Method Article

机器人平台的高通量原生质体分离和转型

DOI:

10.3791/54300

⸱

September 27th, 2016

 ,  , 
1Department of Plant Sciences, University of Tennessee, Knoxville, 2Center for Renewable Carbon, University of Tennessee, Knoxville, 3Department of Mechanical, Aerospace, and Biomedical Engineering, University of Tennessee, Knoxville

In This Article

Summary

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高通量，自动化，烟草原生质体的生产和改造的方法进行描述。该机器人系统可以在模型BY-2系统应该是翻译到非模式作物大规模并行基因表达和发现。

Abstract

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在过去的十年里，已经在使用植物原生质体，范围从模型物种作物物种，信号传导途径，转录调控网络，基因表达，基因组编辑，和基因沉默的分析的回潮。此外，显著进展已在植物的原生质体的再生，这已产生在使用这些系统用于植物基因组的甚至更多的利益作出。在这项工作中，一个协议已使用机器人平台已经开发了用于原生质体分离和转化的自动化从'亮黄色'2（BY-2）烟草悬浮培养。使用花椰菜花叶病毒35S启动子（35S）的控制下，为橙色荧光蛋白（OFP）报告基因（pporRFP）的转化方法进行了验证。原生质体OFP表达，荧光显微镜证实。分析还包括使用propidiu原生质体生产效率的方法米碘。最后，被用于原生质体分离过程的低成本食品级酶，绕过用于实验室级的酶，它们成本昂贵的自动化原生质体分离和分析的高通量的需求。根据此工作开发的协议，从原生质体分离到转化完成过程可以在4小时进行中，在不脱离操作者的任何输入。而在这一工作开发的协议是与BY-2细胞培养物中证实，程序和方法应该是可平移的任何植物悬浮培养/原生质体系统，该系统应使作物基因组学研究的加速度。

Introduction

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近年来，一直放置在转基因作物的设计克服了各种疾病1，赋予抗除草剂2，赋予干旱3,4和耐盐5显著动力，防止虫食6，提高生物产量7，降低细胞壁顽抗8。这种趋势已经通过新的分子工具的发展，用于产生转基因植物，包括使用CRISPR和TALENS 9基因组编辑，基因通过的dsRNA 10，miRNA的11，和siRNA 12沉默辅助。虽然这些技术简化了转基因植物的一代，他们还创建了一个瓶颈，其中产生的转基因植物的数量之多，无法使用依赖于植株再生的传统系统进行筛选。与此相关的瓶颈，而沉默和基因组编辑构建体能够迅速地插进植物，许多目标性状不能产生所期望的效果，这通常没有发现直到植物在温室中进行分析。在这项工作中，我们开发了用于植物原生质体的快速，自动化，高通量筛选的方法，具体而言，以解决在大量的基因组编辑和基因沉默靶的早期筛查的当前瓶颈。

使用原生质体的，相对于完整的植物细胞，具有几个优点对自动化平台的开发。首先，原生质体的植物细胞壁的消化后分离，以及与此屏障不再存在，转化效率提高13。在完整的植物细胞，只有两种用于转化很好地建立的方法，基因枪法14和农杆菌介导的转化15。

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Protocol

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1.悬浮培养的建立

  1. BY-2介质通过加入4.43克Linsmaier＆Skoog基础介质30克蔗糖，200毫克KH 2 PO 4制备的液体，和200微克至900的2,4-二氯苯氧乙酸（2,4-D）毫升蒸馏水水和pH至5.8，用0.1M的KOH。调节pH值之后，调节最终体积至1000毫升蒸馏水和高压釜中。介质可以在4℃保存最多2周。
  2. 接种用100ml液体BY-2的媒体和单片BY-2愈伤组织（> 1厘米直径）上生长固BY-2介质的250ml Erlenmeyer烧瓶（液体BY-2的媒体与添加1％琼脂）中，用铝箔密封。在28-30℃下孵育培养振摇5天。
    注:BY-2愈伤组织被保持在为长期贮存的固体介质，如液体培养物将迅速长满。培养体积可以根据需要进行调整，通常的100毫升培养将能够装载三十3个6-WELL板。
  3. 转让2 ml对数相BY-2培养到98毫升的新鲜BY-2培养基中，并在28-30℃振荡孵育5-7天。
    注意:100稀释的5-7天龄培养物，而不是与愈伤接种:建立液体培养物的传代培养可以定期使用1来进行。
  4. 调匀的培养，因为细胞将迅速沉降，并转移6毫升细胞培养物至15ml锥形底离心管，并让细胞沉降至少10分钟。通过除去上清液调节红细胞体积与总体积的50％。
  5. 通过反相和吸管500微升成用于消化一个6孔板的每个孔中摇管中。使用宽孔移液管在此阶段转移的细胞，因为它们是致密的并且会阻塞....

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Results

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在目前的研究中，BY-2的倍增速率从14-18小时取决于在该培养物温育的温度，用15小时的平均细胞周期长度的先前的报告一致变化。与此倍增速率，以1:100起始接种物用于启动培养，导致培养物在5-7天的50％的收集细胞体积（PCV）。在当前的协议，其中培养物在200ml培养基中生长，在7天，这提供了足够的细胞以填充33 6孔板生成100ml的PCV。在原生质体产率而言，产生在协议中规定的条件消化4.70×10 5±5.77×10 3个原生质体每孔，导致在2.82×10 6个原生质体每6孔板（ 图2A）。根据这些数据，214 96孔板（70微升每孔的原生质体）可以由单一的6孔板消化被加载，以fo的电位被同时消化v提供两种6孔板中，利用两个板状加热器/冷却器电台。因此，可以在单个三小时消化协议过程中产生的原生质体的最大数量是5.64×10 6。

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Discussion

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上述的协议已被成功验证为原生质体分离，计数，以及使用该BY-2烟草悬浮细胞培养物转化;然而，该协议可以很容易地扩展到任何植物悬浮培养。目前，原生质体分离和改造已经在众多的植物，包括玉米（ 玉米 ）10，红萝卜（ 胡萝卜 ）32，杨树（ 胡杨 ）33，葡萄（ 葡萄 ）34，油棕（ 油棕 ）35实现，生菜（ 莴苣 ）36，芥菜（ 雪里蕻 ）37，水稻（Oryza sativa）38，和柳枝稷（ 柳枝稷 ）39,40。而在培养和消化条件的变化因物种发生，在这项工作中开发的协议的条款，替换培养基或改变挖的条件estion不应该改变的基本协议。调整到由操作者协议的初始化之前被加载所需的消化不同的物种，培养基和酶，从而交换这些部件是微不足道的。作为一个额外的好处，该协议是易于进行筛选多种消化条件.......

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Disclosures

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作者宣称，他们没有竞争的经济利益。

Acknowledgements

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这项研究得到了高级研究计划署 - 能源 （ARPA-E） 奖号的支持。DE-AR0000313。

....

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Orbitor RS 微孔板移动机械臂Thermo Scientific
Bravo 液体处理器Agilent
Synergy H1 多功能微孔板检测仪BioTek
MultiFlo FX 多功能分液器BioTek
TeleshakeInheco3800048
CPAC 超扁平加热器/冷却器Inheco
Vworks 自动化软件控制和编写 Agilent BravoAgilent
Momentum 软件用于控制 Orbiter RS 的 Thermo Scientific任务调度软件
液体处理控制 2.17 软件Biotek软件用于控制和编写 MultiFlo FX
IX81 倒置显微镜奥林巴斯
Zyla 3 点显微镜相机Andor
ET-CY3/TRITC 滤光片套装Chroma Technology Corp49004
Rohament CLAB 酶样品瓶低成本纤维素酶
Rohapect UFAB 酶样品瓶低成本果胶酶
Rohapect 10LAB 酶样品瓶低成本果胶酶/阿拉伯蛋白酶
Linsmaier &Skoog 基础培养基植物技术实验室L689
2,4-二氯苯氧乙酸技术实验室D295
碘化丙Sigma AldrichP4170
聚乙二醇 4000Sigma Aldrich95904-250G-F原名 Fluka PEG
碘化丙啶Fisher Scientific25535-16-4Acros Organics 公司
CaCl2>Sigma AldrichC7902-1KG
醋酸钠Fisher ScientificBP333-500
甘露醇Sigma AldrichM1902-1KG
蔗糖Fisher ScientificS5-3
KH2PO4Fisher ScientificAC424205000
KOHSigma AldrichP1767
Gelzan CMSigma AldrichG1910-250G
6 孔板Thermo Scientific103184
96 孔 1.2 ml 深孔板Thermo ScientificAB-0564
96 孔光学底板Thermo Scientific165305
Finntip 1000 大口径移液器吸头Thermo Scientific9405 163
NaClFisher ScientificBP358-10
KClSigma AldrichP4504-1KG
MESFisher ScientificAC17259-5000
MgCl2Fisher ScientificM33-500
7000190 用于方案的 软件的方案 植物啶

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Atkinson, H. J., Lilley, C. J., Urwin, P. E. Strategies for transgenic nematode control in developed and developing world crops. Curr. Opin. Biotech. 23 (2), 251-256 (2012).
  2. Duke, S. O. Perspectives on transgenic, ....

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