为了理解脑卒中的病理生理学机制，使用可靠的模型至关重要。本文将介绍小鼠中最常用的脑卒中模型之一，即大脑中动脉闭塞（MCAo）模型（也称为血管内丝线或缝线模型），并包含再灌注过程。
本文内容
摘要
摘要
脑卒中是全球主要的致死原因之一，同时也是导致成人长期残疾的主要病因之一。约87%的脑卒中为缺血性卒中，且多发生在大脑中动脉（MCA）供血区域。目前，美国食品药品监督管理局（FDA）唯一批准用于治疗这种毁灭性疾病药物是组织型纤溶酶原激活剂（tPA）。然而，tPA的治疗时间窗较窄（3–6小时），且仅在实际接受该治疗的患者中有4%显示出疗效。当前的研究重点在于深入理解脑卒中的病理生理机制，以寻找潜在的治疗靶点。因此，可靠的动物模型至关重要，其中大脑中动脉闭塞（MCAo）模型（也称为血管内线栓或缝线模型）被认为是最具临床相关性的缺血性脑卒中外科模型，且具有相对无创、易于重复的优点。通常，MCAo模型应用于啮齿类动物，尤其是小鼠，因为该物种具有丰富的遗传变异资源。本文中，我们描述了（并在视频中展示了）如何在小鼠中成功实施MCAo模型（包含再灌注），以获得可靠且可重复的实验数据。
引言
脑卒中是全球第五大死因，每4分钟就有一人死于该疾病。每年有超过80万美国人发生脑卒中，这不仅对患者本人造成严重打击，也给其家庭带来巨大负担。脑卒中是成人致残的首要原因，尽管目前可用的治疗手段极为有限，但其年度支出估计高达365亿美元1。
组织型纤溶酶原激活剂（tPA）是目前唯一经美国食品药品监督管理局（FDA）批准用于缺血性脑卒中的药物。然而，该药物仅在卒中发作后3至6小时内给予患者才有效，且在此时间窗内仅有4%的患者获益2。因此，必须采用可重复且具有临床相关性的脑卒中动物模型，以促进该疾病潜在治疗策略和疗法的开发。需要强调的是，尽管体外（in vitro）模型在模拟脑功能障碍的某些方面具有一定价值，但无法重现卒中后脑内及外周复杂的生理相互作用。因此，体内（in vivo）模型至关重要。
最常见的卒中类型是缺血性卒中，占所有卒中病例的87%。其他类型的卒中包括脑内出血（9%）和蛛网膜下腔出血（4%），最常见原因是大脑中动脉（MCA）发生栓塞。这归因于MCA起始部明显的弯曲结构，导致进入脑部的层流血流受到干扰。大脑中动脉起源于颈内动脉（ICA），沿外侧裂走行，分支后投射至基底节以及额叶、顶叶和颞叶的外侧面，包括初级运动皮层和感觉皮层。威尔氏环（Circle of Willis）由大脑后动脉与大脑动脉及后交通动脉相连接而形成。
大脑中动脉阻塞（MCAo）的管腔内丝线或缝线模型是脑卒中研究中最广泛使用的方法之一。然而，该模型存在几种不同的变体，主要区别在于微丝是插入颈外动脉（ECA，称为Longa法）3，还是直接插入颈内动脉（ICA，称为Koizumi法）4。在Koizumi法中，当移除丝线时，为防止颈总动脉（CCA）切口处出血，手术侧的颈总动脉必须永久结扎；而在Longa法中，则需永久结扎颈外动脉5。本文将采用Longa法，因为我们认为该方法在缺血性脑卒中的手术建模中具有明显优势，且更贴近临床实际。此外，使用硅胶头单丝线（尤其结合Longa法）可实现高度可重复的MCAo，相比之下，火焰烧钝的单丝线常导致不完全阻塞和/或蛛网膜下腔出血6。
血管内线栓法可用于建立永久性或短暂性阻塞的模型4,6。为建立短暂性模型，可在缺血一段时间（例如，30 分钟、60 分钟或 2 小时）后撤出线栓，使血流再灌注得以发生。该模型在一定程度上模拟了人类在自发性或治疗性干预（例如，给予 tPA）后血流恢复的情况，以溶解血栓栓塞。对于永久性模型，则只需将线栓留置一段时间（例如，24 小时），不进行再灌注。血管内线栓法的另一优势在于无需进行开颅手术，可保持颅骨完整，避免颅内压和温度的改变。
在本视频中，我们演示如何采用Longa线栓法诱导大脑中动脉阻塞（MCAo）及再灌注。我们还展示了如何执行18分制神经功能缺损评分，并通过2,3,5-三苯基氯化四氮唑（TTC）染色法测定脑梗死体积。
方案
本方案及视频中报告的实验均已获得LSUHSC-S机构动物照护与使用委员会的批准，并符合美国国立卫生研究院（NIH）的指导方针。
注意：本研究使用体重为 25 - 29 g 的雄性 C57BL/6 小鼠。小鼠饲养在独立通风笼具中，采用标准颗粒饲料喂养，并可自由饮水，光照/黑暗周期为 12 小时交替。所有操作均在无菌条件下进行，并采用无菌技术（例如，使用无菌手套、无菌器械）。
1. 术前准备
- 通过腹腔注射（i.p.）给予氯胺酮（150 mg/kg）和赛拉嗪（10 mg/kg）的组合以诱导麻醉。最初每3-5分钟通过足部夹捏监测一次麻醉深度，达到麻醉状态后每10分钟监测一次。动物处于麻醉状态时，使用无菌眼膏以防止角膜干燥。 氯胺酮/赛拉嗪的初始剂量通常可持续约30-40分钟。 若需要，可根据动物对足部夹捏的反应追加给药。
- 将小鼠仰卧置于温度可控的加热垫上，并使用直肠探针确认其体温维持在36.5 ± 0.1 °C。
- 剃除颈部毛发，并用70%乙醇对皮肤进行消毒。
2. 大脑中动脉闭塞（图1）
- 使用直头虹膜剪在颈部正中做切口，并用牵开器牵开软组织以暴露血管。
- 使用杜蒙镊子仔细分离颈总动脉（CCA）和颈外动脉（ECA）周围的组织，避免损伤迷走神经。
- 用6-0丝线在颈总动脉上打一个松结，作为临时结扎线。
- 在颈外动脉及其发出的细小分支血管上（位于颈总动脉分叉远端）进行牢固结扎，形成永久性结扎。
- 在颈总动脉分叉近端的颈外动脉上再打一个结扎线。
- 在颈内动脉（ICA）和翼腭动脉（PPA）上放置微血管夹。
- 使用显微解剖弹簧剪在颈外动脉上做一个小切口，插入直径为180 μm的硅胶头单丝线。切口应尽量靠近永久结扎线，以便于导丝操作。
- 在插入导丝后收紧颈外动脉上的临时结扎线，并移除微血管夹。
- 使用显微解剖弹簧剪在永久性远端结扎线与导丝进入点之间的位置剪断颈外动脉。
- 将导丝沿颈内动脉向前推进，直至感到阻力（约在颈总动脉分叉处远端9–10 μm处到达大脑中动脉）。
注意：如果导丝大部分仍可见时即遇到较大阻力，可能提示导丝已进入翼腭动脉（PPA）。此时应将导丝回撤至分叉处，用杜蒙镊子轻柔地将其推入颈内动脉（ICA），然后继续推进导丝，直至可在颈内动脉内观察到导丝。
3. 再灌注
- 在30分钟的闭塞期后，使用Dumont镊子轻轻向后拉出栓线，并将缝线固定在ECA的开放端。
- 使用Dumont镊子小心松开围绕CCA的临时缝线，解除结扎，恢复CCA的血流。
- 使用连续外科缝合关闭切口。 皮肤闭合可采用连续或间断缝合方式。 皮肤缝合钉也是一种可接受的方法。
- 对小鼠皮下注射1 ml生理盐水以补充液体容量，并注射镇痛药卡洛芬（5 mg/kg，皮下注射），以缓解手术引起的疼痛和不适。需要额外镇痛的迹象包括弓背、毛发凌乱、活动减少、姿势异常以及食欲下降。
- 在麻醉恢复期间，将小鼠置于由温度控制器调节的30 °C加热笼内，并使用加热灯保温；将软化饲料置于培养皿中并放置在笼底，以促进进食。在再灌注期间，每只笼子单独饲养一只小鼠。
4. 假手术
- 对小鼠进行相同的操作，但不插入单丝纤维。
5. 术后神经功能评分（表1；图2）
- 在适当的再灌注期后，使用18分评分系统对小鼠进行神经学评估，评估内容包括一般状况、运动功能、感觉功能和本体感觉。神经学评分越高，表示神经功能越差。
注意：对于判定为无反应且无法行走的小鼠，将实施安乐死。其他人道安乐死标准还包括体重减轻超过20%、呼吸困难以及手术区域周围出现感染。安乐死将使用CO2麻醉舱实施，并通过颈椎脱位或开胸术作为物理方法确认死亡。
6. 脑梗死体积的测量（图3）
- 通过腹腔注射氯胺酮（150 mg/kg）和赛拉嗪（10 mg/kg）的组合诱导麻醉。最初每3-5分钟通过足部夹捏监测麻醉深度，达到麻醉状态后每10分钟监测一次。
- 将小鼠置于仰卧位，使用直头虹膜剪从腹部至颈部剪开皮肤，随后剪开腹膜。
- 使用Dumont镊子抬起胸骨，并剪断肋骨以暴露心脏。
- 使用两把止血钳打开胸腔左右两侧，充分暴露心脏。
- 将连接5 mL注射器的26 G针头插入左心室，同时剪开右心房。用室温生理盐水或磷酸盐缓冲液（PBS）灌注，直至流出液变澄清（通常需3-5分钟）。
- 使用直头虹膜剪和Dumont镊子小心地将颅骨从脑组织上分离移除。
- 使用刀片切除嗅球和小脑，以便脑组织能够适配于切片模具中。使用该模具将脑组织切成厚度均匀的切片。使用前将模具预冷，以保持组织低温。将脑组织放入模具后置于冰上。
- 使用两片刀片将脑组织切成2 mm厚的冠状切片。从顶部下方2 mm处开始进行第一次切割，并将该刀片保留在原位；在第一刀后方再进行一次2 mm的切割。取下带有组织的第一片刀片。重复此过程，直至所有组织均被切片。
注意：完成时应得到4-5个脑片。 - 将脑片放入含有2% 2,3,5-三苯基氯化四氮唑（TTC）的24孔板中，随后将该板置于37 °C的浅水浴中孵育20分钟。将每个脑片分别放入独立孔中，有助于保持其切割顺序。确保TTC溶液完全覆盖所有脑片组织。孵育10分钟后，将所有切片翻面。
- 在新的24孔板各孔中加入少量10%福尔马林溶液，并按原始切割顺序将脑片转移至该板中。
- 将脑片扫描进入计算机，并使用ImageJ分析软件（NIH 1.57图像软件）6分析梗死面积占整个脑切片的百分比6。
- 勾画出梗死区域以获得面积测量值。随后测量对侧半球的总面积。将梗死面积除以对侧半球面积，再乘以100，计算出梗死体积。
结果
小鼠接受30分钟MCAo诱导的脑缺血（图1），随后进行再灌注（本文展示的是24小时和1周的再灌注结果，但再灌注时间可根据需要调整）。MCAo期间的死亡率极低（约2%）。缺血后（最初24小时内）的死亡率约为26%。
采用激光多普勒血流仪在大脑中动脉闭塞/再灌注前后确认大脑中动脉供血区域的血流灌注情况。图4 清楚显示，当短暂结扎的颈总动脉在缺血30分钟后松开，以取出线栓并实现再灌注时，灌注量出现急剧上升，在再灌注5分钟时达到基线灌注水平（即 手术前）的< 100%。
卒中发作后24小时（在测量梗死体积之前），评估与一般状况、感觉、运动及本体感觉功能缺损相关的神经功能评分（表1）。该评分系统旨在为评估提供客观的（“是或否”）标准。图2显示，小鼠（n=27）在24小时时的评分为12.56 ± 0.7，1周后仍保持较高水平（11.50 ± 1.5）。神经功能评分越高，表示神经功能越差。
梗死体积在24小时时呈现出与神经功能评分相似的模式， 即，大于假手术组动物。MCAo 后 24 小时，小鼠出现大面积梗死体积（图3：15.9 ± 2.6%，卒中后1周升高至28.5 ± 1.9%。
图1：大脑中动脉阻断（MCAo）手术位置及脑循环大血管解剖结构示意图。 A. 通过将栓线插入颈外动脉，随后进入近端颈内动脉，实现手术诱导的MCAo。 B-G. 诱导MCAo的操作步骤。前交通动脉（ACA）；大脑中动脉（MCA）；后交通动脉（PcomA）；大脑后动脉（PCA）；基底动脉（BA）；颈内动脉（ICA）；颈外动脉（ECA）；翼腭动脉（PPA）；颈内动脉（ICA）。（经Smith et al.，参考文献#5许可修改。） 请点击此处查看此图的放大版本。
图2：18分制卒中评分。 该综合性卒中评分用于评估卒中后小鼠行为在总体功能以及感觉、运动和本体感觉方面的功能改善情况。数据以均值±标准误表示。*P < 0.05。每组n = 3只小鼠。采用单因素方差分析（ANOVA）结合Bonferroni事后检验进行数据分析。（经许可修改自Smith et al.，参考文献#5。）请点击此处查看该图的放大版本。
图3：C57BL/6小鼠MCAo术后24小时的梗死体积。 小鼠接受30分钟MCAo处理，随后分别进行24小时或1周的再灌注。 A) 取出大脑，切片并用2% 2,3,5-三苯基氯化四氮唑（TTC）染色。在存活组织中，脱氢酶可将TTC酶促还原为红色的1,3,5-三苯基甲臜（TPF），而在缺血组织中该酶无活性，因此组织保持白色。 B) 图表显示脑卒中小鼠的梗死体积增加。数据以均值±标准误表示。**P < 0.002，****P < 0.0001，与假手术组比较；n = 每组4只小鼠。数据采用单因素方差分析（ANOVA）结合Bonferroni事后检验进行分析。比例尺 = 1 cm（经Smith et al.，参考文献#5许可修改）。 请点击此处查看此图的放大版本。
图4：MCA区域在MCAo及再灌注期间的灌注情况。 小鼠接受 30 分钟 MCAo， < 5 分钟再灌注。基线值已标准化为 100%。正如预期，再灌注 5 分钟时的灌注量高于大脑中动脉闭塞（MCAo）时。 即，当组织无灌注时。数据以均值 ± 标准误表示。*P < 0.05。n = 每组3只小鼠。数据采用单因素方差分析（ANOVA）结合Bonferroni事后检验进行分析。（经Smith许可修改） 等 参考文献 #5。 请点击此处以查看此图的放大版本。
表 1：神经系统评分系统。每项测试回答“是”得一分，总分共18分7,8。
| 测试 | 简要描述 | 检测目的？ | 参考文献 |
| Morris water maze | 一种开放场水迷宫实验，啮齿类动物需学会从水中找到并登上隐藏平台以逃脱 | 空间记忆、运动控制及认知地图能力 | 19 |
| Rotarod | 一根水平旋转杆，啮齿类动物需向前行走以避免跌落 | 运动协调性、平衡能力及抓握力 | 20 |
| Pole | 将啮齿类动物置于一根垂直杆上，观察其向下移动进入笼子过程中是否滑落或跌落 | 由皮层损伤引起的运动障碍 | 21, 22 |
| Gait analysis | 当啮齿类动物穿过玻璃板时，记录其足印以分析运动特征 | 行走模式（足部压力、步长、步宽与频率、趾展开度、步态角及身体旋转）及运动协调性 | 23, 24 |
| Sticky label test | 将胶带条贴于啮齿类动物前肢无毛区域，记录接触每只前肢的时间、接触顺序、移除时间及移除顺序 | 前肢感觉敏感性及感觉运动功能缺陷 | 25, 26 |
| Corner | 将啮齿类动物置于两块形成30°夹角的板之间；当其深入角落时，两侧触须均受到刺激，动物会直立并转身面向开口端 | 神经发育障碍及重复性行为（监测朝一个方向与相反方向转身的情况） | 27, 28 |
| Cylinder | 将啮齿类动物放入玻璃圆筒中，记录其直立靠墙时前肢的活动情况 | 运动不对称性及卒中后肢体使用评估 | 28 |
| Staircase | 将啮齿类动物置于一个带有诱饵双侧阶梯的箱体平台中；通过食物限制促进其上楼梯取食 | 独立评估每侧前肢的抓取能力，涉及感觉功能、灵巧性及运动协调性 | 25, 29 |
| Ladder | 啮齿类动物沿水平梯子行走以返回笼中；记录行走过程中足部滑脱情况 | 运动过程中的足部错误；前肢与后肢功能及协调性 | 30 |
表2：小鼠行为学测试示例。
| 关于GLP的建议如下： |
| - 明确说明所选用的卒中模型的具体细节（e.g., Longa法 vs. Koizumi法），以及动物品系、年龄、性别和体重等信息。 |
| - 研究以双盲方式进行。 |
| - 报告统计功效分析结果。 |
| - 在研究开始前预先确定纳入与排除标准，并予以报告。 |
| - 每日监测动物状况（基本外观、体重及行为），观察是否存在痛苦、疼痛或疾病迹象。 |
| - 报告研究中被排除的动物情况。 |
| - 动物分组需进行随机化处理。 |
| - 报告阳性与阴性结果。 |
| - 报告手术时长、麻醉方式、体温及血气情况。 |
| - 报告所使用的环境丰富化措施（如有）。 |
表3：良好实验室规范的建议。
讨论
自20年前首次提出以来，通过插入缝合丝线建立的MCAo模型已被广泛应用于大量人类中风研究中。这主要归因于该模型能够模拟临床上最常见的中风类型所发生的病理过程即， 缺血性卒中）。纹状体对缺血的敏感性高于大脑皮层，因此缺血时间的长短将决定是纹状体和背外侧皮层均受累，还是仅纹状体受损。缺血和再灌注时间均可根据需要进行调整，从而使研究者能够研究与短暂性脑缺血发作（TIAs）到更大范围脑梗死相关的病理效应。
多年来，对MCAo线栓法的改进和问题排查表明，该操作必须在无菌条件下进行，以避免感染风险9。实验结果可能因啮齿类动物的物种、品系（已有报道显示存在解剖学差异）10,11、体重以及所使用的麻醉剂不同而有所差异，但本文所呈现结果的趋势在其他开展MCAo实验的实验室中也可能出现。其他需要考虑的关键步骤包括体温、血压和血气。已有充分证据表明，体温会影响神经损伤程度，低温通常与较小的梗死病灶相关12，而高体温则会导致更严重的神经功能缺损13。因此，应测量并控制体温，例如使用动物体温控制器配合加热垫，将体温维持在36.5 °C。此外，还应注意补充液体体积，并通过在笼底放置软化饲料来促进动物进食。血压和血气6,14均可使用商业供应商提供的常规设备进行便捷的测量与监测。
MCAo 技术的局限性包括在不损伤的情况下正确分离迷走神经与动脉，以及避免将线栓插入到 PPA，这些因素不仅影响诱导脑卒中的有效性，还会影响小鼠的存活率。与其它 体内 MCAo 方法相比，本研究所采用的 Longa 方法最重要的意义在于其较高的存活率。我们还发现，该模型对应着增强的白细胞-内皮细胞相互作用以及增大的梗死体积，因此一旦掌握该技术，它将成为研究脑卒中潜在治疗靶点的优秀工具。
尽管本文未报告相关结果，但仍可进行多种行为学测试，例如莫里斯水迷宫、转棒实验、垂直杆实验、步态分析、黏性标签测试、角落测试、圆筒实验、阶梯实验和梯子实验（详见表2中的详细信息和参考文献）。假手术动物在完成这些行为学测试时无明显困难，而脑卒中动物则表现明显较差。由此引发的一个争议点是，环境富集是否不仅影响大脑中动脉闭塞（MCAo）模型的可重复性，还会影响行为学测试的结果15。目前尚不明确，但在实验室内部以及整个研究过程中对此进行标准化是值得的。
目前有多种不同的检测方法可用于评估卒中结局。我们已介绍了使用激光多普勒进行血流测量、详细的18分神经功能缺损评分以及梗死体积测量。然而，其他方法也同样具有实用价值，例如影像学技术。我们常规采用活体荧光显微镜技术，在麻醉动物体内实时观察脑微循环中的细胞相互作用（表现为炎症反应的特征）65,6,16。与假手术动物相比，大脑中动脉阻塞（MCAo）及再灌注会引发更强烈的脑部炎症反应5,6,16。其他成像方式，如磁共振成像17和正电子发射断层扫描18，也可用于研究，因其能够实现具有临床相关性的纵向观察。
应常规进行脑组织、血浆和血清样本的组织学分析，因为这些分析不仅有助于进一步表征卒中后的病理生理反应及相关机制，而且可能更为重要的是，可使研究人员研究化合物对卒中结局的影响，从而为这种致残性和破坏性疾病提供潜在治疗靶点的重要数据。最后，我们认为研究人员应充分考虑根据研究需求选择最合适的卒中模型，同时必须强制实施GLP（"良好实验室规范"）。有关GLP建议，请参见表3。
披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
本工作由美国国立卫生研究院、国家心肺血液研究所（NIH 和 NHLBI；HL125572-01A1）以及 LSUHSC-S 为 F.N.E. Gavins 提供的启动资金资助。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 雄性 C57BL/6 小鼠 | Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME | #000664 | |
| 盐酸氯胺酮 | Morris & Dickson, Shreveport, LA | 67457-108-10 | |
| 赛拉嗪 | Akorn, Inc, Lake Forest, IL | NADA# 139-236 | |
| 直流温度控制系统 | FHC, Bowdoin, ME | 40-90-8D | |
| 微型直肠热敏电阻探头 | FHC, Bowdoin, ME | 40-80-5D-02 | |
| 加热垫 | FHC, Bowdoin, ME | 40-90-2-06 | |
| 毛发剪 | Amazon, Bellevue, WA | #64800 | |
| 70% 乙醇 | Worldwide Medical Products, Bristol, PA | #51011023 | |
| 解剖显微镜 | Olympus, Center Valley, PA | SZ40 | |
| 虹膜剪（直头） | Fine Science Tools, Foster City, CA | 11251-20 | |
| Dumont 镊子（45° 弯头） | Fine Science Tools, Foster City, CA | 11297-00 | |
| 微血管夹 | Fine Science Tools, Foster City, CA | 18055-05 | |
| 微型解剖弹簧剪（直头） | Fine Science Tools, Foster City, CA | 14088-10 | |
| 牵开器（钝头） | Fine Science Tools, Foster City, CA | 18200-11 (Helen 使用 17022-13) | |
| 棉签 | Fisher Scientific, Waltham, MA | 23-400-100 | |
| 纱布海绵 | Covidien, Mansfield, MA | #9023 | |
| 7-0 编织丝线外科缝合线 | Braintree Scientific, Braintree, MA | SUT-S103 | |
| 0.9% 氯化钠 | Morris & Dickson, Lake Forest, IL | 0409-4888-20 | |
| 6-0 中号 MCAO 缝合线（硅橡胶涂层单丝） | Doccol Corporation, Sharon, MA | 6023PKRe | |
| Sofsilk 6-0 硅胶涂层编织丝线 | Covidien, Mansfield, MA | SUT-14-1 | |
| 卡洛芬 | Pfizer, New York, NY | NADA# 141-199 | |
| Puralube | Dechra, Norwich, UK | NDC 17033-211-38 | |
| Physitemp 温度控制器 | Harvard Apparatus, Holliston, MA | TCAT-2AC | |
| 加热灯 | Harvard Apparatus, Holliston, MA | HL-1 | |
| 激光多普勒探头 | AD Instruments, Colorado Springs, CO | MSP100XP | |
| 24 孔板 | Fisher Scientific, Waltham, MA | #353226 | |
| 磷酸盐缓冲液（PBS） | Life Technologies, Carlsbad, CA | 20012-050 | |
| 单刃剃须刀片 | Fisher Scientific, Waltham, MA | 12-640 | |
| 2,3,5-三苯基氯化四氮唑（TTC） | Sigma Aldrich, St. Louis, MO | T8877-50G | |
| 小鼠脑组织切片模具 | Braintree Scientific, Braintree, MA | BS-A 5000C | |
| 水浴锅 | VWR, Radnor, PA | #182 | |
| 10% 甲醛 | Sigma Aldrich, St. Louis, MO | HT501128-4L | |
| ImageJ 分析软件 | NIH, Bethesda, MD | 免费下载 | |
| 牵开器 | Medical Device Purchase, Newcastle, CA | MP-740 |
参考文献
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