核酸的分离过滤:一种简单快速的DNA提取方法

摘要

在这里，我们描述了一个简单，快速的基于纸张的DNA提取的HIV前病毒DNA的全血通过定量PCR检测方法。这种协议可以在检测其他遗传标记或使用替代的扩增方法被扩展为使用。

摘要

FINA，核酸过滤分离，是通过分离膜和吸收垫利用垂直过滤提取从全血细胞的DNA，在不到2分钟的新颖的提取方法。血液检体与洗涤剂，短暂混合处理，并用移液管施加到分离膜。溶解物芯吸入印迹垫由于毛细管作用，捕捉分离膜的表面上的基因组DNA。期间的简单的洗涤步骤，其中PCR抑制剂是恶进入吸湿印迹垫提取的DNA被保留在膜上。然后将含有包埋的DNA的膜被加入到没有进一步纯化的PCR反应。这种简单的方法不需要实验室设备，并可以用廉价实验室用品很容易地实现。在这里，我们描述了从100微升全血中HIV-1前病毒DNA的高度敏感的检测和定量的协议作为一种模式在早期艾滋病毒的FANT诊断，可以容易地适用于其他遗传靶。

引言

若干报告已经与使精美灵敏度和分子诊断的特异性可用于所有的目的讨论了点- -关心（POC）装置^1-5的造纸或膜-基于提取方法中使用的开发。世界卫生组织（WHO）性传播疾病诊断倡议创造ASSURED（价格实惠，敏感，特异，用户界面​​友好，快速和强大，装备自由并交付给那些谁需要它）来描述理想的POC的特征词测试^6。这些准则的免费装备，特点是特别具有挑战性，以实现分子诊断。然而，在该领域的每一次创新将推动实现这些最需要的目标，并有通过调整现有的技术⁷是希望短期内改善测试性能。

这里介绍一个简单的协议，用于从全血中提取DNA不需要复杂的化学或实验室仪器。国际泳联（核酸过滤隔离）的样品制备方法最初是提取全血白细胞DNA，以检测HIV-1前病毒定量PCR样品到答案点保健（POC）的一部分（定量PCR）婴儿早期诊断（EID）平台，在资源有限的设置^8-11使用。 FINA提取不同于其中使用二氧化硅膜或氧化硅-包被的顺颗粒在离液剂¹²的存在下可逆地结合DNA常规纯化方法。相反，国际泳联采用立式过滤通过分离膜直接提取全血细胞DNA。含有包埋的DNA的膜可以直接在PCR管放置并且立即在购买扩增⁹干燥的PCR反应或空气中。没有离液剂，苯酚或醇是在样品提取使用，elimina婷去除提取过程^13,14衍生有力的qPCR抑制剂需要大量洗涤步骤。

国际泳联膜可以捕获样品被添加到膜之前通过细胞裂解¹¹解放或细胞⁹或基因组DNA。用于小区捕获，全血直接加入到该膜。细胞随后在膜中加入10毫摩尔的NaOH裂解。这种方法的优点是，它仅涉及3个步骤:1）加入样品; 2）细胞裂解/洗3）过滤盘放置在定量PCR管。这种方法的缺点是，该膜只能容纳一个定义单元成正比的膜盘的直径的数量。为了达到为EID所需的检测的限制，将100μl的全血需要这需要一个过滤器，过大，被放置在qPCR的管样品输入。裂解血细胞用洗涤剂添加样品到集合前膜增加了一个处理步骤，但允许对同一样本大小使用较小的滤波器。我们能够证明高再现性，单拷贝检测，并从100微升的血液使用这种测试配置¹¹的HIV-1原病毒DNA的少至10个拷贝的定量。

在这份报告中，我们描述最初实验室使用开发的国际泳联协议。称为FINA样品制备模块的膜/滤膜夹层可以大批量制备，并储存起来以备后用。当试样被提取这个过程需要2分钟，并可以在不同大小的批次进行。在定量PCR可立即运行或包含嵌入DNA中的过滤器可以被存储直到它方便执行定量PCR。这种方法是用于在低和高资源设置标本常规分析非常方便。

方案

伦理声明:在本研究中使用的全血标本不被认为是涉及人类受试者的研究。用于临床诊断目的，这是满足了获得的样本，并为FINA研究测定提供这些试样的剩余部分。试样进行编码，使得研究者不能够容易地确定个人的身份。

1.国际泳联样品制备模块的研制

1. 准备用切割35×35毫米2.6 ^平方毫米厚的100％化妆棉吸水垫。切标本每一个焊盘。
2. 制备塑料石蜡膜与纸背衬带通过切割片石蜡膜（25毫米（H）乘50毫米（宽）），然后冲压在用锤子驱动打孔器磁带的中心的7.14毫米直径的孔。准备每个试样一个磁带。
3. 冲切8.35毫米直径的圆准备开往玻璃血液分离膜（捕获膜）盘用锤子驱动打孔。冲床每个试样一个磁盘。该盘具有2.3微米的颗粒截留能力。
4. 通过将捕获磁盘中使用镊子的印迹垫的中心组装FINA样品制备模块。放置在捕获磁盘石蜡膜带，使得石蜡带的孔离开露出的捕获盘的中心。
5. 通过稍微拉伸石蜡胶带以覆盖印迹垫并按下石蜡胶带牢固地将其粘到周围的磁盘的所有边缘的印迹垫确保磁盘和印迹垫之间的最大接触。
6. 作为实验所需或储存以备将来使用使尽可能多的模块。

2.定量PCR管的制备

1. 制备5.1毫米磁带磁盘，将细胞捕获膜锚定在定量PCR管的一侧通过冲压双涂聚合α-的圆，以防止膜堵塞荧光检测STER诊断胶带从胶带的片材锤驱动冲头。准备每个试样一个磁带磁盘。
2. 移除胶带的贴衬垫的一侧。磁带放置到200μl的PCR管，粘着其上的一侧和朝向管的底部。删除第二个贴纸衬垫。管是现在准备好接收准备磁盘。
3. 作为实验所需或储存以备将来使用产生尽可能多的管子。

3.图谋血液标本

注意:如果正在准备一个真正的测试样品，继续步骤4。

1. 解冻8E5-LAV细胞窝藏¹⁵从病毒学质量保证实验室获得的HIV-1前病毒的一个副本（VQA;拉什长老/圣路加医疗中心，芝加哥，IL）。
   注意:它们被存储为在4000个细胞/μl浓度的冷冻细胞沉淀。如前面^9中所述细胞计数进行了验证。
2. 准备SER胶质稀释在冷冻培养基（90％胎牛血清，10％二甲亚砜），以浓度范围从1至400个细胞/微升。
3. 吸管10微升细胞从各系列稀释成离心管中。添加100μl的新鲜的HIV-1阴性EDTA处理的全血样品的每个管来创建8E5-LAV拷贝数10-4,000的一个标准曲线。通过轻弹管的底部5次混合。

4.执行国际泳联提取

1. 裂解血细胞中加入的Triton-X100），以1％（11微升10％的Triton-X100至110微升全血和来自步骤3.3的细胞）的最终浓度。
2. 通过轻弹管的底部5次混合。血应该把半透明的红色。
3. 吸取所有的血样到捕获盘。
   注:石蜡带和捕获膜之间的水密封确保了血液流经膜，和捕获微米之间良好的接触embrane和印迹垫组件可确保快速样品排汗。
4. 允许样品通过过滤器浸泡。
   注意:血液溶胞产物灯芯入印迹垫由于毛细管作用，捕捉俘获磁盘的表面上的基因组DNA。当它出现雾的裂解物已浸透到磁盘。
5. 600-1000微升10毫米氢氧化钠逐滴加入到采集磁盘。
   注意:洗涤缓冲液还可以加入作为本体加入600微升。缓冲器将形成疏水性石蜡的磁带上的微滴和通过在大约20秒的孔到盘芯吸。该过滤器会从红色变为血红蛋白的白色显示的间隙。
6. 分开用钳子印迹垫盘和盘适用于制备PCR管的胶带。如果有任何红色留在过滤器中添加50-100微升洗涤缓冲液在管放置之前清除过滤器。
   注意:不经常，编写过程中施加过大压力从印迹垫分离期间在膜中的层的分区的FINA模块的结果。丢弃这些磁盘，并准备一个新鲜的样本。
7. 该过滤器被放置在PCR管后，分析样品的时候了。可替代地，在一个包含框硫酸钙干燥剂干燥过夜，然后盖和地点与二氧化硅干燥剂和存储的箔袋，直到准备用于分析。

5.定量PCR反应

1. 使用HIV特异性引物和探针如前面所述^9,11每准备100反应的qPCR微升主结构。包括内部放大控制并监控扩增抑制剂的存在和验证一个负样品是真阴性。确保过滤器完全覆盖主混合物和该过滤器保持固定到管的侧面整个反应。
2. 使用实时PCR装置如前面所述⁹执行放大。

结果

用于提取从8E5-LAV细胞掺入的全血前病毒DNA的工作流程示于图1， 图2示出了FINA示例模块和制备的qPCR管。这种方法允许从8E5-LAV细胞以不同拷贝数的HIV-1原病毒的有效扩增，如图做作标本（ 图3）的标准曲线。 PCR具有103％的效率，如从效率= 1 + ^{10（-1 /斜率）}计算。线的方程为y = -3.25x + 27.95，与R 2 = 0.996的相关性。艾滋病毒原病毒DNA的标准曲线进行复制也有高度可重复性的扩增，如表1看出。另外，500份的内部对照羟基丙酮酸还原酶的存在是为了表明，有不存在PCR抑制从具有FINA提取血液所得的，独立的数目前HIV-1前病毒的副本（图4）。所有测试的18个样品中被有效地获得的IC扩增，具有21.92±0.25平均CQ和1％的CV值。

讨论

EID联系到快速治疗的访问已被证明是降低婴儿死亡率由于HIV感染^16。由于婴儿的血液母源抗体的持久性，快速的艾滋病病毒抗体测试已确定HIV暴露婴儿的状态用处有限。世界卫生组织建议，出生HIV-1阳性母亲的婴儿都应该在4-6周龄用病毒学测试¹⁷进行测试。我们已经报道HIV-1的原病毒DNA的全血标本中检测和定量，能够单拷贝检测与证实100％的敏感性和特异性的61的中国婴儿¹¹的小字段的评价的测定法的发展。一百微升或更多的全血可以通过手指或脚跟棒被收集并经由FINA模块^18,19进行处理。这些血液样品然后可以扩增使这种方法的ide之前存放至少一个月人测试是远离实验室的婴儿。

在图3中 ，人为标本从HIV-1的负的全血的标准曲线呈现的研究与解冻细胞携带的HIV-1前病毒DNA被描绘尖刺。一个警告这项研究的是，一些加入到样品中的细胞可能已裂解由于冷冻/解冻，这可能潜在地提高靶的检测水平。更严格的实验设计本来已经使用做作这将有更准确地模仿全血新鲜培养细胞标本。

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材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
Fusion 5	GE医疗保健生命科学	8151-9915
707吸墨垫	VWR International	28298-014
PARAFILM M	VWR INTERNATIONAL	52858-000
3M双层聚酯诊断胶带	3M Medical Specialties	9965
200 & micro;l qPCR 试管	安捷伦	401428
光学试管	安捷伦	401425
Mx3005p qPCR 系统	安捷伦	401456
氢氧化钠	Sigma-Aldrich	221465	A.C.S. 试剂
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T9284	BioXtra
二甲基亚砜	Sigma-Aldrich	D8418	用于分子生物学
胎牛血清，认证，美国原产地	Thermo Fisher Scientific	16000-044
锤子驱动的小孔打孔器 3/16"孔径（5.1毫米）	麦克马斯特卡尔	3424A16
锤驱动的小孔打孔器 1/4"孔径（7.14毫米）	麦克马斯特卡尔	3424A19
锤驱动的小孔打孔器 5/16"孔直径（8.35mm）	麦克马斯特卡尔	3424A23