工程三维上皮组织细胞外基质中嵌入

Summary

该原稿描述了软基于光刻技术工程师三维（3D）的均匀阵列由细胞外基质包围限定的几何形状的上皮组织。这种方法是适合于多种细胞类型和实验的上下文，并允许对于相同重复的高通量筛选。

Abstract

肺、肾、乳腺等分支器官的结构是通过分支形态发生的发育过程产生的，该过程受微环境中各种可溶性和物理信号的调节。这里描述的是一种通过形成完全嵌入细胞外基质 （ECM） 中确定形状和大小的工程化三维 （3D） 上皮组织来研究分支形态发生过程的方法。这种方法能够形成相同组织的阵列，并能够控制各种环境因素，包括组织几何形状、间距和 ECM 组成。该方法还可以与牵引力显微镜 （TFM） 等广泛使用的技术相结合，以获取有关细胞与其周围 ECM 之间相互作用的更多信息。该方案可用于研究分支形态发生以外的各种细胞和组织过程，包括癌症侵袭。

Introduction

支上皮组织，称为分支形态的发展，是由细胞衍生的，物理的和环境因素调节。在乳腺，分支形态是通过该引导集体细胞迁移创建树形结构一个迭代过程。第一步是从乳管主芽的形成，其次是分支起始和延长^1,2。分支的侵入周围基质是由类固醇激素在青春期的全身性释放诱导。新的主芽，然后从现有分行的两端发起，而这个过程继续创造上皮树^3。虽然许多重要的生化信号已经确定，指导这个复杂的发展过程，目前缺乏细胞生物学机制的全面了解。此外，在特定的线索的影响机理研究难以从experi解构体内 ments，因为精确时空扰动和测量常常是不可能的。

三维（3D）培养技术，例如全器官培养，主要类器官和细胞培养模型，是系统地研究组织形态^4-6的基本机制的有用工具。这些可以用于确定特定因素的影响单独，例如机械力和生化信号，对各种细胞的行为，包括迁移，增殖和分化的是特别有用的^。6工程化细胞培养模型，特别是容易使扰动的单个细胞和它们的微环境。

一个这样的养殖模式使用基于微细加工的方法来工程师控制的三维结构模型的乳腺上皮组织在与一个感应一贯和可重复形成集体迁移分支机构ppropriate生长因子。模型的主要优点是能够精确地操纵和测量的物理和生化因素，如机械应力的模式，具有很高的统计置信的影响的能力。该技术中，用计算模型一起，已经被用来确定物理和生化信号的乳腺上皮组织和其它支上皮^7-11的正常发展的指导的相对贡献。这里介绍的是用于构建这些模型的组织，它可以被容易地扩展到其它类型的细胞和细胞外基质（ECM）凝胶的详细协议，其用作治疗剂的测试的潜在工具。

Protocol

1.溶液的制备

1. 以制备胰岛素的5毫克/毫升的溶液， _用蒸馏水用5mM盐酸（HCl）稀释粉末胰岛素库存（500毫克胰岛素在100ml溶剂）。制备100ml加入50μl浓HCl至100ml蒸馏水溶剂（DH ₂ O）。
2. 使PBS的1倍溶液，稀释10倍磷酸盐缓冲盐水（PBS）原液在无菌条件下与卫生署₂ O至1倍。
3. 制备聚二甲基硅氧烷（PDMS）弹性体溶​​液如下:1（重量:重量）的比例与PDMS的预聚物在10固化剂混合在一起。
4. 制备细胞培养基如下:向500 ml储备Dulbecco氏改良Eagle培养基中:营​​养混合物F-12（DMEM / F-12），加入10毫升无菌胎牛血清（FBS），500微升庆大霉素试剂，和500微升5毫克/毫升的胰岛素。
5. 以在1×PBS溶液制备1％牛血清白蛋白（BSA），加入1％（重量:V）BSA粉液为1x PBS调匀。
6. 以制备中和的牛I型胶原蛋白的一个4毫克/毫升的溶液，加入50微升10×Hank氏平衡盐溶液（HBSS）缓冲液，30微升的0.1N氢氧化钠（NaOH），30微升的细胞培养基，和400微升库存胶原在激冷1.5 ml离心管。吹打向上和向下慢慢搅拌;避免引入气泡。要删除任何气泡，短暂离心在4℃混合物。
7. 4（V:V）在1X PBS稀释16％多聚甲醛1准备固定液。
8. 通过稀释股票核标签解决方案1准备核标签解决方案:1000（体积比）在1X PBS。
9. 洗涤剂:由1×PBS中的0.3％（体积v）的混合制备的0.3％的磷酸盐缓冲的盐水和洗涤剂（PBST）溶液。
10. 准备通过稀释山羊血清1点10分（体积:体积）封闭缓冲液在0.3％的PBST。
11. 通过稀释PRI制备用于感兴趣的特定蛋白质的初级抗体溶液玛丽抗体（例如，兔抗粘着斑激酶（FAK））1:200（体积比）在封闭缓冲液。
12. （:v v）的封闭缓冲液1000:通过稀释的荧光探针缀合的抗体（例如，山羊抗兔）1制备二级抗体溶液。

2.制备弹性邮票的三维微图案

注意:弹性邮票与PDMS制成。

1. 使在相同的比率的PDMS溶液如步骤1.3中所述调匀。放置在真空腔室中的混合物15-30分钟，以除去在混合过程中引入的任何气泡。
2. 倾脱气溶液到塑料称重舟或包含被光刻具有期望的几何形状的特征图案的硅主培养皿。为了达到最佳效果，治愈60℃的PDMS溶液〜12小时。
   注:硅主人是高度可定制的;该协议采用矩形结构与尺寸50微米×200微米×50微米间隔200微米的距离。硅主人可以使用标准的光刻技术制成。简言之，将环氧类光致抗蚀剂旋涂在硅晶片的顶部。详述所需印章特征的掩模放置在光致抗蚀剂涂覆的晶片，然后将其暴露于UV光的顶部。没有被掩模所需要的特性被暴露于光，并在这些位置上的光致抗蚀剂变成交联的，而该光致抗蚀剂涂层的其余部分是可溶的，并且可以被冲走。
3. 后与PDMS已经围绕期望特征固化的硅母，从塑料容器中取出的PDMS和掌握。仔细分离从硅晶片与PDMS和从周围使用干净的刀片压印特征除去过量的PDMS。
4. 现在切断与压印特征成单个矩形邮票（〜8毫米×5毫米）用刀片图案化的PDMS。存储在这些CLE功能朝上一毫米直径100培养皿。
5. 此外，可使用在步骤1.3中所述的硅橡胶溶液，以使支撑件为矩形邮票。
6. 使用旋涂器，涂布在一个100毫米直径的培养皿〜2-3克的PDMS溶液均匀的，并在60℃下作为在步骤2.1固化〜12小时的PDMS。然后，用刀片，切的PDMS薄层成矩形（约5毫米×2mm）的。
   注:需要在步骤2.3每笔PDMS邮票两个支撑。支撑可被存储在包含PDMS的邮票100毫米直径的培养皿。
7. 与PDMS邮票和载体可用于细胞培养之前，使用在生物安全柜吸气器（细胞培养罩）通过在70％乙醇和干浸没消​​毒。

3. 3D上皮组织的制备

1. 在生物安全柜，大约50微升在PBS中的1％BSA的液滴添加到每张邮票的顶部。放置覆盖邮票液滴在4℃迷你4小时的妈妈，以确保的BSA吸附到印模表面。
2. 从PDMS邮票吸BSA解决方案。
3. 用细胞培养基（每洗涤50微升每邮票应足够）洗邮票的表面两次，每次洗涤后吸出。
4. 手柄采用弧形不锈钢镊子消毒PDMS邮票和支持。在生物安全柜，奠定了35毫米直径的一种组织培养皿每个PDMS邮票。在每个培养皿中，放下的距离比PDMS邮票的长度略小于分开的两个PDMS支撑。
5. 使用镊子，灭菌许多圆形盖玻片（15毫米直径，＃1），为有用70％的乙醇的PDMS邮票。吸从盖玻片多余的液体，同时与镊子保持它们。存放洗净盖玻片在一个单独的100毫米直径的培养皿。
6. 免除〜50微升胶原混合物的均匀涂层的每个的表面PDMS印模。
7. 捡起每个胶原涂覆PDMS压模与镊子和轻轻颠倒它们。降低对PDMS的顶部倒邮票支持布置在毫米直径35的组织培养抛出，使得胶原是印模和组织培养皿的底部之间。孵育的菜在37℃下30分钟。
8. 免除〜50微升剩余胶原混合物到每个圆形盖玻片（后，它们将被放置在工程化组织的顶部以完全封装它们在胶原蛋白），并在37°C孵育他们30分钟。
9. 在获取〜40％汇合含有上皮细胞（例如EpH4小鼠乳腺上皮细胞）一毫米直径100组织培养皿。吸出细胞培养基，并用10毫升1×PBS洗涤一次。 2毫升胰蛋白酶添加到细胞中，并在37°C孵育5-10分钟。
10. 8毫升新鲜培养基的加入含有胰蛋白酶的细胞，从盘分离任何剩余的贴壁细胞的组织培养皿。通过移液轻轻混合和细胞混合物移至15毫升锥形管中并离心，在100×g下5分钟。
11. 吸从锥形管的上清，重悬在细胞培养基中细胞沉淀。使用血细胞计数器，计数细胞来确定悬浮液的浓度。调节悬浮液体积，得到10 ⁶ -10 ⁷个细胞/ ml的〜的终浓度。
12. 从培养箱中取出凝胶状胶原样品。使用镊子，轻轻抬起PDMS邮票径直向上从成型胶原蛋白分离他们丢弃。
13. 免除〜30微升浓缩细胞悬浮液在含所需的几何形状的模制腔各胶原凝胶的表面上。观察是10X / 0.25 NA目标的明显微镜下的细胞，同时轻轻摇晃的菜一边到另一边，以促进细胞的腔体内沉淀。空腔应该〜5分钟内被填充。
14. 在Remove过量细胞从空腔周围，在其一侧倾斜每个组织培养皿和胶原凝胶的表面上轻轻地免除〜400μl的细胞培养基。吸出液体，并重复洗涤1-2次，检查在显微镜下胶原凝胶在每次洗涤之间。
15. 后过量细胞已经从围绕在胶原模具填充细胞的空腔清零，放在组织培养皿到细胞培养孵化器在37℃下15分钟。然后，使用镊子，轻轻颠倒胶原涂层类盖玻片并将其放置在充满细胞胶原的模具，使得从盖玻片胶原形成在填充细胞腔的盖的顶部。孵育样品在37℃下15分钟。
16. 一旦胶原帽已经粘附到填充细胞胶原模具，慢慢分配〜2-2.5毫升细胞培养基通过在凝胶顶部的玻璃盖玻片。培养在37℃下1-3天的样品。
    注意:最初的接种后24小时，在上皮组织可以与生长因子如表皮生长因子（EGF）或肝细胞生长因子（HGF）以诱导分枝进行处理。

4.免疫荧光和图像分析

1. 吸从组织培养皿的细胞培养基，并添加足够的固定液以覆盖含细胞的凝胶。在室温下孵育的菜15分钟上以200rpm的摇床上。
2. 吸出固定液，填充用1×PBS的组织培养皿，并以200rpm在室温下孵育15分钟振荡器上。三总洗两次重复。
3. 从组织培养皿中吸出PBS并用Hoechst液代替:标记细胞核 。在室温下孵育15-20分钟。染色的斑或其他标记，它与抗体检测，跳到步骤4.5。
4. 吸出核标记溶​​液和洗涤含细胞接枝埃尔斯用1×PBS三次如步骤4.2。染色样品可以储存在1×PBS中在4℃直至进一步使用。
5. 染色为目的蛋白质:从组织培养皿吸出PBS，加入300微升0.3％的PBST，并孵育在室温下将样品15分钟。
6. 吸出PBS，盖用封闭缓冲液的凝胶，并孵育在室温下〜4小时的摇床（200转）。
7. 吸出封闭缓冲液，盖上初级抗体溶液中的凝胶，并在4℃下在200rpm的摇床上孵育过夜。
8. 吸出第一抗体溶液，加入0.3％PBST溶液，并在室温下在200rpm的摇床上孵育30分钟。吸出PBST和重复每30分钟3-4小时。
9. 重复步骤4.7和4.8，此时用二级抗体溶液孵育。包裹组织培养皿用铝箔，以防止二次抗体的光漂白。国际泳联后l水洗，染色样品可以储存在1×PBS中在4℃直至进一步使用。
10. 为了形象化的样品，使用10X / 0.30 NA目标集中于上皮组织的平面。
11. 为了形象化细胞核，标记用在紫外光照射下一个10X / 0.30 NA目标的核标记图像固定样本。
12. 为了显现染色上使用倒置荧光显微镜10X / 0.30 NA物镜的所关注的蛋白质，图像样本。
13. 来创建相同的初始几何形状的多个组织（一般为50或以上）的蛋白质染色的频率图，第一​​进口分别使用标准图像分析软件的图像（见材料）并将其转换为8位灰度。
14. 阈值这些图像，通过定义一个灰度分界点把它们转换成二进制文件（ 即半色调/黑白）;低于阈值的灰度值变成黑色，并与上述的阈值变成白色。然后，结合每个单独的二进制图像成单个图像栈。
15. 接下来，注册堆叠图像（ 即对齐或与它们匹配）的分析软件。许多图像分析软件包都配有免费提供注册插件。
    1. 在一个堆使用每个图像作为下一图像的对准模板，以使得在整个堆叠中的图像由传播对齐。最后，覆盖（项目）的基础上平均强度在对准图像堆栈的图像，以形成与像素频率映射的单个图像。然后，该图像可以是彩色编码的使用选择^10,11图像编辑软件。

Results

乳腺上皮组织微细化一般原理

的微细加工程序概述了实验工作流的一般原理图如图1所示。最终的结果是被完全嵌入的ECM凝胶中相同的几何形状和间距的上皮组织的阵列。代表性实验采用牛I型以4毫克/毫升的浓度胶原凝胶培养EpH4小鼠乳腺上皮细胞。为了确保工程组织的最高质量，在协议中列出的技术应密切随访。已被塑造成一种矩形井阵列图2A和2B展示低和高放大倍率的意见胶原蛋白之前，细胞接种凝胶。孔的形状是由在硅主特征的形状决定。它解除个很重要ÈPDMS模具从胶原直线上升以免扭曲腔的几何形状。 图2C示出了在型矩形孔I型胶原已填充有乳腺上皮细胞（过量的细胞已被洗掉了胶原的表面）的凝胶。在本实施例中，每个为200μm×50微米的矩形孔含有大约80-100的细胞。

Discussion

上述方案概述了一种产生预定义形状的相同上皮组织的方法，从而能够对组织中细胞所经历的机械应力进行空间控制。弹性模具用于在 I 型胶原蛋白中创建空腔，然后用上皮细胞填充并覆盖额外的胶原蛋白层，使细胞完全封装在 3D 胶原蛋白基质环境中。这些组织的进一步培养和用生长因子处理以诱导初始结构的分支，使该系统适用于研究上皮细胞的分支形态发生。协议中有几个关键步骤。第一种是在细胞接种之前将 PDMS 模具从凝胶胶原蛋白中直接向上提起。在此步骤中的任何水平移动都会使型腔变形，并且它们将不再保留所需的几何形状。然后，在空腔接种细胞后，重要的是要仔细洗掉残留在表面的任何多余细胞，因为这些细胞可能会干扰图案组织的行为，特别是当它们非常靠近组织时。然而，清洗过于严格可能会导致细胞被冲出空腔。最后，在将含细胞的胶原蛋白凝胶浸入培养基中的最后微图案化步骤中，重要的是缓慢地将培养基直接添加到盖玻片的顶部。在培养皿侧面远离盖玻片的地方添加培养基可能会导致盖玻片和胶原蛋白盖脱落。每个步骤都需要小心执行才能达到最佳效果。

在过去的几十年里，出现了几种用于研究上皮形态发生的培养模型，其中许多涉及完整器官或器官外植体的 ...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
聚二甲基硅氧烷 （PDMS）	安士澳胶粘剂	Sylgard 184
PDMS 固化剂	安士澳胶粘剂	Sylgard 184
平版印刷图案硅母	模自制	N/A
塑料称重船	Fisher Scientific	08-732-115
100 毫米直径培养皿	BioExpress	D-2550-2
乙醇 200 Proof	Pharmco-Aaper	111000200	dH2O 混合制成 70% 乙醇 （v：v） 溶液
	美国安全剃须刀	620179
1：1 Dulbecco's 改良鹰's 媒介 ： 火腿's F12 营养混合物 （DMEM/F12） （1：1）	Hyclone	SH30023FS
胎牛血清 （FBS）	亚特兰大生物制品	S11150H
10x Hank's 平衡盐溶液 （HBSS）	Life Technologies	14185-052
胰岛素	Sigma Aldrich	I6634-500MG
庆大霉素	Life Technologies	15750-060
10x 磷酸盐缓冲盐水 （PBS）	Fisher Scientific	BP399-500
氢氧化钠 （NaOH）	Sigma Aldrich	221465-500G
牛I 型胶原蛋白（非胃蛋白酶化）	Koken	IAC-50
来自牛血清的白蛋白 （BSA）	Sigma Aldrich	A-7906
弯曲不锈钢镊子	Dumont	7
35 毫米直径的组织培养皿	BioExpress	T-2881-6
15 ml 锥形管	BioExpress	C-3394-2
1.5 ml EppendorfSafe-Lock Tube	USA Scientific	1615-5500
圆形 #1 玻璃盖玻片，直径 15 毫米	Bellco Glass Inc.	特别订购
0.05% 1x 胰蛋白酶-EDTA	Life Technologies	25300-054
多聚甲醛	VWR	100503-916
Triton X-100	Perkin Elmer	N9300260	洗涤剂
HGF	Sigma Aldrich	H 9661	以 50 mg/ml 重悬于 dH2O 兔
抗小鼠 FAK 抗体	寿命技术	AMO0672
山羊抗兔 Alexa 488 抗体	Life Technologies	A-11034
Adobe Photoshop	Adobe	N/A	用于像素频率图的颜色编码。
FIJI （ImageJ）	NIH	N/A	免费图像分析软件，用于阈值、配准和叠加图像以创建像素频率图。StackReg 插件用于注册二进制图像。