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方法文章

通过成像流式细胞术表征人单核细胞来源的树突状细胞：两种单核细胞分离方案的比较

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DOI：

10.3791/54296

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2016年10月18日

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1Department of Immunology, Herbert Wertheim College of Medicine, Florida International University, 2Millipore Sigma

本文内容

摘要

本研究比较了两种不同的人单核细胞分离方法，以获得 体外 树突状细胞（DCs）。单核细胞通过贴壁法或磁性分离法进行负向富集。将比较两种方法在单核细胞得率和活力，以及MDDC活力、增殖和CD11c/CD14表面标志物表达方面的差异。

摘要

树突状细胞（DCs）是免疫系统中的抗原呈递细胞，在淋巴细胞应答、宿主防御机制以及炎症发生过程中发挥关键作用。由于其独特的特性，树突状细胞的分离与研究在生物医学研究中具有重要意义。尽管它们是免疫系统中重要的关键介质，但树突状细胞在外周血中极为稀少，仅占总单个核细胞的约0.1 - 1%。因此，目前常用的替代方法依赖于从外周血单个核细胞（PBMCs）中分离单核细胞，并进一步将其诱导分化为树突状细胞。在实际操作中，必须综合考虑分离技术的简便性、经济性、细胞纯度和得率。本研究比较了两种不同的树突状细胞生成方法：通过贴壁法或利用磁珠分选技术进行负向富集来分离单核细胞，随后在IL-4和GM-CSF的诱导下将其分化为树突状细胞。通过活细胞染料、MTT法以及成像流式细胞术对单核细胞和MDDC的活力、增殖能力及表型（CD11c/CD14表面标志物）进行了评估。尽管与贴壁法相比，磁珠分选法获得的单核细胞比例显著更高且增殖能力更强，但研究结果表明，两种方法均能在体外培养7天后成功生成具有增殖和分化能力的活的CD11c+ MDDCs。两种方法获得的CD11c+ MDDCs比例均超过> 70%。因此，本研究结果为建立可靠的人源树突状细胞分离与表征方法提供了重要参考。

引言

树突状细胞（DCs）是连接先天免疫系统与适应性免疫系统的关键媒介。它们能够诱导初始免疫应答，并促进免疫记忆的形成。这些细胞主要负责抗原的捕获、迁移以及T细胞的激活，因此被称为专职抗原呈递细胞（APCs）。 1树突状细胞（DCs）的调控可在多种研究领域及临床环境中用于治疗包括HIV在内的不同炎症性疾病 6,7癌症 8，自身免疫性疾病 9以及过敏反应 10树突状细胞还被用于物质滥用研究，以揭示与酒精依赖等相关 yet 未知的机制和通路。 11-14药物依赖 13,15，以及HIV感染与药物滥用的合并情况 16-19这些持续进行的研究以及免疫学领域的未来研究使得 体外 生成树突状细胞对研究极为重要。然而，从人血液中分离树突状细胞存在若干困难，因为它们仅占总血单个核细胞的0.1 - 1% 20.

迄今为止，一些已确立的树突状细胞（DCs）生成方法 体外 由单核细胞的塑料或玻璃黏附组成 21,22密度梯度离心 23基于特异性标志物的分离方法，例如磁性激活细胞分选 22荧光激活细胞分选 24使用葡聚糖包被的磁性纳米颗粒对 CD14+ 单核细胞进行阳性筛选 25以及使用全自动阴性细胞筛选法快速分离高纯度单核细胞 26然而，最佳的选择方法仍存在争议。因此，为了改进树突状细胞（DC）的生成技术，已开发出多种方法，可通过从外周血单个核细胞（PBMCs）中分离的高纯度CD34+前体细胞和单核细胞进行分化，从而显著提高这些细胞的纯度。 27如前所述，一种广泛使用且流行的方法是利用单核细胞黏附于玻璃或塑料表面的特性来诱导生成单核细胞来源的树突状细胞（MDDCs）（黏附法）。 21,22,27黏附法是一种快速且简便的方法，无需使用复杂设备。然而，该方法存在一些缺点，包括淋巴细胞污染、灵活性较低以及单核细胞的短暂操作。 28与黏附法相对的另一种方法是从总外周血单个核细胞（PBMCs）中通过磁珠分离法富集单核细胞，尤其是使用人单核细胞富集试剂盒，该试剂盒通过负向筛选法从PBMCs中分离单核细胞。 26在此过程中，利用四聚体抗体复合物和葡聚糖包被的磁性颗粒靶向去除不需要的细胞。该分离方法的优势在于，可通过磁铁分离被标记的非目标细胞，而目标细胞则可直接倾入新离心管中，无需使用层析柱。迄今为止，随着能够标记特定细胞群体的单克隆抗体的广泛应用，磁性分离技术已不再仅仅是一种辅助手段，而是免疫学领域中分离稀有细胞所必需的技术。例如，利用商品化的顺磁性MACS纳米颗粒进行磁性细胞分选的技术，已促进了科研与临床应用中新方法的发展 22,29此外，近期比较单核细胞贴壁法与MACS技术生成树突状细胞的研究表明，采用MACS分离的单核细胞可获得更高纯度和活性的树突状细胞 22,30.

本研究比较了两种从外周血单个核细胞（PBMCs）中分离单核细胞并诱导生成人树突状细胞（DCs）的方法：1）通过贴壁法分离单核细胞；2）使用商用人单核细胞富集试剂盒进行负向选择分离单核细胞。研究结果表明，与贴壁法相比，采用负向选择磁分离法分离单核细胞可获得更高的单核细胞得率，且细胞活力无显著差异。进一步发现，在培养七天后，经磁分离法获得的单核细胞分化为单核细胞来源的树突状细胞（MDDCs），其增殖能力显著更强，并有更高比例的细胞表达双阳性（CD11c+/CD14+）表型，同时不影响MDDC的存活率。总体而言，本研究不同于上述以往研究之处在于，它证明了这两种方法均能在培养七天后同时产生具有增殖能力并可分化为CD11c+ MDDCs的单核细胞（> 70%），且不损害其活力。此外，本研究首次通过成像流式细胞术对不同CD11c/CD14表型的MDDC亚群进行了表征分析。

总之，由于树突状细胞（DCs）在免疫学研究领域中具有核心作用，因此在考虑其来源以及用于分离和培养的方法时，必须综合考虑多种参数。 体外因此，本研究旨在探讨两种不同的单核细胞分离方法，并阐明这些方法如何差异性地影响单核细胞的存活率和得率，进而影响树突状细胞的存活、增殖及表型。这些发现将对免疫学领域产生重要贡献，并提供一套详细的树突状细胞分离、纯化与鉴定的操作方案。

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方案

总体人类血液研究已通过佛罗里达国际大学机构审查委员会（IRB）的审查和批准，IRB方案批准编号为IRB-13-0440。人类白细胞浓缩物购自美国佛罗里达州迈阿密的社区血库。

1. 采用标准密度梯度法分离外周血单个核细胞

  1. 在T75培养瓶中，用1×磷酸盐缓冲液将血液进行1:1稀释。
  2. 将15 ml密度梯度溶液加入50 ml离心管中，然后小心地将稀释后的血液（每管25–30 ml）铺在梯度液上方。
  3. 以1,200 × g离心20分钟，加速度设为1，减速度设为0。
  4. 离心后，收集界面层（白细胞）至新的50 ml离心管中，并用PBS洗涤细胞两次（每次1,080 × g离心3分钟），每次均弃去上清液。
  5. 用氯化铵-氯化钾裂解（ACK）缓冲液处理细胞（以裂解红细胞）。加入10 ml缓冲液，在4 °C孵育15分钟。
  6. 用PBS洗涤细胞两次，每次以1,080 × g离心3分钟，并弃去上清液。
  7. 保留沉淀，其中含有外周血单个核细胞（PBMCs）。
  8. 继续采用所选的单核细胞纯化方法。

2. 通过贴壁法纯化单核细胞

  1. 准备含有 L-谷氨酰胺（300 mg/ml）并添加青霉素（50 U/ml）-链霉素（50 µg/ml）和 10% 胎牛血清的完全细胞培养基。
  2. 将 PBMCs 以每 10 ml 完全培养基含 5 × 107 个细胞的浓度接种于 T75 培养瓶中，在 37 °C、5% CO2 的湿润培养箱中培养约 2 小时，使其贴壁。
  3. 培养后，移除培养瓶中未贴壁的悬浮细胞，并用 PBS 轻轻洗涤贴壁细胞两次。
  4. 将贴壁细胞在完全细胞培养基中继续培养，培养基中补充人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）和白细胞介素 4（IL-4），两者工作浓度均为 2 µl/ml，储存液浓度为 10 µg/ml。
  5. 每 48 小时更换一半培养基，并补充细胞因子。
  6. 培养 5 至 7 天，使单核细胞分化为单核细胞来源的树突状细胞（MDDCs）。

3. 采用磁性分离法纯化单核细胞

  1. 采用标准密度梯度离心法收集外周血单个核细胞（PBMCs），将其倒入5 ml聚苯乙烯管中，并用PBS缓冲液重悬，调整细胞浓度至每毫升一定数量的细胞。
  2. 按每毫升细胞加入50 µl人单核细胞富集试剂盒，充分混匀后于4 °C孵育10分钟。
  3. 孵育结束后，按每毫升细胞加入50 µl磁性颗粒，充分混匀后于4 °C继续孵育5分钟。
  4. 加入PBS缓冲液将细胞悬液总体积补至2.5 ml，通过上下吹打2–3次充分混匀。
  5. 将未加盖的聚苯乙烯管放入磁力架中，室温静置2.5分钟。
  6. 孵育结束后，连贯操作：取下磁铁，将所需纯化的单核细胞组分倒入洁净的50 ml离心管中。
  7. 将贴壁细胞在完全培养基中孵育，培养基中添加人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）和白细胞介素4（IL-4），每毫升培养基中各加入2 µl，细胞因子储备液浓度为10 µg/ml。
  8. 每48小时更换一半培养基，以1,080 × g离心5分钟，弃上清，用新鲜培养基（CRPMI）及细胞因子重悬细胞沉淀。
  9. 培养5–7天，使单核细胞分化为单核细胞来源的树突状细胞（MDDCs）。

4. 台盼蓝排斥法细胞活力检测

注意：使用此技术可获得外周血单个核细胞（PBMCs）、单核细胞和单核细胞来源的树突状细胞（MDDCs）的细胞得率和活力。

  1. 使用标准的胰蛋白酶-EDTA消化法收集细胞，并用PBS洗涤培养瓶和细胞沉淀。根据沉淀的大小，加入5至10 ml PBS重悬并溶解细胞沉淀。
  2. 在微量离心管中，将台盼蓝试剂与稀释后的细胞悬液按1:1比例混合。
  3. 取上述混合液10 µl加入细胞计数板，按照仪器制造商的操作说明使用自动细胞计数仪读取结果。若无自动细胞计数仪，也可使用血细胞计数板或手动计数方法获得相似的细胞计数结果。

5. MTT 检测

  1. 将细胞以每100 µl完全培养基中4 × 104个细胞的浓度接种至96孔板的每个孔中。培养24小时，使细胞适应培养环境。
  2. 分别在0小时（第0天）、36小时（第3天）和84小时（第7天）进行孵育并读取数据。
  3. 完成所需孵育后，吸除培养基，每孔仅加入100 µl磷酸盐缓冲液（PBS）。
  4. 通过将10 ml二甲基亚砜（DMSO）加入1 g十二烷基硫酸钠（SDS）中，配制3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基四氮唑溴盐（MTT）溶液（5 mg/ml）。
  5. 每孔加入10 µl（5 mg/ml）MTT溶液，于37 °C继续孵育2小时。
  6. 孵育结束后，移除含有PBS和未转化MTT混合物（黄色溶液）的上清液。
  7. 每孔加入100 µl SDS-DMSO溶液，再孵育1小时。
  8. 使用酶标仪在540 nm波长处测定吸光度。

6. 成像流式细胞术的细胞表面染色分析

  1. 从纯化的单核细胞分化7天后，接种1×10⁶个细胞6 将单核细胞来源的树突状细胞分装至适当数量的1.5 ml离心管中。
  2. 使用50 µl热灭活（HI）人血清封闭细胞，4 °C孵育10分钟，开始细胞表面染色。
  3. 孵育后，于720 × g离心5分钟，弃上清液。
  4. 向细胞沉淀中加入相应的荧光素偶联抗体（例如， 抗CD11c或抗CD14）抗体，4 °C避光孵育20分钟。在另外的试管中，分别制备单荧光染料染色样本（每毫升样本），用于补偿调节。
  5. 孵育后，用1 ml PBS缓冲液洗涤细胞两次，每次以720 × g离心5分钟。
  6. 将细胞避光保护，用 PBS 缓冲液重悬，浓度为每 100 µl 含指定数量的细胞，用于流式细胞术分析。
  7. 为圈选活细胞，根据制造商说明书，在使用单细胞成像流式细胞仪检测前，向每管中加入 1 µl DAPI。

7. 统计分析

  1. 将所有数据输入电子表格中。
  2. 根据情况使用学生t检验和/或单因素方差分析（ANOVA）进行结果比较。
  3. 若 p < 0.05，则认为差异具有统计学显著性。

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结果

磁性分离法获得的单核细胞产量高于贴壁法

数据如图所示 图1 通过台盼蓝排斥法显示在分离外周血单个核细胞（PBMC）及单核细胞当天的PBMC和单核细胞计数。平均而言，采用贴壁法分离的单核细胞约占总PBMC的6.2%，而采用磁珠分选法分离的单核细胞可占PBMC的25%。统计分析表明，磁珠分选法获得的单核细胞比例显著更高（≥4倍）。数据以至少三次独立实验的均值±标准差表示。采用student's t检验进行统计分析 t检验显示两种方法在单核细胞产量上存在显著差异（p ≤ 0.0005）。

通过贴壁法和磁珠分离法分离单核细胞均不影响单核细胞的活力

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讨论

基于已知从人血液中分离和制备单核细胞来源的树突状细胞（MDDC）所存在的困难，本研究旨在全面比较两种已确立的MDDC制备方法。第一种方法为经典的常规方法，利用单核细胞黏附于玻璃或塑料表面的特性进行MDDC的制备（黏附法）。 21,22,27黏附法快速且成本低廉，无需使用复杂设备。然而，该方法的一些缺点包括淋巴细胞污染、灵活性低以及单核细胞的瞬时操作。 22,30,31第二种比较的替代方法是使用人单核细胞富集试剂盒，从外周血单个核细胞（PBMCs）中磁分离单核细胞 26，该方法通过负向选择从外周血单个核细胞（PBMCs）中分离单核细胞。此分离方法的优势在于，非目标细胞被标记后利用磁铁分离，而目标细胞则可直接倒入新离心管中，无需使用层析柱，也无需用抗体直接靶向目标细胞。无论采用何种单核细胞分离方法（贴壁法 与 磁分离），在两种操作之后，该方案中的一个关键步骤是 体外 使用粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）和白细胞介素-4（IL-4）刺激单核细胞，以诱导生成单核细胞来源的树突状细胞（MDDCs）。这是一种常见且成熟的方法，用于从外周...

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披露

所有作者均声明不存在竞争性经济利益。

致谢

本研究由美国国家酒精滥用与酒精中毒研究所资助，项目编号为 K99/R00 AA021264。实验室的额外支持来自免疫学系、神经免疫药理学研究所、赫伯特·沃特海姆医学院以及佛罗里达国际大学研究与经济发展办公室的启动经费包。吉安娜·卡斯特莱罗（Gianna Casteleiro）获得了美国国立卫生研究院/普通医学科学研究所 R25 GM061347 项目的资助。本内容完全由作者负责，不代表美国国立卫生研究院的官方观点。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
菲可-帕克GE Healthcare17-5442-03必须在室温下使用
磷酸盐缓冲液（PBS）Life Technologies10010-023
ACK裂解缓冲液Quality Biological118-156-101
RPMI 1640培养基Life Technologies22400-089
抗生素-抗真菌剂（100倍浓缩液）Life Technologies15240-062
胎牛血清（FBS）Life Technologies16000-044
RoboSep缓冲液StemCell20104
EasySep人单核细胞富集试剂盒StemCell19059
TC20全自动细胞计数仪Bio-Rad145-0101
荧光素标记葡聚糖（FITC-Dextran）Sigma AldrichFD4-100MG
台盼蓝染色液（0.4%）Life Technologies15250-061
Synergy 2多功能微孔板检测仪Biotek7131000
XTT钠盐生物试剂（XTT）Sigma AldrichX4626-100MG
二甲基亚砜生物试剂（DMSO）Sigma AldrichD8418-500ML
噻唑蓝四氮唑溴盐（MTT）Sigma Aldrichm5655-500MG
十二烷基硫酸钠（SDS）Bio-Rad161-0302
吩嗪硫酸甲酯（PMS）Sigma AldrichP9626-1G
热灭活人血清（HI Human Serum）ChemiconS1-100ML
Accuri C6流式细胞仪BD Accuri653119
FlowSight Amnis流式细胞仪EMD Millipore100300

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