通过成像流式细胞仪人单核细胞来源的树突状细胞的特征:两个单核细胞分离方法的比较

摘要

本研究比较了两种不同的人单核细胞分离方法以获得体外树突状细胞 （DC）。单核细胞通过粘附选择或通过磁性分离进行负富集。将比较两种方法之间的单核细胞产量和活力以及 MDDC 活力、增殖和 CD11c/CD14 表面标志物表达。

摘要

树突状细胞 （DC） 是免疫系统的抗原呈递细胞，在淋巴细胞反应、宿主防御机制和炎症发病机制中起着至关重要的作用。由于 DC 的独特特征，DC 的分离和研究在生物学研究中一直很重要。尽管它们是免疫系统的重要关键介质，但 DC 在血液中非常罕见，约占血液单核细胞总数的 0.1 - 1%。因此，分离方法的替代方案依赖于从外周血单核细胞 （PBMC） 中分离的单核细胞中 DC 的分化。必须考虑使用适当的分离技术，将简单性、经济性、高纯度和高细胞产量相结合。在目前的研究中，将比较生成 DC 的两种不同方法。通过粘附选择单核细胞或使用磁性分离程序进行负富集，然后用 IL-4 和 GM-CSF 分化成 DC。使用活力染料、MTT 测定和成像流式细胞术 CD11c/CD14 表面标志物分析评估单核细胞和 MDDC 活力、增殖和表型。尽管与粘附法相比，磁分离法产生的具有更高增殖能力的单核细胞百分比显着更高，但研究结果表明，两种技术能够同时产生能够在培养 7 天后增殖和分化为活的 CD11c+ MDDC 的单核细胞。两种方法均产生> 70% CD11c+ MDDC。因此，我们的结果提供了有助于开发可靠的人类 DC 分离和表征方法的见解。

引言

树突细胞（DC）是先天和适应性免疫系统的基本介质。它们的功能来诱导初次免疫应答，促进免疫记忆的发展。这些细胞对于抗原捕获，迁移和T细胞的刺激主要负责，因此，被称为¹的DC .Manipulation可以在各种不同的研究领域，并且在临床上被用于治疗不同的专业抗原呈递细胞（APC）炎性疾病如HIV ^6,7，癌症^8，自身免疫性疾病^9，和过敏性反应^10。区议会也被用于药物滥用研究，以解决未知的机制和途径，如与酒精依赖^11-14，药物依赖^13,15，和HIV感染和滥用药物^16-19的组合有关的。这些正在进行的研究和未来研究研究我ñ免疫学领域作出的体外代DCS的研究非常重要。然而，存在与从人血液中分离的DC，因为它们只构成0.1相关联的若干困难-总血单核细胞²⁰的1％。

迄今为止，一些对的DC 在体外的产生的行之有效的方法是由单核细胞^21,22的塑料或玻璃粘附，密度梯度离心^23，特异性标记基于分离的诸如磁激活细胞分选^22，荧光激活细胞分选^24，用葡聚糖包被的磁性纳米颗粒^25，并用完全自动化的负小区选择²⁶高度纯化的单核细胞的快速分离CD14 +单核细胞的阳性筛选。但是，选择的最佳方法仍存在争议。因此，为了改善直流生成技术，几种方法已经被开发，其中这些细胞的纯度，可以大大增加从外周血单核细胞^（PBMC）27分离纯化的CD34 +祖细胞和单核细胞的分化。作为现有所提到的，用于产生单核细胞来源的树突细胞（MDDCs）一种广泛使用的和流行的方法是探索的单核细胞粘附到玻璃或塑料（附着法^）21,22,27的能力。的粘附方法是，不需要使用复杂的设备迅速和直接的方法。然而，这种方法的一些缺点包括淋巴细胞污染，低弹性，和单核细胞的瞬态操作^28。到的粘附方法的另一种方法是从总的PBMC的单核细胞的磁隔离，特别是与使用人单核细胞富集的试剂盒，其被设计为通过阴性选择²⁶来隔离的PBMC的单核细胞的。在此过程中，不想要的细胞被定位为与四聚体去除抗体复合物和葡聚糖 - 包被的磁性粒子。这种分离方法的优点是，不希望的标记的细胞使用磁体而靶细胞可以自由地倾出进新管中，而不需要的列隔开。迄今为止，与可标记独特的细胞群体特异性的单克隆抗体的情况中，磁性分离技术已成为不只是一个附加的方法，但对于罕见细胞在免疫学领域的隔离是必要的。例如，技术，诸如磁性细胞与市售的顺磁磁珠纳米颗粒分拣提供了便利的研究和临床应用^22,29的新方法的发展。此外，最近的调查研究DC一代单核细胞，从坚持和MACS技术方法相比采用分离的单核细胞^22,30 MACS都表现出较高的DC纯度和可行性。

目前的研究礼物使用商业人单核细胞富集试剂盒1）通过粘附的单核细胞的分离和2）单核细胞分离通过阴性选择:两种方法人DCs的一代从单核细胞从PBMC中分离之间的比较。本研究提供的证据表明，当与由粘附方法分离的单核细胞相比，阴性选择磁选步骤以分离单核细胞产生具有在单核细胞存活率没有显著差异的单核细胞的产率最高。反过来，七天后，通过磁分离中分离出的单核细胞分化成与显著更高的增殖能力和表达双阳性（的CD11c + / CD14 +）表型的细胞的较高量MDDCs而不影响MDDC生存能力。总体而言，目前的研究从上面引用的先前研究不同，因为它表明这两种技术以同时产生能够增殖和分化成的CD11c的单核细胞的能力+MDDCs（> 70％）后，在培养7天不影响他们的生存能力。此外，目前的做法提供了流式细胞仪成像流量不同的CD11c / CD14 MDDCs人口的第一次鉴定。

综上所述，由于区议会扮演关于免疫学领域研究的焦点角色，不同的参数必须考虑到他们是如何得出的，并用什么方法将它们在体外分离培养时加以考虑。因此，本研究的目的是提供对单核隔离两种不同的方法，以及这些方法的差异影响单核细胞活力和最终产量影响树突状细胞活力，增殖和表型的见解。这些发现将大大有助于免疫学的领域，并且将提供的DC隔离，纯化和表征的详细协议。

方案

总体人体血液的研究已经审查和金融情报机构，IRB协议批准＃IRB-13-0440的机构审查委员会（IRB）的批准。人类leukopaks从迈阿密，佛罗里达州社区血库购买。

1.外周血单个核细胞分离通过标准密度梯度法

1. 在T75烧瓶中的血液用1×磷酸盐缓冲盐水1稀释:执行1。
2. 移液器的15ml密度梯度溶液倒入50ml离心管中，小心地层（25 - 为30 mL /管）稀释血液在这个梯度。
3. 在1200 xg离心以1加速和0减速离心20分钟。
4. 离心后，收集界面层（白血细胞）到一个新的50ml离心管中并在PBS中洗涤细胞两次（1,080 xg离心3分钟）。丢弃每次上清。
5. 治疗与氯化铵 - 钾裂解（ACK）缓冲液细胞（裂解红血细胞）。加10毫升缓冲液中，cubate在4℃下15分钟。
6. 1,080 xg离心洗涤细胞两次，用PBS，离心3分钟，弃每次上清液。
7. 保存颗粒，其中将包含外周血单个核细胞。
8. 与选择的单核细胞纯化方法进行。

2.贴壁法提纯单核细胞

1. 制备含有L-谷氨酰胺（300毫克/毫升）和完整的细胞培养基补充有青霉素（50U / ml）的-streptomycin（50微克/毫升）和10％胎牛血清。
2. 允许的PBMC通过在T75烧瓶中以每10 ml完全培养基的5×10 ⁷个细胞的浓度在37℃和5％CO ₂在培养箱中培养他们坚持约2小时。
3. 培养后，从培养瓶中除去非贴壁悬浮细胞和轻轻地用PBS洗涤附着的细胞两次。
4. 孵育贴壁细胞在补充有2微升/ ml人粒细胞 - MACR的完全细胞培养基ophage细胞集落刺激因子（GM-CSF）和白细胞介素-4（IL-4）存储在库存浓度为10微克/毫升。
5. 改变介质的一半，并补充细胞因子每48小时。
6. 允许5 - 7天为单核细胞分化成MDDCs。

3.单核细胞通过磁分离方法来纯化

1. 收集从标准密度梯度技术的PBMC，倒入5毫升聚苯乙烯管中并在PBS缓冲液中的细胞/ ml的浓度重新悬浮。
2. 加入人单核细胞富集的鸡尾酒用50微升/毫升细胞，拌匀，并在4℃孵育10分钟。
3. 孵育后，加用50微升/毫升细胞的磁性颗粒，拌匀，并在4℃孵育5分钟。
4. 通过加入PBS缓冲液使细胞悬浮液至2.5毫升总体积，通过上下吹打2拌匀 - 3次。
5. 放置聚苯乙烯管无帽到磁性装置，并在室温进行2预留0.5分钟。
6. 温育后，在一个连续的动作，拿起磁铁和倾所需纯化的单核细胞级分成50 mL的干净的离心管中。
7. 孵育在补充有2微升/ ml人粒细胞 - 巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）的完全细胞培养基和白介素4贴壁细胞（IL-4）存储在库存浓度为10微克/毫升。
8. 每48小时，更改一半培养基，降速1,080×g离心5分钟，重新悬浮新媒体（CRPMI）和细胞因子粒料。
9. 允许5 - 7天为单核细胞分化成MDDCs。

4.台盼蓝染色活性测定

注意:使用此技术来获得外周血单个核细胞，单核细胞和MDDCs的细胞产量和活力。

1. 收获细胞用标准胰蛋白酶-EDTA，并执行烧瓶并用PBS将细胞沉淀的洗涤。根据粒料的大小，重暂停在5至10毫升的PBS以溶解沉淀。
2. 在微型离心管中，执行1:锥虫蓝试剂用稀细胞沉淀1稀释。
3. 从这种混合，分装10微升到细胞计数滑动和使用根据制造商的协议的自动细胞计数器读取的结果。如果自动细胞计数器不可用，类似的细胞计数可以使用血球或手动计数器。

5. MTT法

1. 板细胞的浓度为^4×104 /100μl的完全培养基的每孔在96孔板中。允许细胞调整到培养24小时。
2. 孵育并在分别为0（0天），36（第3天）和84（第7天）小时进行读数。
3. 在所需的孵化完成后，取出媒体和单独100微升的PBS替换。
4. 制备3-（4,5-二甲基吡啶-2-基）-2,5-二苯基四唑鎓溴化物溶液（MTT）（5毫克/毫升）中加入10毫升dimeth的基砜（DMSO）至1g十二烷基硫酸钠（SDS）。
5. 添加10微升（5毫克/毫升）的MTT溶液，以每孔，并在37°C孵育另外2小时。
6. 孵化后，取出含有PBS和未MTT混合物（黄色溶液）上清。
7. 加入100微升的SDS-DMSO溶液至每孔，并孵育一小时。
8. 在使用酶标仪540nm处读取吸光度。

6.细胞表面染色分析成像流式细胞仪

1. 之后，从纯化的单核细胞7天分化，分配所述单核细胞来源的树突状细胞的1×10 ⁶细胞的等分试样到1.5毫升管的适当数量。
2. 通过使用热50μl的灭活（HI）的人血清阻断细胞开始细胞表面染色，孵育在4℃下进行10分钟。
3. 培养后，离心细胞以720×g离心5分钟，弃上清。
4. 细胞PELLET，添加各自荧光染料标记的抗体（ 例如，抗CD11c或抗CD14），并在4℃下孵育避光20分钟。在单独的管，制备单荧光染色样品/毫升），因为它们都需要赔偿。
5. 温育后，洗涤细胞两次，每次1ml的PBS缓冲液和离心机在720×g离心5分钟。
6. 保持避光细胞，在PBS缓冲液的细胞/ 100微升流式细胞仪分析浓度再挂起。
7. 为了对活细胞栅极，获取对单细胞成像流式细胞仪根据制造商的指示仪表的细胞之前，添加1微升的DAPI到每个管中。

7.统计分析

1. 输入电子表格中的所有数据。
2. 比较使用学生t检验和/或单向ANOVA适当的结果。
3. 考虑差别是如果p <0.05统计学显著。

结果

通过磁分离的单核细胞收率较高通过贴壁法相比单核细胞产量

在外周血单个核细胞和单核细胞的分离隔离当天由台盼蓝排除法图1显示PBMC和单核细胞计数显示的数据。平均来说，通过粘附方法分离的单核细胞占的PBMC的约6.2％，而由磁选分离的单核细胞占的PBMC的高达25％。统计分析表明，通过磁分离的单核细胞产生的比例分别显著升高（≥4倍）​​。数据表示为至少三个独立实验的平均值±标准差。使用学生氏t比较这两种方法（P≤0.0005）时-test显示单核细胞产率的一个显著差异的统计分析。

_content"FO:保together.within页=""> 分离单核细胞贴壁和磁分离 1 不影响单核细胞活力

讨论

根据分离和产生从人血MDDCs的已知困难，本研究的目的是提供用于MDDCs的产生两个成熟的方法的全面的比较。相比第一种方法是用于通过利用单核细胞粘附到玻璃或塑料（附着法^）21,22,27的能力产生MDDCs行之有效的传统方法。的粘附方法是快速和成本有效的，并且不要求使用复杂的设备。然而，这种方法的一些缺点包括淋巴细胞污染，低弹性，单核细胞瞬时操纵^22,30,31。相比，第二方案的方法是使用一个人单核细胞富集试剂盒^26，其目的是通过阴性选择来隔离的PBMC的单核细胞总外周血单核细胞（PBMC）的单核细胞的磁隔离。这种分离方法的优点是，不需要的细胞标记，并使用一个磁铁分离而靶细胞可自由倾出进新管中，而不需要的列和不与抗体直接靶向细胞。无论单核细胞的分离方法的（附着的与磁分离），这两个程序后，的协议中的关键步骤之一是与粒细胞巨噬细胞集落刺激因子的单核细胞的体外刺激（GM-CSF）和白细胞介素-4（ IL-4），它被要求产生MDDCs。这是一种常见的和很好地建立协议，以产生从血液单核细胞MDDCs而不损害抗原捕获和未成熟MDDCs ^3...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
Ficoll-Paque	GE Healthcare	17-5442-03	必须在 RT 使用
盐缓冲盐水 （PBS）	Life Technologies	10010-023
ACK 裂解缓冲液	质量	生物 118-156-101
RPMI 1640 中等	Life Technologies	22400-089
抗生素-抗真菌剂 （100x）	Life Technologies	15240-062
胎牛血清 （FBS）	Life Technologies	16000-044
RoboSep 缓冲液	StemCell	20104
EasySep 人单核细胞富集试剂盒	StemCell	19059
TC20 自动细胞计数仪	Bio-Rad	145-0101
FITC-葡聚糖	Sigma Aldrich	FD4-100MG
台盼蓝染色剂 （0.4%）	Life Technologies	15250-061
Synergy 2 多功能阅读器	Biotek	7131000
XTT 钠盐生物试剂 （XTT）	Sigma Aldrich	X4626-100MG
二甲基亚砜生物试剂 （DMS）	Sigma Aldrich	D8418-500ML
噻唑基蓝四唑溴化物 （MTT）	Sigma Aldrich	m5655-500MG
十二烷基硫酸钠 （SDS）	Bio-Rad	161-0302
吩嗪甲基硫酸盐 （DMSO）	Sigma Aldrich	P9626-1G
灭活 （HI） 人血清	Chemicon	S1-100ML
Accuri C6 流式细胞仪	BD Accuri	653119
FlowSight Amnis 流式细胞仪	EMD Millipore	100300