本文介绍一种简单快速的基于纸张的DNA提取方法，用于从全血中提取HIV前病毒DNA，并通过定量PCR进行检测。该方法可拓展应用于其他遗传标志物的检测，或结合其他扩增技术使用。
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本文内容
摘要
摘要
核酸过滤分离法（FINA）是一种新型提取方法，通过分离膜和吸水垫实现垂直过滤，可在不到2分钟内从全血中提取细胞DNA。将血液样本用去垢剂处理后短暂混匀，并用移液器加至分离膜上。裂解液在毛细作用下渗入印迹垫，使基因组DNA被捕获在分离膜表面。在简单的洗涤步骤中，PCR抑制物随液体被吸入吸水垫，而提取的DNA则保留在膜上。含有捕获DNA的膜可直接加入PCR反应体系，无需进一步纯化。该方法操作简便，无需特殊实验设备，仅需廉价的实验耗材即可实施。本文介绍了一种以100 µl全血中HIV-1前病毒DNA的高灵敏度检测与定量为例的实验方案，可作为婴幼儿早期HIV诊断的模型，并可轻松适配于其他遗传靶标。
引言
已有若干研究报告探讨了用于即时检测（POC）设备的基于纸张或膜的提取方法1-5，旨在使分子诊断所具备的高度敏感性和特异性能够惠及所有人。世界卫生组织（WHO）性传播疾病诊断倡议提出了“ASSURED”这一术语，用以描述理想的POC检测应具备的特征，即：可负担性（Affordable）、高敏感性（Sensitive）、高特异性（Specific）、操作简便（User-friendly）、快速且稳健（Rapid and Robust）、无需设备（Equipment-free）以及可送达需要者手中（Delivered to those who need it）6。在这些指导原则中，分子诊断要实现“无需设备”这一特性尤为困难。然而，该领域的每一项创新都将推动实现服务最需要人群的目标，通过改进现有技术，有望在短期内提升检测性能7。
本文介绍一种从全血中提取DNA的简单方案，该方案无需复杂的化学试剂或实验室仪器。FINA（核酸过滤分离）样本制备方法最初是为了从全血中提取白细胞DNA而开发的，旨在作为资源有限地区婴幼儿早期诊断（EID）现场即时定量PCR（qPCR）平台中检测HIV-1前病毒的一部分8-11。FINA提取法不同于传统的纯化方法，后者通常在变性剂存在下利用二氧化硅膜或包被二氧化硅的顺磁性微粒可逆地结合DNA12。相反，FINA通过分离膜进行垂直过滤，直接从全血中提取细胞DNA。含有截留DNA的膜可直接放入PCR管中，既可立即用于PCR反应，也可风干后用于后续扩增9。样本提取过程中不使用变性剂、苯酚或醇类，从而避免了为去除提取过程中产生的强效qPCR抑制物所需的大量洗涤步骤13,14。
FINA 膜可在样本加入膜之前捕获细胞9，或捕获细胞裂解后释放的基因组 DNA11。对于细胞捕获，可将全血直接加入膜上。随后通过加入 10 mM NaOH 在膜上裂解细胞。该方法的优点是仅包含三个步骤：1）样本添加；2）细胞裂解/洗涤；3）将滤膜圆片置入 qPCR 管中。该方法的缺点是膜所能直接承载的细胞数量有限，且与膜圆片的直径成正比。为达到早期婴儿诊断（EID）所需的检测下限，需输入 100 µl 全血，但这需要使用过大而无法放入 qPCR 管的滤膜。在将样本加入收集膜之前，先用去垢剂裂解血细胞，虽增加了一个处理步骤，但可使相同样本量使用更小的滤膜。我们已证实，采用此种检测配置，可从 100 µl 血液中实现 HIV-1 前病毒 DNA 低至 10 个拷贝的高重复性、单拷贝检测与定量11。
在本报告中，我们介绍了最初为实验室使用而开发的FINA方案。这种被称为FINA样本制备模块的膜/滤膜夹心结构可批量制备并储存以备后续使用。当需要提取样本时，该过程仅需2分钟，且可按不同批量进行操作。qPCR可立即进行，也可将含有嵌入DNA的滤膜保存，待方便时再进行qPCR检测。该方法在资源有限和高资源环境中均非常适合样本的常规分析。
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方案
伦理声明：本研究中使用的全血标本不被视为涉及人类受试者的研究。这些标本是为临床诊断目的而采集的，在完成临床检测后，剩余部分被用于FINA研究检测。标本经过编码处理，研究人员无法轻易确定个体的身份。
1. FINA 样品制备模块的准备
- 通过裁剪一块 35 × 35 mm2、厚度为 2.6 mm 的 100% 棉质垫作为吸水垫。每个样本准备一块垫片。
- 通过裁剪一段石蜡膜（25 mm（高）× 50 mm（宽））并使用冲孔锤在带纸背衬的石蜡膜中心冲出一个直径为 7.14 mm 的孔，制备带纸背衬的塑料石蜡膜胶带。每个样本准备一条胶带。
- 使用冲孔锤冲出一个直径为 8.35 mm 的圆片，制备固定化玻璃血液分离膜（捕获膜）圆盘。每个样本冲取一个圆盘。该圆盘具有 2.3 µm 的颗粒截留能力。
- 使用镊子将捕获膜圆盘置于吸水垫中心，组装 FINA 样本制备模块。将石蜡膜胶带覆盖在捕获膜圆盘上，使石蜡膜上的孔洞暴露捕获膜圆盘的中心区域。
- 通过轻微拉伸石蜡膜胶带使其覆盖整个吸水垫，并用力按压石蜡膜胶带，使其在圆盘四周牢固粘附于吸水垫，以确保圆盘与吸水垫之间实现最大程度的接触。
- 根据实验需要制备足够数量的模块，或储备以供将来使用。
2. qPCR 管的准备
- 准备一个5.1 mm的胶带圆片，用于将细胞捕获膜固定在qPCR管侧壁，以防止膜阻碍荧光检测。使用冲压锤从双面涂覆的聚酯诊断胶带片材上冲出圆形胶带圆片。每个样本准备一个胶带圆片。
- 移除胶带一侧的贴纸衬垫。将胶带放入一个200 µl的PCR管中，粘贴在管壁一侧并靠近管底。移除第二层贴纸衬垫。此时，该PCR管已准备好接收制备好的圆片。
- 根据实验需要制备相应数量的PCR管，或批量制备以供将来使用。
3. 制备血液样本
注意：如果正在准备真实的测试样本，请继续执行步骤 4。
- 解冻含有单拷贝HIV-1前病毒的8e5-LAV细胞15，该细胞来自病毒学质量保证实验室（VQA；Rush Presbyterian/St. Luke's Medical Center，芝加哥，伊利诺伊州）。
注意：细胞以冷冻细胞沉淀形式保存，浓度为4,000个细胞/µl。细胞计数已如前所述进行验证9。 - 在冻存液（90%胎牛血清，10%二甲基亚砜）中进行系列稀释，浓度范围为1至400个细胞/µl。
- 从每一系列稀释液中吸取10 µl细胞，加入微量离心管中。向每管中加入100 µl新鲜的HIV-1阴性EDTA抗凝全血样本，以建立8e5-LAV拷贝数为10–4,000的标准曲线。轻轻弹击管底5次，充分混匀。
4. 进行 FINA 提取
- 通过加入 Triton-X100 裂解血细胞，使其终浓度为 1%（将 11 µl 10% Triton-X100 加入 110 µl 第 3.3 步的全血及细胞中）。
- 轻轻弹击管底 5 次以混匀。血液应变为半透明的红色。
- 将全部血液样本用移液器加至捕获膜盘上。
注意：石蜡胶带与捕获膜之间必须形成密封，以确保血液流经膜；捕获膜与吸水垫组件之间保持良好接触，可确保样本快速毛细渗透。 - 让样本充分渗透滤膜。
注意：由于毛细作用，裂解后的血液渗入吸水垫，基因组 DNA 则被捕获在捕获膜盘表面。当滤膜表面变为无光泽的哑光状时，表明裂解液已完全渗入膜盘。 - 逐滴加入 600–1,000 µl 10 mM NaOH 至捕获膜盘上。
注意：洗涤缓冲液也可一次性加入 600 µl。缓冲液会在疏水性石蜡胶带上形成液滴，并在约 20 秒内通过小孔渗透至膜盘。滤膜颜色将由红色变为白色，表明血红蛋白已被清除。 - 用镊子将膜盘从吸水垫上分离，并将其贴附于已准备好的 PCR 管内的胶带上。若滤膜上仍有红色残留，应在放入 PCR 管前加入 50–100 µl 洗涤缓冲液以清除残留物。
注意：少数情况下，在 FINA 模块制备过程中施加过大的压力，可能导致膜层在与吸水垫分离时发生分层。此类膜盘应弃用，并重新制备新样本。 - 将滤膜放入 PCR 管后，应立即进行样本分析。或者，也可将其置于含硫酸钙干燥剂的容器中过夜干燥，然后盖上管盖，放入含硅胶干燥剂的铝箔袋中保存，待分析时取出使用。
5. qPCR 反应
- 根据先前所述方法 9,11，使用HIV特异性引物和探针配制每反应100 µl的qPCR预混液。需包含内参扩增对照，以监测扩增抑制物的存在，并确认阴性样本为真实阴性。确保滤膜完全被预混液覆盖，并在整个反应过程中保持滤膜固定于管壁。
- 按照先前描述的方法 9，使用实时PCR仪进行扩增。
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结果
从掺入8e5-LAV细胞的全血中提取前病毒DNA的工作流程如图1所示。图2展示了FINA样本模块及准备好的qPCR管。该方法可高效扩增不同拷贝数的8e5-LAV细胞中的HIV-1前病毒，人工样本的标准曲线结果如图3所示。根据公式Efficiency = -1+10(-1/slope)计算，PCR扩增效率为103%。标准曲线的线性方程为y = -3.25x + 27.95，相关系数R² = 0.996。HIV前病毒DNA标准曲线的重复样本也表现出高度可重复的扩增效果，如表1所示。此外，每份样本均含有500拷贝的羟基丙酮酸还原酶作为内参对照，以证明使用FINA从血液中提取DNA不会导致PCR抑制，且该结果与HIV-1前病毒拷贝数无关（图4）。在所检测的18个样本中，内参均实现高效扩增，平均Cq值为21.92 ± 0.25，变异系数（CV）为1%。
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讨论
已有研究表明，与快速获得治疗机会相关的早期诊断（EID）可降低因HIV感染导致的婴儿死亡率16。由于母体抗体可在婴儿血液中持续存在，快速HIV抗体检测在判断HIV暴露婴儿感染状态时作用有限。世界卫生组织（WHO）建议，所有HIV-1阳性母亲所生的婴儿均应在出生后4至6周时采用病毒学检测方法进行检测17。我们此前已报道开发了一种可检测和定量全血样本中HIV-1前病毒DNA的检测方法，该方法在针对61名南非婴儿的小规模现场评估中，实现了单拷贝检测，灵敏度和特异性均达到100%11。可通过指尖或足跟采血获取100微升或更多的全血样本，并利用FINA模块进行处理18,19。这些血液样本在扩增前可至少保存一个月，因此该方法特别适用于远离实验室地区的婴儿检测。
在图3所示的研究中，展示了使用HIV-1阴性全血样本并加入携带HIV-1前病毒DNA的冻融细胞所构建的标准曲线。本研究的一个局限性在于，由于冻融过程，部分添加至样本中的细胞可能已经裂解，这可能会提高靶标的检出水平。更...
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
本方案的开发得到了比尔和梅琳达·盖茨基金会全球健康大挑战项目资助（资助号：37774）。实时 PCR 试剂和相关建议由位于伊利诺伊州德斯普莱恩的雅培分子公司（Abbott Molecular Inc.）提供。8E5-LAV 细胞由拉什长老会圣卢克医疗中心（Rush Presbyterian; St. Luke's Medical Center）病毒学质量保证实验室提供。HIV-1 阴性血液由位于伊利诺伊州埃文斯顿的北岸大学健康系统（NorthShore University HealthSystems）核心实验室提供。感谢 Mark Fisher 在摄影方面提供的帮助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| Fusion 5 | GE Healthcare Life Sciences | 8151-9915 | |
| 707 转印垫 | VWR International | 28298-014 | |
| PARAFILM M | VWR International | 52858-000 | |
| 3M 双面涂覆聚酯诊断胶带 | 3M Medical Specialties | 9965 | |
| 200 µl qPCR 条形管 | Agilent | 401428 | |
| 光学封口条 | Agilent | 401425 | |
| Mx3005p qPCR 系统 | Agilent | 401456 | |
| 氢氧化钠 | Sigma-Aldrich | 221465 | A.C.S. 试剂 |
| 吐温 X-100 | Sigma-Aldrich | T9284 | BioXtra |
| 二甲基亚砜 | Sigma-Aldrich | D8418 | 分子生物学级 |
| 胎牛血清，经认证，美国来源 | Thermo Fisher Scientific | 16000-044 | |
| 锤击式小孔打孔器，3/16" 孔径（5.1 mm） | McMaster Carr | 3424A16 | |
| 锤击式小孔打孔器，1/4" 孔径（7.14 mm） | McMaster Carr | 3424A19 | |
| 锤击式小孔打孔器，5/16" 孔径（8.35 mm） | McMaster Carr | 3424A23 |
参考文献
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