对大脑中动脉闭塞再灌注损伤诱发中风小鼠的手术方法

中风是死亡的第五大原因遍及世界各地，死于该病一人每隔4分钟。超过80万美国人患有每年中风，这不仅是毁灭性的病人，也为他们的家庭。中风是成人残疾的主要原因，年支出估计为在$ 36.5十亿¹的顺序，尽管很少有治疗方法是可用的。

组织纤溶酶原激活物（tPA）是唯一食品和药物管理局（FDA）的许可药物缺血性中风。然而，如果来自中风发作给予患者3-6小时内，并且在这些情况下，有利于仅4％的患者²是唯一有效的。因此，当务之急是中风的重现性好，临床相关动物模型被用于在潜在的治疗策略和治疗这种疾病的发展中提供帮助。要注意， 在体外是很重要在体内模型是必不可少的。

中风的最常见的类型是起源于缺血，约占总笔画的87％。其它笔划是脑内出血（9％）和蛛网膜下腔出血（4％），和最经常由栓子到大脑中动脉（MCA）引起的。这是由于在MCA的根部突出曲线，这导致进入大脑层血流成为打乱。在MCA来源于颈内动脉（ICA）和路线沿着横向沟，在那里它的分支和项目基底节和额叶，顶叶和颞叶，包括主运动和感觉皮层的侧表面。 Willis环是由大脑后动脉被创建连接到脑动脉和后交通动脉。

MCAO的腔内长丝或缝合模型是最广泛使用于中风研究之一。但是，有几个不同的变化，以这种模式的，而这些都是根据微丝是否被插入到颈外动脉（ECA，称为龙格法^）3，或者它是否被插入的ICA（称为小泉法^）4。在小泉方法，在手术侧的总颈动脉（CCA）必须永久如果灯丝被去除以防止在CCA切口出血并列，而在龙格的方法是，必须永久地并列⁵ ECA 。在这里，因为我们认为这是一个远远优于和缺血性中风更临床相关的手术模式将要使用的方法龙格。此外，使用的硅尖单丝的，特别是与龙格的方法，产生了非常重现的MCAO相对于火焰钝化单丝，这往往产生不完全的闭塞和/或蛛网膜下腔出血^6。

腔内长丝方法可作为永久或短暂闭塞^4,6的模型。执行瞬态模型，灯丝一段局部缺血之后去除（ 例如，30分钟，60分钟，或2小时），再灌注被允许发生。该模型中，在一定程度上模拟血流后自发或治疗性干预（ 例如 ，tPA的给药）以裂解在人类中的血栓栓塞凝块的恢复。为永久模型，灯丝在适当位置简单地放置一段时间（ 例如 ，24小时），因此，不发生再灌注。腔内长丝方法的另一个优点是，开颅并不需要执行，从而可以原封不动颅骨和避免在颅内压力和温度的任何变化的事实。

在视频报道该协议与实验得到LSUHSC-S机构动物护理和使用委员会批准并符合美国国立卫生研究院的指导方针。

注:雄性C57BL / 6小鼠重25 - 47克该研究中使用。小鼠保持与自由饮水标准州城颗粒饲料，在单独通风笼12小时光/暗周期下。该过程将使用无菌技术（ 例如 ，无菌手套，无菌仪器）在无菌条件下进行。

1.术前准备工作

1. 诱导用氯胺酮（150毫克/千克）和赛拉嗪（10毫克/千克）的组合麻醉腹膜内注射（IP）。一旦麻醉达到5分钟，每10分钟 - 步行掐最初每3个监测麻醉深度。虽然动物麻醉下，管理无菌眼软膏，以防止干燥。氯胺酮的初始剂量/甲苯噻嗪通常持续AB出30-40分钟。如果需要的话，这是由动物的响应于脚夹送验证额外剂量可以施用。
2. 放置小鼠上的温度调节的热垫仰卧位置并维持体温在36.5±0.1℃，这是使用直肠探针验证。
3. 剃颈部和消毒用70％的乙醇的皮肤。

2. MCA闭塞（图1）

1. 使一个中线颈切口使用虹膜直剪刀和缩回（使用拉钩）软组织以暴露容器。
2. 使用杜蒙钳不破坏迷走神经周围组织解剖CCA和ECA。
3. 用6-0丝线绑围绕CCA一个松散的结，进行临时的缝合。
4. 使周围的ECA一个永久性缝合紧紧结扎血管（远端CCA分叉处），从它延伸较小的船只。
5. 做一个缝合AROUND非洲经委会近端CCA分叉。
6. 周围放置颈内动脉（ICA）和翼腭动脉（PPA）的一个微血管剪辑。
7. 使在ECA的小切口用微解剖弹簧剪刀，并插入一个180微米的硅尖的单丝。晋级尽量靠近永久缝合尽可能为灯丝的操作更加轻松。
8. 拧紧与周围插入长丝的ECA临时缝合，取下夹子微血管。
9. 切永久，远端缝合，并使用微解剖弹簧剪刀长丝的入口点之间的ECA。
10. 通过ICA引导丝，直到感到有阻力（约9 - 10微米超出了CCA分叉）在马华。
    注:在事件感到太大的阻力，而多数长丝仍清晰可见，灯丝可能已进入PPA。如果发生这种情况，拉长丝回分叉处，轻轻脓ħ前进到ICA使用杜蒙钳，和推动长丝，直到它可以在ICA可视化。

3.再灌注

1. 经过30分钟的接合期间，轻轻拉回来使用杜蒙钳拆下灯丝和保护周围的ECA的开口端缝合。
2. 通过仔细地松开使用杜蒙钳和血流通过CCA恢复了结扎删除周围的CCA临时缝合。
3. 用连续外科缝合关闭切口。皮肤的封闭可以通过连续或间断缝合来完成。皮肤缝合钉也是可以接受的方法。
4. 注射小鼠用1ml盐水皮下体积补充和与镇痛卡布洛芬（5毫克/公斤，SC），用于从手术过程，标志指示需要额外的疼痛缓解包括驼背，ungroomed涂层的疼痛和不适的缓解，活性降低，异常装腔作势，和食欲下降。
5. 观察整个从麻醉恢复小鼠中使用使用温度控制器调节的加热灯加热的30℃笼并放置捣碎饲料在培养皿上笼的地板上，以鼓励进食。小鼠将在再灌注期间被容纳每笼之一。

4.假手术

1. 受试小鼠的相同步骤，而不单丝插入。

5.术后神经分数（表1;图2）

1. 神经学评价采用18分制评估总适当的再灌注期后，小鼠;发动机;感觉;本体。较高的神经功能评分相当于减少神经功能。
   注:如果判断反应迟钝，无法行走将小鼠安乐死。出于人道的安乐死其它的标准将包括的重量损失大于20％，呼吸二应力，和感染周围手术区。 _在 CO ₂室将用于安乐死和物理方法进行确认死亡将是颈椎脱位或开胸。

6.脑梗死容积的测量（图3）

1. 诱导用氯胺酮（150毫克/千克）和赛拉嗪（10毫克/千克）由脚捏初始每3注入麻醉的IP监视器深度的组合麻醉 - 5分钟，每10分钟一次麻醉实现。
2. 放置小鼠仰卧位置并使用虹膜直剪刀从腹部到颈部随后腹膜切开皮肤。
3. 抬起使用杜蒙钳胸骨切排骨暴露心脏。
4. 打开左和使用两对止血的胸部右侧，露出心脏。
5. 插入连接于5mL注射器进入左心室一个＆G针和切割右心房。用室温生理盐水或磷灌注德缓冲盐水（PBS），直到流体变得清晰（通常为3 - 5分钟）。
6. 使用虹膜直剪刀和杜蒙钳取出头骨从大脑仔细了。
7. 切断嗅球和使用刀片使大脑将适合在基质小脑。使用此矩阵大脑切成偶数段。寒意矩阵使用前要保持组织凉爽。将脑入矩阵，放在冰上。
8. 切片的大脑使用两个刀片2毫米冠状段。使用开始从顶部2毫米的刀片进行首次降息，并在地方离开这个刀片。使切头背后另有2毫米。除去附着组织中的第一刀片。直到所有组织被切成重复此过程。
   注:应该有4 - 完成后5段。
9. 放置分段成24孔板含2％2,3,5- triphenyltetrazalium氯（TTC），然后将其放置在一个浅水浴吨37℃20分钟。将每个段放入一个单独的井有助于保持他们在他们被切断的顺序。确保TTC解决方案完全覆盖组织片段。 10分钟后，把所有的片上。
10. 放置10％福尔马林的量小到一个新的24孔板的孔中，并在它们被切成顺序的片段转移到该板。
11. 扫描段到计算机并分析梗死大小使用ImageJ分析软件的全脑切片⁶的百分比（NIH 1.57图片软件^）6。
    1. 轮廓梗塞面积以产生面积测量。下一个测量整个对侧半球，以确定该地区。通过对侧半球的区域划分梗塞面积再乘以100来确定梗死体积。

小鼠进行30分钟的MCAO引起的脑缺血（ 图1），随后一个周期再灌注的（24小时和1周在这里提出，但再灌注的长度可以变化）。缺血期间的死亡率是最小的（约2％）。交的缺血，死亡率（第24小时之内）为26％左右。

激光多普勒血流仪被用来确认在之前和MCAO /再灌注后MCA区血流灌注。 图4清楚地表明，当临时CCA领带后缺血灯丝去除和再灌注发生在30分钟释放的，有一浪涌在灌注，达到<基线灌注（ 即 ，在手术前）5分钟到再灌注的100％。

中风发作（前梗死体积的测量）神经学后24小时关于一般，感觉，运动和本体缺陷ogical评分进行评估（ 表1）。该评分系统旨在提供客观的（'yes或no'）的评估标准。 图2显示，在24小时比分为小鼠（n = 27）为12.56±0.7，并保持较高的1周后（11.50±1.5 ）。较高的神经功能评分相当于减少神经功能。

梗死体积为24小时， 也就是说 ，比深水动物更大的镜像模式相似的神经功能评分。 24小时MCAO后，小鼠的大脑梗塞体积（ 图3:15.9±2.6％），其被升高后1周中风（28.5±1.9％）。

图1:示意图显示大脑中动脉闭塞的位置（缺血）手术和脑循环的大血管血管。A.手术缺血经丝插入到实现颈外动脉，然后到中间的近端动脉。BG。步骤诱导缺血。前交通动脉（ACA）;大脑中动脉（MCA）;后交通动脉（PcomA）;大脑后动脉（PCA）;基底动脉（BA）;颈内动脉（ICA）;颈外动脉（ECA）;翼腭动脉（PPA）;颈内动脉（ICA）。 （改性许可史密斯等人，参考＃5） 点击此处查看该图的放大版本。

图2:18点行程分数这个性能综合已经中风成绩评估一般，和感觉，运动和中风后的鼠标行为本体方面的功能改进。数据为均值±SEM。 * P <0.05。 N = 3只/组。使用ANOVA分析数据加一个邦弗朗尼事后检验。 （改性许可史密斯等人，参考＃5） 点击此处查看该图的放大版本。

图3:MCAO小鼠后C57BL / 6小鼠24小时的梗死体积经受30分钟的MCAO 24小时或再灌注A）的脑的1周中除去，切片并用2％的染色2,3,5-。三苯基氯化四唑（TTC）。在活组织，脱氢酶酶减少TTC到1,3,5-之旅henylformazaon（TPF），这是一个红色的颜色，但在局部缺血组织中的酶不是功能性的，所以将组织保持白色。B）中的曲线示出了在小鼠中的增加梗塞体积有过中风。数据为均值±SEM。 ** P <0.002，**** P <0.0001与假; N = 4只/组。使用ANOVA分析数据加一个邦弗朗尼事后检验。比例尺= 1厘米（史密斯等人修改许可，参考＃5） 点击此处查看该图的放大版本。

图4:MCA领土整个缺血再灌注损伤小鼠灌注经受30分钟的缺血和<5分钟再灌注。基准标准化为100％。由于EXPE反恐执行局，灌注5分钟进入再灌注期明显高于缺血， 即没有组织灌注时有发生。数据为均值±SEM。 * P <0.05。 N = 3只/组。使用ANOVA分析数据加一个邦弗朗尼事后检验。 （改性许可史密斯等人，参考＃5） 点击此处查看该图的放大版本。

表1:神经评分系统为一个肯定的回答到每个测试给出一个点。标记出18 7,8。

表2: 小鼠行为测试的例子。

表3:良好实验室规范建议。

作者没有什么可透露的。