛋白酶-EDTA溶液消化5分钟，将细胞悬液转移至15 ml离心管中，以900 × g离心5分钟，并用1 ml移液器吸除胰蛋白酶-EDTA溶液。
  3. 用预冷的PBS洗涤细胞两次，然后将细胞重悬于1×结合缓冲液（0.1 M HEPES/NaOH [pH 7.4]、1.4 M NaCl和25 mM CaCl2）中，调整细胞浓度为106个细胞/ml。
  4. 取100 µl细胞悬液（含1 × 105个细胞）转移至5 ml培养管中。
  5. 加入5 µl异硫氰酸荧光素标记的Annexin V和5 µl碘化丙啶。
  6. 轻轻涡旋混匀细胞，于室温避光孵育15分钟。
  7. 每管加入200 µl 1×结合缓冲液，并在1小时内使用流式细胞仪进行分析。

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结果

与未划痕损伤的HCECs相比，划痕损伤后5、10和30分钟时磷酸化HSP27的表达显著增加13。Western印迹分析显示，在转染HSP27特异性siRNA的HCECs中，磷酸化HSP27和磷酸化Akt的表达均显著降低，而Bax的表达则显著升高（图1A-E）。与转染对照siRNA的细胞相比，转染10 nM和50 nM HSP27特异性siRNA的细胞中磷酸化HSP27的表达分别减少了30%和40%，但对照组中磷酸化HSP27的表达未见降低（图1A-B）。此外，转染10 nM和50 nM HSP27特异性siRNA的细胞中非磷酸化HSP27的表达分别减少了20%和30%，而对照组中非磷酸化HSP27的表达未见减少（图1A和C）。

划痕诱导的定向损伤实验表明，在损伤后24小时，转染了特异性针对HSP2...

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讨论

在本研究中，我们利用角膜上皮损伤模型评估了HSP27的潜在作用 体外 方法。关键步骤包括使用siRNA转染以敲低HSP27，从而观察HSP27在应激细胞中的功能。值得注意的是，这些实验揭示了HSP27在角膜上皮损伤修复过程中对上皮细胞迁移和凋亡的作用。与以往研究不同10 使用针对大鼠HSP27特异性siRNA转染血管平滑肌细胞的方法，我们采用siRNA转染技术对人角膜内皮细胞（CECs）进行基因表达修饰，有效敲低HSP27特异性基因表达，以研究HSP27的功能。尽管我们在靶序列、细胞密度、终末siRNA浓度及孵育时间等方面存在差异，但仍严格遵循制造商推荐的实验方案。在替代方法方面，可使用HSP27基因敲除小鼠模型，以验证HSP27磷酸化是否参与上皮细胞迁移和细胞凋亡过程。然而，在小鼠模型中监测HSP27磷酸化变化较为困难，因其磷酸化仅在上皮损伤修复的极短时间内发生。

本研究存在若干局限性。首先， 体外 我们培养人角膜内皮细胞（CECs）的环境显然不同于 体内 人类角膜内皮细胞生存环境的影响。其次，本研究中使...

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披露

作者声明在本研究中提到的任何材料或方法均无财务或所有权利益。

致谢

本研究由韩国首尔市韩国蔚山大学医学院学生研究基金（13-14）以及韩国首尔市峨山生命科学研究所基金（2014-464）资助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
生物安全柜CHC LAB Co.Ltd,  大田，大韩民国 CHC-777A2-06II级，A2型 
Stealth RNAi™ siRNAThermo Fisher Scientific, Inc.，马萨诸塞州沃尔瑟姆RNAi siRNA；随机对照siRNA和HSP27特异性siRNA
BEGMTMLonza, Inc.，马里兰州沃克维尔CC-3171, CC4175支气管上皮细胞生长培养基 
蛋白酶抑制剂 Sigma-Aldrich, Inc.，密苏里州圣路易斯P8340 ,P76261 μM Pepstatin A，1 μM Leupeptin，0.1 μM Aprotinin
Bradford蛋白测定 Bio-Rad Laboratories，加利福尼亚州赫克力士#500-0001Bradford蛋白测定 
硝酸纤维素滤膜 Amersham，英国小查尔方特RPN3032DWestern印迹膜
非磷酸化HSP27 Abcam Inc.，马萨诸塞州剑桥ab123511:1,000稀释（总HSP27）
磷酸化HSP27（Ser85）Abcam Inc.，马萨诸塞州剑桥ab55941:1,000稀释，HSP27在Ser85位点发生磷酸化
Lipofectamine® RNAiMAX转染试剂 Invitrogen，加利福尼亚州卡尔斯巴德13-778-075转染试剂
磷酸化Akt（Ser473）Cell Signaling Technology，马萨诸塞州丹弗斯No. 40601:1,000稀释，Akt在Ser473位点发生磷酸化（细胞存活标志物）
非磷酸化Akt Cell Signaling Technology，马萨诸塞州丹弗斯No. 40611:1,000稀释（总Akt）
Bcl-2相关X蛋白 Cell Signaling Technology，马萨诸塞州丹弗斯No. 40621:1,000（抗凋亡蛋白标志物）
GAPDHSanta Cruz Biotechnology，加利福尼亚州圣克鲁兹No. 40631:1,000上样对照标志物（看家基因）
辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔抗体Thermo Fisher Scientific, Inc.，马萨诸塞州沃尔瑟姆NCI1460KR1:10,000稀释
OPTI-MEMInvitrogen，加利福尼亚州卡尔斯巴德31985用于转染的低血清培养基
图像分析软件Olympus, Inc.，日本东京Image-Pro Plus 5.0
脱脂奶粉 Carl Roth GmbH + Co. KG，德国卡尔斯鲁厄T145.2
Tris Amresco LCC, Inc.，俄亥俄州索伦No-0497
氯化钠 Amresco LCC, Inc.，俄亥俄州索伦No-0241
六孔培养板Thermo Fisher Scientific, Inc.，马萨诸塞州沃尔瑟姆140675每孔直径35.00 mm
24孔培养皿Thermo Fisher Scientific, Inc.，马萨诸塞州沃尔瑟姆142475
轨道摇床N-Bioteck, Inc.，韩国首尔NB1015
牛血清白蛋白Santa Cruz Biotechnology，加利福尼亚州圣克鲁兹sc-2323 
BDFACSCantoTM IIBD Biosciences，新泽西州富兰克林湖流式细胞术
X射线胶片Kodak，纽约州罗切斯特带绿色400荧光屏的医用X射线暗盒 
Western印迹发光试剂（luminol）Santa Cruz Biotechnology，加利福尼亚州圣克鲁兹sc-2048 
FITC Annexin V细胞凋亡检测试剂盒IBD Biosciences，新泽西州富兰克林湖556547

参考文献

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