在细胞外基质中构建三维上皮组织

摘要

本文描述了一种基于软光刻技术的方法，用于构建由细胞外基质包绕的、具有明确几何形状的三维（3D）上皮组织的均一阵列。该方法适用于多种细胞类型和实验条件，并可实现对相同重复样本的高通量筛选。

摘要

肺、肾和乳腺等分支器官的结构形成源于分支形态发生这一发育过程，该过程受到微环境中多种可溶性因子和物理信号的调控。本文介绍了一种用于研究分支形态发生过程的方法，通过构建形状和大小均明确的工程化三维（3D）上皮组织，并将其完全包埋于细胞外基质（ECM）中，以模拟生理环境。该方法可实现大量相同组织的阵列化生成，并可调控多种环境因素，包括组织几何形状、间距以及ECM成分。此外，该方法还可与牵引力显微镜（TFM）等广泛应用的技术相结合，以更深入地了解细胞与其周围ECM之间的相互作用。该实验方案也可用于研究除分支形态发生外的多种细胞与组织过程，如癌症侵袭。

引言

分支上皮组织的发育，即分支形态发生，受到细胞来源、物理及环境因素的调控。在乳腺中，分支形态发生是一个反复迭代的过程，通过导向性的集体细胞迁移形成树状结构。该过程的第一步是来自乳腺导管的初级芽体形成，随后是分支的起始与延伸^1,2青春期时，类固醇激素的系统性释放会诱导导管分支向周围间质侵袭。随后，新的初级芽体从已有分支的末端开始形成，此过程持续进行，最终构建出树状上皮结构。³尽管许多重要的生化信号已被鉴定，但目前对于指导这一复杂发育过程的细胞生物学机制仍缺乏全面的理解。此外，从实验中解析特定信号影响的机制性研究也难以开展。 体内因为通常无法实现精确的时空扰动和测量。

三维（3D）培养技术，例如全器官培养、原代类器官和细胞培养模型，是系统研究组织形态发生机制的有用工具^4-6。这些技术尤其适用于分别确定特定因素（如机械力和生化信号）对多种细胞行为（包括迁移、增殖和分化）的影响⁶。特别是工程化的细胞培养模型，能够便捷地对单个细胞及其微环境进行干预。

一种此类培养模型采用基于微加工的技术，构建具有可控三维结构的模拟乳腺上皮组织，该组织在适当生长因子诱导下能够稳定且可重复地形成集体迁移的分支结构。该模型的主要优势在于能够精确操控并量化物理和生化因素（如机械应力分布模式）的影响，并具有高度的统计可信度。该技术结合计算建模，已被用于确....

方案

1. 溶液的配制

1. 配制5 mg/ml的胰岛素溶液：将胰岛素粉末溶于含5 mM盐酸（HCl）的dH₂O中（即500 mg胰岛素溶于100 ml溶剂）。通过向100 ml蒸馏水（dH₂O）中加入50 μl浓盐酸配制100 ml溶剂。
2. 配制1x磷酸盐缓冲液（PBS）：在无菌条件下，用dH₂O将10x PBS储备液稀释至1x。
3. 配制聚二甲基硅氧烷（PDMS）弹性体溶液：按10:1（w:w）的质量比将PDMS预聚物与固化剂混合。
4. 配制细胞培养基：向500 ml的Dulbecco改良Eagle培养基：营养混合物F-12（DMEM/F-12）储备液中加入10 ml无菌胎牛血清（FBS）、500 μl庆大霉素试剂和500 μl 5 mg/ml胰岛素溶液。
5. 配制1%牛血清白蛋白（BSA）的1x PBS溶液：将BSA粉末以1%（w:v）的比例加入1x PBS中，充分混匀。
6. 配制4 mg/ml中和的牛I型胶原蛋白溶液：在预冷的1.5 ml微量离心管中加入50 µl 10x Hank's平衡盐溶液（HBSS）缓冲液、30 µl 0.1 N氢氧化钠（NaOH）、30 µl细胞培养基和400 µl胶原蛋白储备液。通过移液器缓慢吹打混匀，避免产生气泡。如有气泡，可在4 °C短暂离心以去除。
7. 配制固定液：将16%多聚甲醛按1:4（v:v）体积比用1x PB....

结果

乳腺上皮组织微加工的一般示意图

概述实验工作流程的微加工工艺通用示意图如图1所示。最终结果是在细胞外基质（ECM）凝胶内完全包埋的、具有相同几何形状和间距的上皮组织阵列。一个典型的实验使用EpH4小鼠乳腺上皮细胞，将其培养在浓度为4 mg/ml的牛I型胶原蛋白凝胶中。为了确保构建的组织具有最高质量，应严格遵循本方案中所述的技术步骤。图2A和2B展示了在接种细胞前，模制于I型胶原凝胶中的矩形微孔阵列的低倍和高倍显微图像。微孔的形状由硅模板上微结构的形状决定。将聚二甲基硅氧烷（PDMS）模具从胶原凝胶上垂直提起至关重要，以避免微腔几何形状发生变形。图2C显示了已填充乳腺上皮细胞的I型胶原凝胶中的矩形微孔（胶原表面多余的细胞已被冲洗去除）。在此示例中，每个200 μm × 50 μm的矩形微孔大约包含80–100个细胞。

讨论

上述方案描述了一种制备具有预定义形状的相同上皮组织的方法，从而实现对组织中细胞所受机械应力的空间控制。该方法利用弹性体模具在I型胶原中创建空腔，随后将上皮细胞接种于空腔内，并覆盖额外的胶原层，使细胞完全包埋于三维胶原基质环境中。通过进一步培养这些组织并施加生长因子以诱导其从初始结构发生分支，该系统适用于研究上皮细胞的分支形态发生过程。本方案中有若干关键步骤：首先，在接种细胞前，需将聚二甲基硅氧烷（PDMS）模具垂直向上提起，避免任何水平移动，否则会导致空腔变形，无法保持预期的几何形状。其次，在向空腔接种细胞后，必须小心洗去表面残留的多余细胞，因为这些细胞可能干扰图案化组织的行为，特别是当其紧邻组织时。然而，若清洗过于剧烈，则可能导致空腔内的细胞被冲出。最后，在最终的微图案化步骤中，当含有细胞的胶原凝胶被浸入培养基时，应缓慢地将培养基直接加在盖玻片上方。若将培养基加在培养皿远离盖玻片的一侧，可能导致盖玻片及其上方的胶原盖层脱落。为获得最佳结果，上述每一步均需谨慎操作。

近几十年来，出现了多种用于研究上皮形态发生的培养模型，其中许多涉及完整器官或器官外植体的ex vivo

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
聚二甲基硅氧烷（PDMS）	埃尔斯沃思粘合剂	Sylgard 184
PDMS 固化剂	埃尔斯沃思粘合剂	Sylgard 184
光刻图案化硅模板	自制	N/A
塑料称量船	Fisher Scientific	08-732-115
直径100毫米的培养皿	BioExpress	D-2550-2
乙醇 200 证明	Pharmco-Aaper	111000200	通过将乙醇与dH₂O按体积比混合，配制70%的乙醇（v:v）溶液2O
剃刀刀片	American Safety Razor	620179
1:1 达尔伯克’s 改良伊格尔’s 培养基：Ham’DMEM/F12（1:1）营养混合物	Hyclone	SH30023FS
胎牛血清（FBS）	Atlanta Biologicals	S11150H
10x Hank’Hank's 平衡盐溶液 (HBSS)	Life Technologies	14185-052
胰岛素	Sigma Aldrich	I6634-500MG
庆大霉素	Life Technologies	15750-060
10×磷酸盐缓冲液（PBS）	Fisher Scientific	BP399-500
氢氧化钠（NaOH）	Sigma Aldrich	221465-500G
牛I型胶原蛋白（非胃蛋白酶处理）	Koken	IAC-50
牛血清白蛋白（BSA）	Sigma Aldrich	A-7906
弯曲不锈钢镊子	Dumont	7
35 mm 直径组织培养皿	BioExpress	T-2881-6
15 ml 离心管	BioExpress	C-3394-2
1.5 ml Eppendorf Safe-Lock 管	USA Scientific	1615-5500
直径15毫米的圆形1号玻璃盖玻片	Bellco Glass 公司	特殊订单
0.05% 1x 胰蛋白酶-EDTA	Life Technologies	25300-054
多聚甲醛	VWR	100503-916
Triton X-100	Perkin Elmer	N9300260	去垢剂
HGF	Sigma Aldrich	H 9661	重悬于 dH₂O 中2O，50 mg/ml
兔抗小鼠FAK抗体	Life Technologies	AMO0672
山羊抗兔 Alexa 488 抗体	Life Technologies	A-11034
Adobe Photoshop	Adobe	N/A	用于对像素频率图进行颜色编码。
FIJI（ImageJ）	美国国立卫生研究院	N/A	用于阈值处理、图像配准和叠加以生成像素频率图的免费图像分析软件。StackReg 插件用于二值图像的配准。