本方案描述了一种使用手术刀加载荧光染料转移的技术，用于测量通过间隙连接通道的细胞间通讯。间隙连接介导的细胞间通讯是一种重要的细胞过程，对维持组织稳态至关重要，而此类细胞信号传导的中断会对健康产生不利影响。
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摘要
摘要
本方案描述了一种刀片加载-荧光染料转移（SL-DT）技术，用于检测通过缝隙连接通道介导的细胞间通讯，该过程是维持组织稳态的主要细胞间机制。有毒物质、毒素、药物等因素导致的缝隙连接细胞间通讯（GJIC）中断， 等等。 已与多种不良健康效应相关。许多基于遗传的人类疾病已被证实与间隙连接基因的突变有关。SL-DT技术是一种简便的功能性检测方法，可用于同时评估大量细胞群体中的间隙连接介导的细胞间通讯（GJIC）。该检测方法包括使用手术刀片在细胞群体中短暂划伤细胞膜，从而使细胞预先加载荧光染料。随后，荧光染料在指定时间内通过间隙连接通道扩散至邻近细胞。通过向细胞中加入甲醛终止检测。利用落射荧光显微镜观察荧光染料在细胞群体中的扩散情况，并可采用多种可用的形态测量软件包对图像进行分析，包括公共领域中的免费软件。该检测方法也已被改进用于 体内 使用经处理动物不同器官的组织切片进行的研究。总体而言，SL-DT检测可适用于广泛范围的 体外 药理学和毒理学研究需求，且有望适用于高通量自动化荧光显微成像与分析系统，以在更短时间内阐明更多样本。
引言
本方法的总体目标是提供一种简单、全面且相对经济的技术，用于评估化合物的潜在毒性。这是一种 体外 可在多种细胞系中应用的方法。配备落射荧光显微镜的标准细胞生物学实验室即可使用该检测方法开展研究。
我们对细胞功能的基础认知在很大程度上依赖于 体外 生物测定，并已成为药物、环境污染物和食源性污染物毒理学评估中的关键组成部分。然而，目前尚无单一 体外 能够全面满足各类毒理学评估需求的生物测定系统。许多 体外 检测方法经过设计和优化，用于评估特定的生物化学或分子终点指标。这些方法通常在高通量实验体系中联合使用，以反映特定信号转导通路（如雌激素受体信号通路）的扰动情况1这一策略已取得相当成功，但基因表达涉及的信号转导通路数量众多，使得选择特定信号通路进行评估的任务变得十分复杂。目前，高通量实验方案正在被开发并用于同时检测多种信号通路，这是克服单一检测方法局限性的一种途径。然而，并非所有信号通路都已成功整合到更全面的检测方法中，同时新的信号通路不断被发现，进一步增加了评估过程的复杂性。使用大量 体外 方法，特别是高通量系统，用于全面的毒理学评估时也非常昂贵，且不利于大多数由单个研究者主导的研究项目。
间隙连接介导的细胞间通讯是由电压、钙离子浓度、pH值和氧化还原平衡的变化严格调控的，并受到主要细胞内信号转导通路以及与膜蛋白和细胞骨架蛋白相互作用的调节。2,3因此，间隙连接介导的细胞间通讯（GJIC）的抑制可以反映不同类型的细胞应激、多种细胞功能的破坏，或不同信号转导通路的干扰。另一种克服有限信号转导生物测定方法的策略是利用一个生物学现象，即许多（即使不是大多数）信号转导通路会通过间隙连接通道，进一步受到协同性细胞间信号系统的调控。4-8尽管细胞间信号系统种类繁多且受多条通路调控，但通过缝隙连接通道的细胞间信号传递最终取决于通道处于开放、部分关闭或完全关闭的状态。这提供了一个可通过多种方法轻松测量的终点指标 体外 生物测定系统7考虑到组织的稳态设定点需要通道处于开放状态，因此测定化合物对缝隙连接细胞间通讯（GJIC）的影响，是评估化合物潜在毒性作用更为全面的方法。4,8本质上，这种在协调多种控制基因表达的信号转导事件中起核心作用的关键生物学现象，使得对毒性效应进行广泛评估成为可能。因此，用于评估间隙连接通讯（GJIC）的生物测定是评价化合物毒性的理想起点。
用于评估间隙连接介导的细胞间通讯（GJIC）最广泛使用的技术基于将细胞预先加载荧光探针，随后监测染料从已加载的细胞向邻近细胞的迁移。用于预加载染料的技术包括显微注射9、划痕加载10以及荧光探针的甲酯形式11。刀片加载-荧光染料转移（SL-DT）方法是对El Fouly建立的划痕加载-染料转移实验的一种改进10。与更具侵入性的划痕法不同，本报告中所述的刀片加载方法是通过使用圆刃手术刀在细胞单层上轻轻滚动，从而最大限度地减少对细胞的侵入性损伤（图1）。该技术的优势在于能够对细胞群体进行毒理学评估，而非仅限于显微注射实验中的单个细胞。此外，该实验操作简便，可在短时间内快速检测多个培养板；相比之下，采用显微注射或使用荧光探针甲酯的方法耗时显著更长，且对操作技能的要求更高。
尽管目前尚无单一方法能够满足缝隙连接介导的细胞间通讯（GJIC）研究的所有需求，但SL-DT检测法是一种简单、相对经济且用途广泛的检测方法，可满足对多种化合物毒性进行初步评估的诸多需求。其主要优势包括：操作简便，无需其他方法（如显微注射、光漂白后荧光恢复（FRAP）检测以及分子荧光探针局部激活检测）所必需的特殊设备或技术；能够快速、同步地对大量细胞中的GJIC进行评估；适用于结合自动化荧光显微成像与分析的高通量实验体系；此外，该方法还可适用于in vivo研究。
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方案
本研究的实验方案已获得日本国立卫生科学研究所动物护理与使用委员会的批准，该机构是 体内 实验过程中采取了相应措施，以确保大鼠得到人道对待，并尽可能减轻其痛苦。
1. SL-DT 生物测定法
- 接种 3 × 105 将WB-F344大鼠肝上皮细胞接种于含Eagle改良培养基和5%胎牛血清的35 mm直径培养皿中，置于37 ºC、100%相对湿度（RH）、5% CO₂的培养箱中培养。2.
- 将细胞培养至100%汇合度（通常为2天），并按照下文所述对细胞进行所需的实验处理。
- 开展剂量反应实验
- 添加 10 µl 和 20 µl 2 mM 菲的100%乙腈储备溶液 4 µl, 6 µl，以及 8 µl 向三块细胞培养板中各加入2 ml生长培养基，并根据所加储备液体积，分别加入一定量的苯并蒽（phenanthrene）20 mM乙腈（acetonitrile）储备液（浓度为100%）。
- 添加 4 µl, 6 µl, 8 µl, 10 µl，以及 20 µl 向三块细胞培养板中各加入2 ml生长培养基和相应体积的100%乙腈溶液，作为溶剂对照。
- 将培养板置于设定为 37 °C，100% 相对湿度和 5% CO2.
- 进入步骤 1.3。
- 进行时间响应实验
- 添加 7 µl 将20 mM菲的100%乙腈储备液加入三块细胞培养板中，每板含2 ml生长培养基，用于各个时间点（即0、1、2、3、4、5、10 分钟
- 添加 7 µl 向三个细胞培养板中各加入2 ml生长培养基和100%乙腈，每个时间点设为溶剂对照。
- 将各指定时间点的培养皿置于培养箱中孵育 37 °C，100% 相对湿度和 5% CO2.
- 进入步骤 1.3。
- 进行时间恢复实验
- 添加 7 µl 将20 mM菲的100%乙腈储备液各加入三块细胞培养板中，每板含2 ml生长培养基，作用15分钟。
- 添加 7 µl 加入2 ml含100%乙腈的培养基至三块细胞培养板中，孵育15分钟，作为溶剂对照。
- 弃去含有菲或乙腈的培养基，用 3 ml 磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤 3 次。
- 向每块培养板中加入 2 ml 新鲜培养基，于所需恢复时间下进行孵育（即， 25、35、45、60、90、120、150、180、240、360 分钟）置于培养箱中 37 °C，100% 相对湿度和 5% CO2.
- 进入步骤 1.3。
- 开展机制实验
- 加入信号转导抑制剂， 即, 5 µl 将20 mM的D609储备液（溶于100%乙腈）各加入三块细胞培养板中，每板含2 ml生长培养基，孵育15 min。
- 添加 5 µl 加入100%乙腈至三块细胞培养板中，每孔含2 ml生长培养基，处理15分钟，作为溶剂对照。
- 添加 7 µl 将20 mM菲的100%乙腈储备液加入含2 ml生长培养基和D609的三块细胞培养板中，继续孵育15分钟。
- 添加 7 µl 加入2 ml生长培养基和100%乙腈至三块细胞培养板中，使乙腈终浓度为100%，继续孵育15分钟，作为溶剂对照。
- 进入步骤 1.3。
- 开展剂量反应实验
- 弃去培养基，可轻轻倾倒去除，或使用真空抽吸法。
注意：含危险废弃物的培养基应妥善处理。 - 用 3 ml 磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤细胞三次，每次洗涤之间倾倒或抽吸去除液体。
- 用移液器将1 ml浓度为1 mg/ml的Lucifer Yellow染料（溶于PBS中，LY）加入每块细胞培养板中。
- 通过使用带有圆边的20号外科钢刀片，在培养板的三个不同区域轻轻滚动穿过细胞群，将染料预加载到细胞中。
- 首先将手术刀垂直放置（90° 角度）以及距离培养皿边缘5 mm处，然后将手术刀从该垂直角度滚动至约一个角度 15° （参见 图1).
注意：用食指和拇指夹住手术刀。利用重力使手术刀轻轻从 90° 到 15° 位置（因为圆形刀片会直接在细胞上滚动）。该操作会留下一条肉眼可见的压痕线。
- 首先将手术刀垂直放置（90° 角度）以及距离培养皿边缘5 mm处，然后将手术刀从该垂直角度滚动至约一个角度 15° （参见 图1).
- 将细胞与LY溶液在室温下孵育3分钟。
- 倾去或抽吸裂解液（LY），并用3 ml PBS洗涤三次，以去除所有细胞外染料，消除细胞外背景荧光。
- 加入0.5 ml 10%磷酸盐缓冲甲醛溶液以固定细胞。
注意：福尔马林固定后，将细胞风干，并在避光条件下储存，最长可达两年，以尽量减少LY染料的光漂白。如需观察荧光染料前沿，可用10%福尔马林溶液重新水化。 - 使用配备有激发/发射峰为428/536 nm的二向色镜立方体的落射荧光显微镜，在200倍放大倍数下观察固定后的细胞。调整所有培养板方向，使凹槽线与水平视野平行。
注意：使用 FITC 二向色镜立方体效果良好。- 使用CCD相机及配套软件采集图像。
- 打开CCD相机的配套软件，并设置为自动曝光模式。点击“capture”按钮以数字方式获取图像。使用“Save”按钮将图像保存为.tif文件。
- 使用CCD相机及配套软件采集图像。
2. SL-DT 检测法在肝脏组织中的应用
- 使用解剖剪从一只5周龄雄性Fischer 344大鼠的肝脏左叶上切下约2 × 2 cm的组织块，并将其置于覆盖有湿润纱布的塑料称量盘上12。
- 用移液器将0.5 ml含有1 mg/ml荧光黄和1 mg/ml罗丹明葡聚糖（RD）的PBS溶液滴加到称量盘中肝组织块的表面。
注意：RD是一种无法通过缝隙连接通道的染料，可用于标记被染料加载的细胞。 - 用锋利刀片在称量盘中带有染料溶液的肝组织块表面做3至5道长约1 cm的切口，然后加入足量染料以充满切口。
- 将组织在室温下的塑料称量盘中孵育3分钟。
- 用5 ml PBS冲洗三次。
- 将组织在50 ml锥形离心管中用30 ml 10%磷酸盐缓冲甲醛溶液于室温避光条件下固定过夜。
- 次日，用水洗涤组织块，用解剖剪沿切口周围修剪成1 × 1 × 0.5 cm3的条状，然后采用标准技术将组织块包埋于石蜡中13。
- 使用切片机采用标准切片技术，沿垂直于切口线的方向将组织块切成5 µm厚的切片，并将样本避光保存，直至准备成像13。
- 使用配备CCD数字相机的落射荧光显微镜，按照第1.10节方法观察并采集荧光染料前沿的图像7。
3. 间隙连接介导的细胞间通讯（GJIC）的定量分析
- 使用形态测量软件包测量荧光染料的扩散范围（例如，ImageJ）
- 单击“文件”选项卡，然后单击“打开”以打开已保存的图像。
- 单击工具栏选项卡中的“Free Hand Tool”以描记染料前沿的轮廓。
- 点击“分析”选项卡，然后点击“测量”。
注意：这将在电子表格中生成一个面积值，如有需要，可将其复制到其他电子表格程序中。
- 使用电子表格程序，通过以下公式计算对照组分数（FOC）：将实验组平板中染料扩散的面积除以对照组平板中染料扩散的面积。
Ae = 实验变量处理细胞中染料扩散的面积，例如用特定剂量或时间的化学物质处理的细胞
Ac = 对照组中染料扩散的面积，对照组细胞使用溶解目标化学物质的溶剂处理
注意：为确定溶剂的效应，Ae 为经溶剂和A处理的细胞中染料扩散的面积c 应为未用溶剂处理的细胞中染料扩散的面积。溶剂的影响最好小于10%。
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结果
间隙连接介导的细胞间通讯（GJIC）的中断已被广泛用作生物标志物，用于识别在非遗传性、表观遗传水平上引发有害健康效应的毒性化合物14。例如，多环芳烃（PAHs）是环境中普遍存在的污染物，但其表观遗传毒性随分子结构的不同而有所差异15。在多种不同环境中，如受污染的河流沉积物或香烟烟雾中，低分子量PAHs的浓度通常高于高分子量PAHs15,16。菲是一种低分子量PAH的典型代表，含有三个苯环，并具有一个称为“湾区”的角形空腔。图2展示了一系列经不同浓度菲处理的WB-F344大鼠肝上皮细胞的SL-DT图像。请注意，随着菲浓度的增加，荧光染料荧光黄（Lucifer Yellow）的迁移逐渐减少。扫描图像的面积可表示为对照组的分数（FOC）。图2中的对照组细胞使用了溶解PAH的溶剂处理，即乙腈。通常情况下，每次实验的每个剂量组均设置重复两到三次，且每个实验参数至少进行三次独立实验，本实验中实验参数即为剂量。随后可对FOC值进行平均、统计分析并作图（见...
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讨论
SL-DT 法是一种测定间隙连接介导的细胞间通讯（GJIC）的简单且多功能的技术，但在设计适当的实验方案时，需考虑若干关键因素。为了通过 SL-DT 法获得可靠的 GJIC 测量结果，荧光黄（LY）必须通过细胞间的间隙连接实现良好的染料扩散。至少应选择足够长的孵育时间，以确保染料从划痕处的细胞向两侧扩散至八排或更多排的细胞。此外，为便于测量染料从划痕处细胞迁移的距离，应选择合适的放大倍数，使对照组培养皿中的染料扩散范围占据视野的 70% 至 90%。对于 WB-F344 大鼠肝上皮细胞，使用 LY 溶液孵育三分钟即可使染料前沿扩散超过四排细胞，而 200 倍放大倍数为最佳选择。细胞可培养在直径为 35 mm 的培养皿中，这种规格非常便于使用手术刀将染料导入细胞。然而，细胞也可培养于较小的孔板中，但此时无法使用手术刀，尤其是在 96 孔板中。对于较小的孔，应使用可插入孔内的小型圆头切割工具，并同样采用滚动式操作。这种滚动操作是关键步骤，因其侵入性极小，可形成非常整齐的染料加载线，避免细胞撕裂及产生类似传统刮擦法所导致的大面积无细胞间隙。 alternatively，也可使用针灸针，通过轻微旋转针头即可有效地将染料导入细胞。
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
由NIEHS资助项目#R01 ES013268-01A2以及CETOCOEN UPGrade项目No. CZ.1.05/2.1.00/19.0382支持，内容仅由作者负责，不代表NIEHS的官方观点。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| WB-F344 大鼠肝上皮细胞 | 由北卡罗来纳大学（北卡罗来纳州教堂山，NC）的 J. W. Grisham 博士和 M. S. Tsao 博士提供 | 无 | 由北卡罗来纳大学教堂山分校（北卡罗来纳州）的 J. W. Grisham 博士和 M. S. Tsao 博士提供 |
| 35 mm 培养皿 | Corning | 430165 | |
| 25 cm2 培养瓶 | Corning | 430639 | |
| 75 cm2 培养瓶 | Corning | 430641 | |
| D-培养基，一种改良的 Eagle 培养基 | ThermoFisher/GIBCO | 配方编号 78-5470EF | |
| 胎牛血清 | ThermoFisher/GIBCO | 10437 | |
| 0.25% 胰蛋白酶-EDTA | ThermoFisher/GIBCO | 15050 | |
| 磷酸盐缓冲液 | 自制 | 成分货号见下文 | 137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10 mM Na2PO4, 2 mM KH2PO4 |
| KCl | JT Baker - Mallinckrodt | 3040-01 | |
| NaCl | JT Baker - Mallinckrodt | 3624-05 | |
| Na2HPO4 | JT Baker - Mallinckrodt | 3819--01 | |
| KH2PO4 | JT Baker - Mallinckrodt | 3246-01 | |
| 荧光黄 CH 锂盐 | Sigma-Aldrich Chemical | L0259 | |
| 罗丹明-葡聚糖 | Sigma-Aldrich Chemical | R9379 | |
| 1-甲基蒽 | Sigma-Aldrich Chemical | ||
| 菲 | Sigma-Aldrich Chemical | P11409 | |
| 白藜芦醇 | Sigma-Aldrich Chemical | R5010 | |
| D609 | Tocris Bioscience | 1437 | |
| 乙腈 | EMD | AX0145-1 | |
| 37% 甲醛溶液 | JT Baker - Mallinckrodt | 2106-01 | |
| #20 外科刀片 | Fine Science Tools Inc. | 10317-14 | |
| 50 ml 锥形无菌管 | Thermo scientific | 339652 | |
| Nikon 落射荧光显微镜 | Nikon -Mager Scientific | Eclipse TE300 | |
| Nikon FITC 二向色镜组 | Nikon -Mager Scientific | 96107 | |
| CCD 相机 | Nikon -Mager Scientific | Nikon Cool Snap EZ CCD | |
| 成像系统 | Nikon -Mager Scientific | Nikon NIS-Elements F2.2 成像系统。 | |
| ImageJ | 美国国立卫生研究院 | http://imagej.nih.gov/ij/ |
参考文献
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