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方法文章

一种用于高通量原生质体分离与转化的机器人平台

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DOI：

10.3791/54300

⸱

2016年9月27日

 ,  , 
1Department of Plant Sciences, University of Tennessee, Knoxville, 2Center for Renewable Carbon, University of Tennessee, Knoxville, 3Department of Mechanical, Aerospace, and Biomedical Engineering, University of Tennessee, Knoxville

本文内容

摘要

本文描述了一种高通量、自动化的烟草原生质体生产和转化方法。该机器人系统能够在模式BY-2体系中实现大规模平行的基因表达与功能研究，且该技术有望拓展应用于非模式作物。

摘要

近十年来，从模式植物到作物物种，植物原生质体的应用重新受到关注，广泛用于信号转导通路、转录调控网络、基因表达、基因组编辑以及基因沉默等研究。此外，原生质体再生植株方面也取得了显著进展，进一步推动了这些系统在植物基因组学中的应用。本研究建立了一种利用机器人平台自动化完成‘Bright Yellow’ 2（BY-2）烟草悬浮培养细胞中原生质体分离与转化的实验方案。转化过程通过使用花椰菜花叶病毒35S启动子（35S）驱动的橙色荧光蛋白（OFP）报告基因（pporRFP）进行验证。原生质体中OFP的表达通过落射荧光显微镜检测确认。分析还包括利用碘化丙啶评估原生质体产率的方法。最后，本研究采用低成本食品级酶进行原生质体分离，避免了高通量自动化原生质体分离与分析中因使用昂贵的实验室级酶带来的成本限制。根据本研究所建立的方案，从原生质体分离到转化的全过程可在4小时内完成，且无需人工干预。尽管本研究的方案在BY-2细胞系中进行了验证，但其操作流程和方法可推广至其他任何植物悬浮培养或原生质体系统，有望加速作物基因组学的研究进程。

引言

近年来，人们大力推动转基因作物的设计，以应对多种病害1，赋予除草剂抗性2，提高抗旱3,4和耐盐能力5，防止植食性动物取食6，增加生物量产量7，以及降低细胞壁的顽抗性8。这一趋势得益于新型分子工具的发展，这些工具可用于创制转基因植物，包括利用CRISPR和TALENs进行基因组编辑9，以及通过dsRNA10、miRNA11和siRNA12实现基因沉默。尽管这些技术简化了转基因植物的创制过程，但也造成了瓶颈：产生的转基因植株数量巨大，无法通过依赖植株再生的传统系统进行有效筛选。与此瓶颈相关的是，虽然基因沉默和基因组编辑载体可以快速导入植物，但许多靶向性状并未产生预期效果，而这一问题通常直到植物在温室中分析时才被发现。在本研究中，我们开发了一种针对植物原生质体的快速、自动化、高通量筛选方法，专门用于解决当前在大量基因组编辑和基因沉默靶点早期筛选中存在的瓶颈问题。

使用原生质体相较于完整植物细胞，在自动化平台的开发中具有多项优势。首先，原生质体是在植物细胞壁被消化后分离得到的，由于细胞壁这一屏障已不存在，转化效率得以提高13在完整的植物细胞中，目前仅有两种被广泛认可的转化方法，即基因枪法14 和 农杆菌介导的转化15这两种方法均难以直接应用于液体处理平台，因为基因枪法转化需要专用设备，而 农杆菌介导的转化需要共培养以及后续去除细菌，这两种步骤均不适用于高通量方法。对于原生质体而言，转化通常采用聚乙二醇（PEG）介导的转染进行16，仅需几次溶液更换，非常适合液体处理平台操作。其次，根据定义，原生质体为单细胞培养体系，因此植物细胞培养中常见的细胞聚团和链状结构问题在原生质体中不会出现。在使用基于微孔板的分光光度计进行快速筛选时，细胞聚团或细胞处于多个焦平面会导致测量结果不一致。由于原生质体的密度高于其培养基，它们会沉降到孔板底部，形成单层结构，有利于基于微孔板的分光光度测定。最后，尽管植物悬浮细胞培养物主要来源于愈伤组织17，原生质体可从多种植物组织中分离获得，从而能够鉴定组织特异性表达。例如，分析某个基因在根或叶中的特异性表达能力对于表型预测可能具有重要意义。因此，本研究建立的实验方案通过分离广泛使用的烟草（Nicotiana tabacum L.)‘Bright Yellow’2（BY-2）悬浮培养物。

由于在植物细胞分子分析中的广泛应用，BY-2悬浮培养细胞被称为高等植物的"HeLa"细胞18。近年来，BY-2细胞已被用于研究植物胁迫因子的影响19-22、细胞内蛋白质定位23,24以及基础细胞生物学问题25-27，显示出这些培养体系在植物生物学中的广泛用途。BY-2培养体系的另一个优势是可利用aphidicolin实现细胞周期同步化，从而提高基因表达研究的可重复性28。此外，已有方法采用低成本酶制剂从BY-2细胞中提取原生质体29,30，因为传统用于原生质体制备的酶类成本较高，难以适用于高通量系统。因此，下述方案虽以BY-2悬浮培养体系为基础进行验证，但应可适用于任何植物细胞悬浮培养体系。概念验证实验采用来自石珊瑚Porites porites的橙色荧光蛋白（OFP）报告基因（pporRFP）31，并在CAMV 35S启动子的调控下进行。

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方案

1. 悬浮细胞培养物的建立

  1. 制备液体BY-2培养基：将4.43 g Linsmaier & Skoog基本培养基、30 g蔗糖、200 mg KH2PO4和200 µg 2,4-二氯苯氧乙酸（2,4-D）加入900 ml蒸馏水中，用0.1 M KOH调节pH至5.8。调节pH后，用蒸馏水定容至1,000 ml，并进行高压灭菌。培养基可在4 °C下保存最多2周。
  2. 取一个250 ml锥形瓶，加入100 ml液体BY-2培养基和一块在固体BY-2培养基（含1%琼脂的液体BY-2培养基）上生长的BY-2愈伤组织（>1 cm直径），用铝箔密封。在28–30 °C条件下振荡培养5天。
    注意：BY-2愈伤组织长期保存时应维持在固体培养基上，因为液体培养物会迅速过度生长。培养体积可根据需要调整，通常100 ml培养物可接种三十三块6孔板。
  3. 将2 ml对数生长期的BY-2培养物转移至98 ml新鲜BY-2培养基中，在28–30 °C条件下振荡培养5–7天。
    注意：已建立的液体培养物可定期通过5–7天培养物1:100稀释进行传代，而不必使用愈伤组织接种。
  4. 充分混匀培养物（细胞会迅速沉降），取6 ml细胞培养液转移至15 ml圆底离心管中，静置至少10分钟使细胞沉降。通过去除上清液将压紧细胞体积调节至总体积的50%。
  5. 轻轻颠倒混匀离心管，用宽口枪头吸取500 µl细胞悬液加入6孔板的每一孔中用于消化。此步骤应使用宽口枪头转移细胞，因为细胞密度高，容易堵塞标准枪头。

2. 原生质体分离

  1. 启动机器人系统的各个组件（图1A），并打开微孔板搬运器的任务调度软件。任务调度程序将微孔板搬运器与其他设备集成，以实现各设备之间的板转移。
  2. 在实验开始前，需在微孔板搬运器软件中定义本方案所用耗材（例如，微孔板、盖子）的技术参数，以及每件耗材的起始和终止位置，具体步骤如下：
    1. 在微孔板搬运器软件的主工具栏中点击设置（Setup），然后选择管理容器类型（Manage Container Types）命令。
    2. 如果容器类型已在现有容器类型库中列出，则选择相应的容器。
    3. 如果容器类型未在现有容器类型库中列出，则点击添加（Add）以定义新的容器类型。
    4. 添加新容器类型后，将该容器的尺寸（高度、宽度、堆叠尺寸和夹持器偏移量）输入对应的选项卡中，并点击保存（Save）。
      1. 若制造商未提供准确尺寸，则需使用游标卡尺精确测量所有尺寸至最接近的毫米。容器尺寸测量错误将导致微孔板搬运器运行失败。
    5. 对微孔板搬运器将要使用的全部容器类型重复步骤 2.2.2 至 2.2.4.1。完成所有耗材的设置后，必须定义每种容器的起始和终止位置（步骤 2.2.6）。
      注：本方案中涉及的耗材包括 6 孔板、深孔板和 96 孔荧光筛选板。
    6. 要定义每种容器的起始和终止位置，请在特定协议中点击起始/终止（Start/End）选项卡。首先选择每种容器的起始位置，然后在起始和终止位置均勾选带盖/无盖（Lidded/Unlidded）选项。对所有容器重复此操作。
      注：若容器将保留在其他设备上（而非微孔板搬运器上），则可将终止位置留空。
  3. 在此阶段，手动将所有微孔板加载至整个工作流程的起始位置。将 96 孔荧光筛选板放入 Hotel 2，含 BY-2 细胞的 6 孔板放入 Hotel 3，用于转化的 96 深孔板放置于加热/制冷板巢 2，将含有酶溶液的 50 ml 锥形管（见补充文件，第 1.2.2 节）放置于多功能分配器上。
    1. 若本方案中将进行转化操作，需预先在 96 深孔板的每个孔中加入 10 µl 质粒 DNA（1 µg/µl，A260/280 > 1.8），其中包含 OFP 报告基因构建体，并将其置于板加热/制冷器上于 4 °C 孵育。每个孔用于一次独立的转化，因此填充的孔数取决于实验设计。
  4. 将所有试剂和微孔板按指定位置装载到自动液体处理平台上，并在自动化控制软件中定义每个物品的位置（图1B）。
    1. 在巢位 2 中放置一个 96 孔板，其中第 1 列每孔预装 200 µl 含 40% PEG 的 MMg 溶液（0.4 M 甘露醇，100 mM MgCl2，4 mM MES，pH 5.7），第 2 列每孔 200 µl 碘化丙啶（PI，1 µg/ml），第 3 列每孔 200 µl 乙醇，并在巢位 8 放置一盒移液枪头。
    2. 要在自动液体处理平台软件中定义耗材位置，请从菜单中选择工具（Tools），然后点击耗材编辑器（Labware Editor）。
    3. 从下拉菜单中选择耗材类型，或使用新建耗材（New Labware）按钮定义新的耗材类型。
    4. 通过选择主协议（Main Protocol）选项卡并点击配置耗材（Configure Labware），定义所选每件耗材的位置。确保在运行协议前，所有放置在自动液体处理平台上的耗材均已正确定义。
    5. 要启动自动协议，请点击“Profile Explorer”窗口，并选择要运行的协议名称（原生质体分离、细胞计数 和 PEG 介导的转化）。
    6. 点击运行（Run）以初始化协议中将使用的所有设备。
    7. 最后，在“Work Explorer”窗口中点击添加工作单元（Add Work Unit），以验证系统中所有容器/耗材的状态，并启动自动协议。
      注：自动协议的完整描述详见补充文件。

3. 建立细胞计数标准曲线

  1. 手动将原生质体浓缩至1 ml体积中，浓度为1 × 106 个原生质体/ml。在1,000 × g条件下离心10分钟，弃去上清液。
  2. 向原生质体沉淀中加入900 µl预冷至4 °C的70%乙醇，重悬沉淀。冰上孵育10分钟以固定细胞。
  3. 向原生质体中加入100 µl碘化丙啶（PI，1 µg/ml），用于细胞核染色，以便通过酶标仪检测。
  4. 从第2列开始，在96孔荧光筛选板的每列每行中加入80 µl液体BY-2培养基。
  5. 在96孔荧光筛选板的第1列中，向每孔加入70 µl原生质体悬液和50 µl BY-2培养基。
  6. 将该板放入自动化液体处理平台的6号巢位，运行2倍系列稀释。
    1. 在自动化液体处理平台上进行系列稀释时，点击Launch Serial Dilution Wizard，并调整转移体积（60 µl）、混合次数和体积（2次，70 µl）、起始孔（第1列，A-F行）、稀释孔（第2-11列，A-F行）以及吸液和排液参数（距孔底0.5 mm）。
    2. 设置参数后，保存并运行程序。
      注意：由于所有原生质体均已被PI标记（因细胞已固定），荧光强度与原生质体浓度成正比。
    3. 系列稀释完成后，将板从9号巢位取出，插入酶标仪，并运行酶标仪软件中的标准曲线程序。
      注意：通过比较各孔中PI的荧光信号（激发波长536 nm，发射波长620 nm）与已知的原生质体浓度，将生成一条标准曲线。
  7. 酶标仪程序完成后，取出微孔板，收集所有转基因细胞，并按照生物安全规程进行高压灭菌或其他失活处理。

4. 转化作用的显微分析

  1. 从机器人系统的 Hotel 1 中取出转化后的原生质体平板（自动化方案 3 的产物，补充文件）。
  2. 打开倒置显微镜、相机和荧光灯。
  3. 选择 10X 物镜以初步聚焦原生质体，打开卤素灯，并关闭荧光灯的快门。
  4. 将平板载入显微系统，使用明场模式对原生质体进行聚焦。
  5. 完成对原生质体的聚焦后，关闭卤素灯泡，并打开荧光灯的快门。
  6. 选择 CY3/TRITC 滤光片组，用于观察转基因原生质体表达的 pporRFP 蛋白。
  7. 扫描每个孔，确定表达 pporRFP 荧光标记的原生质体数量。
  8. 计算转化效率，即表达荧光标记的原生质体总数与原生质体总数之比。
  9. 将含有转基因细胞的平板收集至经批准的生物安全袋中，按照生物安全规程进行高压灭菌或其他失活处理。

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结果

在本研究中，BY-2细胞的倍增时间因培养温度不同而介于14至18小时之间，这与以往报道的平均细胞周期长度为15小时的结果一致。在此倍增速率下，采用1:100的起始接种量进行培养，可在5至7天内获得细胞压实体积（PCV）达50%的培养物。在本实验方案中，使用200 ml培养基进行培养，7天后可获得100 ml的PCV，足以接种33块6孔板。就原生质体产量而言，按照本方案指定条件进行消化，每孔可获得4.70 × 105 ± 5.77 × 103个原生质体，即每块6孔板可获得2.82 × 106个原生质体（图2A）。根据这些数据，单次6孔板消化所得原生质体可接种214块96孔板（每孔70 µl），并且由于配备了两个加热/制冷板站，可同时进行两块6孔板的消化。因此，在一次三小时的消化流程中，最多可获得5.64 × 106个原生质体。

尽管每...

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讨论

上述方案已成功用于BY-2烟草悬浮细胞培养物的原生质体分离、计数和转化；然而，该方案可轻松推广至任何植物悬浮培养体系。目前，原生质体的分离与转化已在多种植物中实现，包括玉米（Zea mays）10、胡萝卜（Daucus carota）32、胡杨（Populus euphratica）33、葡萄（Vitis vinifera）34、油棕（Elaeis guineensis）35、生菜（Lactuca sativa）36、芥菜（Brassica juncea）37、水稻（Oryza sativa）38和柳枝稷（Panicum virgatum）39,40。尽管不同物种在培养和消化条件上存在差异，但就本研究建立的方案而言，更换培养基或调整消化条件不应改变其基本流程。为适应不同物种，操作人员...

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披露

作者声明不存在任何竞争性经济利益。

致谢

本研究由高级研究计划署-能源（ARPA-E）资助，项目编号为 DE-AR0000313。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
Orbitor RS 微孔板转移仪Thermo Scientific
Bravo 液体处理系统Agilent
Synergy H1 多功能酶标仪BioTek
MultiFlo FX 多功能分液器BioTek
TeleshakeInheco3800048
CPAC 超平加热/冷却模块Inheco7000190
Vworks 自动化软件Agilent用于控制 Agilent Bravo 并编写其操作程序的软件
Momentum 软件Thermo Scientific用于控制 Orbitor RS 的任务调度软件
Liquid Handling Control 2.17 软件Biotek用于控制 MultiFlo FX 并编写其操作程序的软件
IX81 倒置显微镜Olympus
Zyla 3-Tap 显微成像相机Andor
ET-CY3/TRITC 滤光片组Chroma Technology Corp49004
Rohament CLAB Enzymes样品瓶低成本纤维素酶
Rohapect UFAB Enzymes样品瓶低成本果胶酶
Rohapect 10LAB Enzymes样品瓶低成本果胶酶/阿拉伯聚糖酶
Linsmaier & Skoog 基础培养基Phytotechnology LaboratoriesL689
2,4-二氯苯氧乙酸Phytotechnology LaboratoriesD295
碘化丙啶Sigma AldrichP4170
聚乙二醇 4000Sigma Aldrich95904-250G-F原为 Fluka PEG
碘化丙啶Fisher Scientific25535-16-4Acros Organics
CaCl2Sigma AldrichC7902-1KG
乙酸钠Fisher ScientificBP333-500
甘露醇Sigma AldrichM1902-1KG
蔗糖Fisher ScientificS5-3
KH2PO4Fisher ScientificAC424205000
KOHSigma AldrichP1767
Gelzan CMSigma AldrichG1910-250G
6 孔板Thermo Scientific103184
96 孔 1.2 ml 深孔板Thermo ScientificAB-0564
96 孔光学底板Thermo Scientific165305
Finntip 1000 宽口移液吸头Thermo Scientific9405 163
NaClFisher ScientificBP358-10
KClSigma AldrichP4504-1KG
MESFisher ScientificAC17259-5000
MgCl2Fisher ScientificM33-500

参考文献

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