间隙连接通讯:天然产物的生物标志物的功能，以评估毒物和毒素的不利影响，以及健康的益处

摘要

本协议描述，通过间隙连接通道测量细胞间通讯手术刀装载荧光染料转移技术。间隙连接通讯是一个主要的细胞过程，其中组织稳态维持这种细胞信号中断了不良的健康影响。

摘要

这个协议描述，其测量通过间隙连接通道间通讯，这是一个主要间过程，其中组织稳态保持手术刀放入荧光染料转移（SL-DT）技术。由毒物，毒素，药物等间隙连接通讯（GJIC）的中断已被链接到大量的不良健康影响。许多基于遗传人类疾病都与在间隙连接的基因突变。在SL-DT技术是GJIC在一个人口众多细胞的同时评估一个简单的功能测定。该测定通过细胞群体简要扰动细胞膜用手术刀刀片涉及预加载的细胞用荧光染料。然后荧光染料允许间隙连接通道横穿通过对相邻小区一段指定的时间。该试验然后通过加入福尔马林至细胞终止。在萤光灯的传播通过细胞群体rescent染料评估用落射荧光显微镜和图像被任何数量的形态软件包可用，包括在公共领域发现自由软件包进行分析。此法也适用于使用组织切片从处理过的动物各器官的体内研究。总体而言，对SL-DT测定可以起到广泛的体外药理学和毒理学的需要，并且可以潜在地适于使用自动荧光显微镜成像和分析的高通量设置系统在较短的时间以阐明更多的样品。

引言

该方法的总的目标是提供一种简单的，全面和相对廉价的技术来评估化合物的潜在毒性。这是一种体外方法，可以在多种细胞系中使用。配备有落射荧光显微镜标准细胞生物学实验室可以通过此法进行研究。

我们的细胞功能的基本知识已经高度依赖于在体外生物测定，并已成为医药品，环境污染物，以及食品生污染物的毒理学评估的必要成分。不幸的是，没有一个统一的体外生物测定系统，能够全面地满足所有毒理学评估的要求。许多体外测定的设计和优化，以评估以及评估一个特定的生物化学或分子端点。这些经常以高通量设置以反映一个扰动组合特定信号转导途径，如雌激素受体信号^1。这一策略相当成功，但参与基因表达的信号转导通路的数量繁多，因此选择一个特定的信号通路，以评估相当复杂的任务。高通量的协议，目前正在开发的，并用于同时测量许多信号传导途径，这一直是一个方法克服一些单个分析的局限性。然而，并非所有的信号通路已经成功掺入更全面的办法，再加上新的信号传导途径正在不断地被发现，进一步复杂化这个评估过程。使用的体外方法广泛数字，特别是高通量系统中，综合毒理学评估也非常昂贵，并且不利于大多数单研究者领导的研究项目。

GJIC是一个过程TIG通过在电压变化，钙离子浓度，pH值，氧化还原平衡，由主要的细胞内信号转导途径和相互作用与膜和细胞骨架蛋白^2,3-调节htly控制。因此，GJIC的抑制可以反映不同类型的细胞应激，不同的细胞功能的破坏，或不同的信号转导途径的扰动。克服利用有限的信号转导的生物测定的另一种方法是采取的生物现象优点，即许多，如果不是大多数，信号转导途径被进一步通过合作的细胞间的信号系统，通过间隙连接通道^4-8调制。虽然间信号系统也很多，根据多路径控制，通过间隙连接通道间信号是最终被打开的通道的功能，部分封闭或完全封闭。这提供了可以使用各种可容易地测定的端点在体外生物分析系统^7。考虑到组织的稳态设定点，需要畅通的渠道，确定化合物对间隙连接通讯的影响（GJIC）在确定化合物^4,8的潜在的毒性作用更全面的方法。在本质上，在协调多个信号转导事件控制基因表达的核心作用这一关键的生物现象，使得毒性作用广泛评估。因此，评估GJIC生物测定是一个很好的起点，以评估化合物的潜在毒性。

用于评估GJIC最广泛的技术是基于预加载的细胞用荧光探针，然后从所装载的细胞或细胞相邻小区监控染料的迁移。技术预加载染料都涉及显微注射^9，刮去探头¹¹装载¹⁰和甲基酯。手术刀装载荧光染料转移（SL-DT）的方法是刮负载的修改-染料埃尔Fouly ¹⁰开发的传输试验。而不是更微创刮，本报告的手术刀加载方法包括通过细胞减少侵入破坏（ 图1）单层圆刀片手术刀的温柔卷。这种技术的优点是细胞而非显微注射法的单细胞的群体的毒理学评估。此外，该测定的简单性允许在短时间内快速检测多块板而使用显微注射技术以及使用荧光探针的甲酯技术方法都是显著更费时，并且需要相当高的技术水平。

虽然没有单一的方法来满足研究细胞间隙连接通讯的所有需求;在SL-DT分析是一种简单的，相当便宜，多才多艺的分析，可以满足多种需求的各种化合物毒性的初步评估。主要优点包括:简单，设备或技能没有特殊需要所需要的其他方法，如微注射，荧光漂白恢复（FRAP）分析和分子荧光探针测定法，GJIC的在一个大一个快速和同时评估的局部激活后细胞的数目，有利于高通量设置用自动化荧光显微镜成像和分析，以及其适应性对于体内研究。

方案

这项研究的方案经动物护理和日本健康科学，这就是体内都做过实验，全国学院利用委员会，以确保将大鼠人道和对苦难的缓解方面的治疗。

1. SL-DT生物测定

1. 种子3×10 ^5个 WB-F344大鼠肝脏上皮细胞到35 mm直径培养含有鹰板改性介质加5％牛胎儿血清，并培养所述细胞在培养箱中在37ºC，100％相对湿度（RH），5％ _的 CO _2。
2. 培养细胞，直到它们达到100％汇合（通常为2天）和如下所述进行细胞的期望实验性治疗。
   1. 进行剂量响应实验
      1. 添加10微升和20微升菲的在100％乙腈和4微升，6微升2mM的储备液和8微升phenan的20mM储备溶液的士林在100％乙腈到含2ml生长培养基为原液每个添加体积细胞的三个板。
      2. 加入4微升，6微升，8微升，10微升，和20μl乙腈的100％的溶液，以含2ml生长培养基为乙腈溶液各自加入量作为车辆控制单元的三个板的。
      3. 孵育15分钟，板在设定为37℃，100％相对湿度和5％的CO ₂的培养箱。
      4. 继续执行步骤1.3。
   2. 开展时间响应实验
      1. 加7微升菲的在100％乙腈的20mM储备溶液到含2ml生长培养基的每个时间点（ 即 0，1，2，3，4，5，10分钟）细胞的三个板。
      2. 加7微升100％乙腈到含2ml生长培养基的每个时间点，作为车辆控制单元的三个板。
      3. 孵育每个指定时间p内板oint在培养箱中在37℃，100％相对湿度和5％ _的 CO _2。
      4. 继续执行步骤1.3。
   3. 开展时间恢复实验
      1. 加7微升菲的在100％乙腈的20mM储备溶液到含2ml生长培养基的15分钟的细胞的三个板。
      2. 加7微升100％乙腈到含2ml生长培养基的15分钟，作为车辆控制单元的三个板。
      3. 倒出含有任菲或乙腈中，每个冲洗3次用3ml磷酸盐缓冲盐水（PBS）中。
      4. 2毫升新鲜生长培养基添加到每个板并孵育所需的恢复时间（ 即，25，35，45，60，90，120，150，180，240，360分钟），在37℃的恒温箱中，100 ％RH下和5％ _的 CO _2。
      5. 继续执行步骤1.3。
   4. 传导机制实验
      1. 加的信号传导的抑制剂， 即
      2. 添加5μl的100％乙腈到含2ml生长培养基的15分钟，作为车辆控制单元的三个板。
      3. 加7微升菲的在100％乙腈的20mM储备溶液到含2ml生长培养基加上D609的细胞的三个板另外15分钟。
      4. 加7微升100％乙腈到含2ml生长培养基加上100％乙腈的细胞的三个板另外15分钟，以作为该车辆的控制。
      5. 继续执行步骤1.3。
3. 由任一轻轻倾倒出培养基或通过真空吸附丢弃培养基。
   注:适当处置含有危险废物的培养基。
4. 冲洗细胞三次，每次用3ml PBS中，要么澄清或抽吸betweeñ冲洗。
5. 吸管1毫升1毫克/毫升萤光黄染料溶解在PBS（LY）到每个单元板。
6. 通过细胞群体中的板的三个不同区域轻轻滚动＃20外科钢叶片具有圆形边缘预加载染料进入细胞。
   1. 通过将垂直的手术刀（90°角），并从培养板的边缘5毫米开始，然后转离这个垂直的角度手术刀至约15°（ 见图1）的角度。
      注:这是通过捏拇指和食指之间的手术刀来实现的。利用重力让手术刀轻轻地从90°到15°的位置（如圆形刀片只需鼠标滑过细胞）。这项议案将留下一个视觉明显的压痕线。
7. 孵育所述细胞在室温下的LY溶液3分钟。
8. 倒出或者吸出LY，并用3毫升的PBS以除去所有extrace冲洗三次llular染料消除外背景荧光。
9. 加入0.5毫升10％磷酸盐缓冲的福尔马林溶液来固定细胞。
   注意:在福尔马林固定后，空气干燥的细胞并在黑暗中保存长达两年的LY染料的最小光漂白。当需要时，补充水分，用10％的福尔马林溶液来可视化的荧光染料前。
10. 查看使用在200X的放大倍数配备了分色立方体的五百三十六分之四百二十八激发/发射峰的落射荧光显微镜的定格。对齐所有板，使压痕线平行视力水平场。
    注:FITC二向色立方体效果很好。
    1. 与CCD相机和支持软件捕获图像。
       1. 打开CCD摄像机的配套软件，并使用设置自动曝光。使用"捕获"按钮，以数字方式获取图像。将图像保存为.TIF使用"保存"按钮的文件。

    2.适应的SL-DT检测到肝组织

    1. 从5周龄，用雄性菲舍尔344大鼠解剖剪刀取出大约从肝左叶一2×2cm的片，将其放在一个塑料板掂量盖上湿纱布^12。
    2. 吸管0.5毫升含有1mg的PBS溶液/ ml的各荧光黄和罗丹明 - 葡聚糖（RD）上的肝切片的在塑料表面称量板。
       注意:RD为不能穿过的间隙连接通道，将标记加载的细胞的染料。
    3. 使三至五个切口肝脏切片具有用锋利的刀片在称重盘的染料溶液的表面上长大约1cm，然后添加足以填充切口附加染料。
    4. 孵育所述组织在室温下在塑料称量板3分钟。
    5. 用5毫升的PBS冲洗三次。
    6. 修复组织奥雅纳rnight在黑暗中在室温下在50ml锥形离心管30含10％磷酸盐缓冲的福尔马林。
    7. 次日，洗涤片，用水，修剪组织切口周围用解剖剪成1×1×0.5 cm ³的条带，然后使用标准技术来嵌入切片的石蜡^13。
    8. 部分使用标准切片技术用切片机¹³被成像在垂直于切口线5微米厚的切片，并存储样品在黑暗中直到准备。
    9. 使用配有CCD数码相机按照第⁷ 1.10可视化和捕捉荧光染料方面的图像的落射荧光显微镜。

    3.量化GJIC

    1. 使用形态的软件包（ 例如 ，ImageJ的）测量荧光染料扩散。
       1. 点击"文件"选项卡，然后单击"打开"，打开保存的图像。
       2. 点击"免费手工具"，在工具栏选项卡来跟踪染料前端的轮廓。
       3. 单击"分析"选项卡，然后单击"测量"。
          注意:这将产生在一个扩散片，其如果需要，可以复制到其它电子数据表程序的区域的值。
    2. 使用电子表格程序，通过将在实验板通过使用以下公式中的控制板上的染料行进的区域中的染料扩散的面积计算控制（FOC）的分数:
       
       A E =在暴露于实验变量的细胞，例如用化学在特定剂量或时间处理的细胞中的染料扩散的区域
       染料扩散的控制，这是与用于溶解所关注的化学品的载体处理的细胞的C =面积
       注意:为了确定车辆的效果，A E将是染料扩散的区域中由车辆处理的细胞和C是在不通过车辆处理的细胞中的染料扩散的面积。车辆的效果应优选小于10％。

结果

GJIC中断已被广泛用作生物标记物用于鉴定处于导致不利的健康影响¹⁴基因控制的nongenotoxic，后生水平的有毒化合物。例如，多环芳香烃（PAHs）是环境的无所不在的污染物，但在他们的后生毒性作为其分子结构¹⁵的函数而变化。较低分子量多环芳烃通常发现在相对较高的浓度比在许多不同的环境中的更高分子量的多环芳烃如被污染的河流沉积物到该香烟烟雾^15,16。菲是一种低分子量PAH是具备三个苯环与被称为海湾地区的角度口袋里的一个例子。 图2是一系列具有递增剂量的菲的处理的WB-F344大鼠肝脏上皮细胞的SL-DT图像。请注意，在移民澳下降F中的荧光染料，荧光黄，用增加剂量。扫描的图像的区域可被确定为在控制（FOC）的一小部分。 图2的控制是细胞的溶剂处理的PAH溶于，即乙腈。通常SL-DT实验一式两份或一式三份进行用于与最少三个独立试验的每个试验性参数，这将是在这个实验中的剂量每次试验。然后将FOC值可被平均，统计分析，然后绘制（参见

讨论

对SL-DT测定是在测定GJIC简单和通用的技术，但也有要在设计适当的实验方案来解释几个关键的关注。对于使用SL-DT测定细胞间隙连接通讯的强大的测量必须有通过细胞间隙连接的LY良好的染料扩散。在最低限度，有足够的时间应选择以保证染料通过八个或更多列细胞扩展从两个方向的手术刀加载细胞。另外，为了便于将染料从手术刀装载的细胞迁移的距离的测量，选择确保了控制板的染料扩散填充视野的70〜90％的倍率因子。对于WB-F344大鼠肝上皮细胞，与LY解决方法三分钟培养足以使染料前到超过四级单元行移动，和200X的放大倍数是最佳的。细胞生长在35 mm直径板，这是相当易于进行loadi纳克染料成用手术刀细胞。然而，细胞可以在小水井中生长，但使用手术刀是不可能的，尤其是在96孔培养板中。对于小水井，用小圆头尖端，能适合入井，并再次，使用滚动操作。这种滚动操作是关键的一步，因为它是微创，并提供了一个非常干净的线负载，防止细胞被撕裂，创建典型的原始刮法大无细胞间隙。可选地，针针可以使用，其中所述针的小捻确实装载染料的一个很好的工作进入细胞。

其他细胞类型可以在此测定法中使用。但是，细胞的选择和理解GJ...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
WB-F344 大鼠肝上皮细胞	来自北卡罗来纳大学（北卡罗来纳州教堂山）的 JW Grisham 和 MS Tsao 博士	无	由北卡罗来纳大学教堂山分校 - 北卡罗来纳大学 - 北卡
35 mm 培养板	康宁	430165
25 cm2 培养瓶	康宁	430639
75 cm2 培养瓶	康宁	430641
D 培养基，一种 Eagles 修饰培养基	赛默飞世尔/GIBCO	配方 78-5470EF
胎牛血清	ThermoFisher/GIBCO	10437
0.25% 胰蛋白酶-EDTA	赛默飞世尔/GIBCO	自制的15050
磷酸盐缓冲盐水		，成分为cat#的	137 mM NaCl，2.7 mM KCl，10 mM Na2PO4，2 mM KH2PO4
KCl	JT Baker - Mallinckrodt	3040-01
NaCl	JT Baker - Mallinckrodt	3624-05
Na2HPO><4	JT Baker - 马林克罗特	3819--01
KH2PO4	JT Baker - 马林克罗特	3246-01
路西法黄 CH，锂盐	Sigma-Aldrich Chemical	L0259
罗丹明-葡聚糖	Sigma-Aldrich Chemical	R9379
1-甲基蒽	Sigma-Aldrich Chemical
	Sigma-Aldrich Chemical	P11409
白藜醇	Sigma-Aldrich Chemical	R5010
D609	Tocris 生物科学	1437
乙腈	EMD	AX0145-1
37% 溶液甲醛	JT Baker - Mallinckrodt	2106-01
#20 手术刀片	Fine Science Tools Inc.	10317-14
50 ml Thermo Scientific 锥形无菌管
尼康落射荧光显微镜	尼康-Mager Scientific	Eclipse TE300
尼康FITC二向色立方体	尼康-Mager Scientific	96107
CCD相机	尼康-Mager Scientific	尼康Cool Snap EZ CCD
成像系统	尼康-Mager Scientific	尼康NIS-Elements F2.2成像系统。
ImageJ	美国国立卫生研究院	http://imagej.nih.gov/ij/