间隙连接细胞间通讯：一种用于评估毒物和毒素不良效应及天然产物健康益处的功能性生物标志物

摘要

本方案描述了一种使用手术刀加载荧光染料转移的技术，用于测量通过间隙连接通道的细胞间通讯。间隙连接介导的细胞间通讯是一种重要的细胞过程，对维持组织稳态至关重要，而此类细胞信号传导的中断会对健康产生不利影响。

摘要

本方案描述了一种刀片加载-荧光染料转移（SL-DT）技术，用于检测通过缝隙连接通道介导的细胞间通讯，该过程是维持组织稳态的主要细胞间机制。有毒物质、毒素、药物等因素导致的缝隙连接细胞间通讯（GJIC）中断， 等等。 已与多种不良健康效应相关。许多基于遗传的人类疾病已被证实与间隙连接基因的突变有关。SL-DT技术是一种简便的功能性检测方法，可用于同时评估大量细胞群体中的间隙连接介导的细胞间通讯（GJIC）。该检测方法包括使用手术刀片在细胞群体中短暂划伤细胞膜，从而使细胞预先加载荧光染料。随后，荧光染料在指定时间内通过间隙连接通道扩散至邻近细胞。通过向细胞中加入甲醛终止检测。利用落射荧光显微镜观察荧光染料在细胞群体中的扩散情况，并可采用多种可用的形态测量软件包对图像进行分析，包括公共领域中的免费软件。该检测方法也已被改进用于 体内 使用经处理动物不同器官的组织切片进行的研究。总体而言，SL-DT检测可适用于广泛范围的 体外 药理学和毒理学研究需求，且有望适用于高通量自动化荧光显微成像与分析系统，以在更短时间内阐明更多样本。

引言

本方法的总体目标是提供一种简单、全面且相对经济的技术，用于评估化合物的潜在毒性。这是一种 体外 可在多种细胞系中应用的方法。配备落射荧光显微镜的标准细胞生物学实验室即可使用该检测方法开展研究。

我们对细胞功能的基础认知在很大程度上依赖于 体外 生物测定，并已成为药物、环境污染物和食源性污染物毒理学评估中的关键组成部分。然而，目前尚无单一 体外 能够全面满足各类毒理学评估需求的生物测定系统。许多 体外 检测方法经过设计和优化，用于评估特定的生物化学或分子终点指标。这些方法通常在高通量实验体系中联合使用，以反映特定信号转导通路（如雌激素受体信号通路）的扰动情况¹这一策略已取得相当成功，但基因表达涉及的信号转导通路数量众多，使得选择特定信号通路进行评估的任务变得十分复杂。目前，高通量实验方案正在被开发并用于同时检测多种信号通路，这是克服单一检测方法局限性的一种途径。然而，并非所有信号通路都已成功整合到更全面的检测方法中，同时新的信号通路不断被发现，进一步增加了评估过程的复杂性。使用大量 体外 方法，特别是高通量系统，用于全面的毒理学评估时也非常昂贵，且不利于大多数由单个研究者主导的研究项目。

间隙连接介导的细胞间通讯是由电压、钙离子浓度、pH值和氧化还原平衡的变化严格调控的，并受到主要细胞内信号转导通路以及与膜蛋白和....

方案

本研究的实验方案已获得日本国立卫生科学研究所动物护理与使用委员会的批准，该机构是 体内 实验过程中采取了相应措施，以确保大鼠得到人道对待，并尽可能减轻其痛苦。

1. SL-DT 生物测定法

1. 接种 3 × 10⁵ 将WB-F344大鼠肝上皮细胞接种于含Eagle改良培养基和5%胎牛血清的35 mm直径培养皿中，置于37 ºC、100%相对湿度（RH）、5% CO₂的培养箱中培养。₂.
2. 将细胞培养至100%汇合度（通常为2天），并按照下文所述对细胞进行所需的实验处理。
   1. 开展剂量反应实验
      1. 添加 10 µl 和 20 µl 2 mM 菲的100%乙腈储备溶液 4 µl, 6 µl，以及 8 µl 向三块细胞培养板中各加入2 ml生长培养基，并根据所加储备液体积，分别加入一定量的苯并蒽（phenanthrene）20 mM乙腈（acetonitrile）储备液（浓度为100%）。
      2. 添加 4 µl, 6 µl, 8 µl, 10 µl，以及 20 µl 向三块细胞培养板中各加入2 ml生长培养基和相应体积的100%乙腈溶液，作为溶剂对照。
      3. 将培养板置于设定为 37 °C，100% 相对湿度和 5% CO₂.
      4. 进入步骤 1.3。
   2. ....

结果

间隙连接介导的细胞间通讯（GJIC）的中断已被广泛用作生物标志物，用于识别在非遗传性、表观遗传水平上引发有害健康效应的毒性化合物¹⁴。例如，多环芳烃（PAHs）是环境中普遍存在的污染物，但其表观遗传毒性随分子结构的不同而有所差异¹⁵。在多种不同环境中，如受污染的河流沉积物或香烟烟雾中，低分子量PAHs的浓度通常高于高分子量PAHs^15,16。菲是一种低分子量PAH的典型代表，含有三个苯环，并具有一个称为“湾区”的角形空腔。图2展示了一系列经不同浓度菲处理的WB-F344大鼠肝上皮细胞的SL-DT图像。请注意，随着菲浓度的增加，荧光染料荧光黄（Lucifer Yellow）的迁移逐渐减少。扫描图像的面积可表示为对照组的分数（FOC）。图2中的对照组细胞使用了溶解PAH的溶剂处理，即乙腈。通常情况下，每次实验的每个剂量组均设置重复两到三次，且每个实验参数至少进行三次独立实验，本实验中实验参数即为剂量。随后可对FOC值进行平均、统计分析并作图（见.......

讨论

SL-DT 法是一种测定间隙连接介导的细胞间通讯（GJIC）的简单且多功能的技术，但在设计适当的实验方案时，需考虑若干关键因素。为了通过 SL-DT 法获得可靠的 GJIC 测量结果，荧光黄（LY）必须通过细胞间的间隙连接实现良好的染料扩散。至少应选择足够长的孵育时间，以确保染料从划痕处的细胞向两侧扩散至八排或更多排的细胞。此外，为便于测量染料从划痕处细胞迁移的距离，应选择合适的放大倍数，使对照组培养皿中的染料扩散范围占据视野的 70% 至 90%。对于 WB-F344 大鼠肝上皮细胞，使用 LY 溶液孵育三分钟即可使染料前沿扩散超过四排细胞，而 200 倍放大倍数为最佳选择。细胞可培养在直径为 35 mm 的培养皿中，这种规格非常便于使用手术刀将染料导入细胞。然而，细胞也可培养于较小的孔板中，但此时无法使用手术刀，尤其是在 96 孔板中。对于较小的孔，应使用可插入孔内的小型圆头切割工具，并同样采用滚动式操作。这种滚动操作是关键步骤，因其侵入性极小，可形成非常整齐的染料加载线，避免细胞撕裂及产生类似传统刮擦法所导致的大面积无细胞间隙。 alternatively，也可使用针灸针，通过轻微旋转针头即可有效地将染料导入细胞。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
WB-F344 大鼠肝上皮细胞	由北卡罗来纳大学（北卡罗来纳州教堂山，NC）的 J. W. Grisham 博士和 M. S. Tsao 博士提供	无	由北卡罗来纳大学教堂山分校（北卡罗来纳州）的 J. W. Grisham 博士和 M. S. Tsao 博士提供
35 mm 培养皿	Corning	430165
25 cm2 培养瓶	Corning	430639
75 cm2 培养瓶	Corning	430641
D-培养基，一种改良的 Eagle 培养基	ThermoFisher/GIBCO	配方编号 78-5470EF
胎牛血清	ThermoFisher/GIBCO	10437
0.25% 胰蛋白酶-EDTA	ThermoFisher/GIBCO	15050
磷酸盐缓冲液	自制	成分货号见下文	137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10 mM Na2PO4, 2 mM KH2PO4
KCl	JT Baker - Mallinckrodt	3040-01
NaCl	JT Baker - Mallinckrodt	3624-05
Na2HPO4	JT Baker - Mallinckrodt	3819--01
KH2PO4	JT Baker - Mallinckrodt	3246-01
荧光黄 CH 锂盐	Sigma-Aldrich Chemical	L0259
罗丹明-葡聚糖	Sigma-Aldrich Chemical	R9379
1-甲基蒽	Sigma-Aldrich Chemical
菲	Sigma-Aldrich Chemical	P11409
白藜芦醇	Sigma-Aldrich Chemical	R5010
D609	Tocris Bioscience	1437
乙腈	EMD	AX0145-1
37% 甲醛溶液	JT Baker - Mallinckrodt	2106-01
#20 外科刀片	Fine Science Tools Inc.	10317-14
50 ml 锥形无菌管	Thermo scientific	339652
Nikon 落射荧光显微镜	Nikon -Mager Scientific	Eclipse TE300
Nikon FITC 二向色镜组	Nikon -Mager Scientific	96107
CCD 相机	Nikon -Mager Scientific	Nikon Cool Snap EZ CCD
成像系统	Nikon -Mager Scientific	Nikon NIS-Elements F2.2 成像系统。
ImageJ	美国国立卫生研究院	http://imagej.nih.gov/ij/