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方法文章

使用量子点纳米颗粒的关联光镜与电镜技术

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DOI：

10.3791/54307

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2016年8月7日

 , 
1South Western Sydney Clinical School, Faculty of Medicine, University of New South Wales Australia, 2School of Medicine, Western Sydney University, 3Correlative Microscopy Group, Ingham Institute for Applied Medical Research, 4Electron Microscopy Laboratory, Department of Anatomical Pathology, Sydney South West Pathology Service, New South Wales Health Pathology, 5School of Medical Sciences, Faculty of Medicine, University of New South Wales Australia

本文内容

摘要

本文描述了一种方法，即利用量子点（QD）纳米颗粒对环氧树脂包埋的人类病理组织进行相关免疫细胞化学研究。我们采用 commercially available 的抗体片段偶联量子点，可通过宽场荧光显微镜和透射电子显微镜进行观察。

摘要

本文介绍了一种方法，即利用量子点（QD）纳米颗粒对人类病理组织进行相关免疫细胞化学研究，结合宽场荧光光学显微镜与透射电子显微镜（TEM）进行分析。为展示该实验方案，我们对人类生长抑素瘤肿瘤的超薄环氧切片进行了免疫标记：首先使用针对生长抑素的一抗，随后加入生物素化二抗，并用与链霉亲和素偶联的发射波长为585 nm的硒化镉（CdSe）量子点（QDs）进行显影。将切片置于TEM样品载网上，再放置于玻片上，用于宽场荧光光学显微镜观察。光学显微镜下可见585 nm量子点标记在肿瘤细胞胞质内呈现明亮的橙色荧光，呈颗粒状分布。在低倍至中倍放大条件下，可清晰识别标记模式，并评估非特异性或背景标记水平。此步骤对于后续通过TEM解读免疫标记模式及评估其形态学背景至关重要。随后将同一张切片 blot 干燥后进行TEM观察。结果显示量子点探针结合于单个分泌颗粒内的无定形物质上。从光学显微镜所观察到的同一感兴趣区域（ROI）采集图像，用于相关性分析。随后可将两种模态获得的对应图像进行融合，将荧光数据叠加至相应区域的TEM超微结构图像上。

引言

相关联的光学显微镜与电子显微镜技术（CLEM）是一种用于分析瞬时动态事件1、稀有事件2, 3以及复杂系统4的强有力方法。根据所研究问题的不同，存在多种不同的技术组合方式5，但一个共同的要求是，需对同一样本中的相同结构6采用多种显微成像模式进行观察。我们所采用的CLEM方法专为研究存档的人类病理组织而开发，本研究中使用的案例此前已被充分表征并发表7。该方法的目标首先是最大限度地从单个活检或手术样本中获取分析数据，其次利用荧光光学显微镜帮助阐明在超微结构水平上观察到的免疫细胞化学标记模式的背景信息。

量子点纳米晶体（QDs）具有成为通用标记系统的潜力，可通过荧光显微镜和电子显微镜进行观测8, 9, 10。其晶体核心结构使得不同尺寸的量子点在远偏离其发射光谱波长的光激发下，能够产生广泛的荧光发射峰11。它们的原子量足够高，可产生可通过透射电子显微镜、扫描透射电子显微镜（STEM）或场发射扫描电子显微镜检测到的电子密度。量子点特别适用于免疫细胞化学研究，因为即使单个量子点也可被观察到，从而实现每个靶分子对应一个量子点的极高灵敏度12。此外，根据所使用的量子点类型，它们可能具有适合进行元素定位的独立元素特征。

人体病理学样本为转化生物医学研究提供了重要优势。手术组织和活检样本通常会被提交用于生物样本库保存，在获得适当伦理审批后，可供研究项目使用。与动物或 体外 疾病模型。然而，病理样本的制备往往并不理想，可能存在组织固定延迟、固定剂选择不当（例如透射电镜应使用戊二醛而非福尔马林）以及取样不恰当等问题。关联显微成像技术（CLEM）有望从单个人体样本中获取更优化的诊断与预后信息。然而，一些新近开发的关联成像方法，例如使用微型单线态氧生成器（miniSOG）的技术，由于需要将标签基因编码至目标细胞中，因此无法应用于病理学检测13因此，我们探索了在常规制备的透射电镜组织样本中使用量子点（QD）标记进行相关免疫细胞化学研究的可行性。将量子点应用于经轻度醛类固定后的活检及组织样本的刻蚀环氧或丙烯酸树脂切片，有望从同一样本中获得相关的荧光显微镜与透射电镜数据。

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方案

1. 组织解剖与固定

  1. 组织解剖
    1. 从手术切除的肿瘤标本或组织活检中解剖获取组织块。
      注意：本研究中使用的组织通常用福尔马林固定，但新鲜组织同样适用。我们选择了一个经解剖病理学家通过常规组织学染色及抗生长抑素免疫组化染色（未显示）确认并报告含有生长抑素瘤的区域。
    2. 使用的组织块体积不应超过约 1.0 mm3。
  2. 卡考基酸盐缓冲液的配制
    1. 通过将 21.4 g 二甲胂酸钠（见材料清单）和 3.0 ml 1% 氯化钙溶液加入 90 ml 蒸馏水中，再加水定容至 100 ml，配制储备缓冲液（1 M）。搅拌溶液后静置过夜，使结晶试剂充分溶解。
    2. 取 20 ml 储备液加入 170 ml 水中，配制成工作缓冲液，并用 pH 试纸检测 pH 值。如需调节，加入 3–4 滴 3% 盐酸（HCl）将 pH 调至 7.4，最后加水定容至 200 ml，得到终浓度为 0.1 M 的缓冲液。
  3. 固定液的配制与使用
    1. 将一管 10 ml 的 50% 戊二醛溶液加入 20 ml 二甲胂酸钠储备液（1 M）中，再用蒸馏水稀释至 190 ml。检测 pH 值，必要时滴加 1–4 滴 3% 盐酸（HCl）将 pH 调至 7.4。
    2. 用蒸馏水定容至终体积 200 ml。
    3. 将组织浸入含有 2.5% 戊二醛的 0.1 M 二甲胂酸钠缓冲液（pH 7.4）中，在 4 oC 条件下的玻璃样品管中固定 24 小时。未使用的固定液在 1 周后弃去。

2. 组织处理与包埋

  1. 四氧化锇染色
    1. 固定完成后，将组织浸入0.1 M的二甲胂酸钠缓冲液中20分钟，然后重复一次，再浸入20分钟。
    2. 通过将8.0 ml的5%四氧化锇（OsO4）储备液加入2.0 ml的1 M二甲胂酸钠缓冲液储备液和10.0 ml蒸馏水中，配制2%的水相四氧化锇（OsO4）工作液，最终体积为20.0 ml。
    3. 吸除缓冲液，将组织浸入pH 7.4的2% OsO4溶液中，在室温下孵育4小时。
      注意！倾倒和配制OsO4溶液时需格外小心，始终佩戴适当的个人防护装备，并在通风橱内操作。
  2. 醋酸铀染色
    1. 组织完成四氧化锇处理后，吸除OsO4溶液，将组织浸入2%醋酸钠溶液中10分钟。随后吸除2%醋酸钠溶液，再将组织浸入2%醋酸铀溶液中，在室温下孵育1小时。
  3. 脱水
    1. 通过梯度乙醇对组织进行脱水处理：依次使用50%乙醇10分钟、70%乙醇10分钟、95%乙醇10分钟，以及两次100%乙醇各20分钟，均在室温下进行。
    2. 用100%丙酮更换两次，每次30分钟。
  4. 树脂浸透与固化
    1. 在一次性聚乙烯杯中混合低黏度环氧树脂。加入10.0 g乙烯基环己烯二氧化物（ERL 4221）环氧单体、6 g聚丙二醇二缩水甘油醚（DER 732）和26.0 g壬烯基琥珀酸酐（NSA）。用木棒手动充分搅拌2分钟。
    2. 加入十五滴2-二甲氨基乙醇（DMAE）环氧加速剂，再次搅拌2分钟。注意在加入DMAE加速剂前，必须充分混合ERL、DER和NSA组分。
    3. 开始组织的树脂浸透：先用1:1树脂与丙酮混合液替换100%丙酮，处理1小时；然后用6:1树脂与丙酮混合液处理3小时；最后用100%树脂处理过夜。
    4. 将组织转移至8 mm微型模具中的新鲜树脂中，在70 oC下固化过夜。固化后的树脂应坚硬但不脆。

3. 超薄切片

  1. 刀具、切削参数与切片厚度
    1. 将半薄金刚石刀安装至超薄切片机中，并以500 nm的厚度对组织进行切片。
    2. 将切片漂浮于刀刃后方的水浴表面，用载玻片捞取切片，并在约110 oC的加热板上干燥10至20秒。
    3. 用乙醇钠溶液蚀刻切片20秒，随后以100%乙醇冲洗，再用蒸馏水清洗。在加热板上用2%亚甲蓝溶于1%硼砂溶液中染色20秒，流水冲洗5秒，再于加热板上干燥5秒。随后在加热板上用1.5%碱性品红染色5秒，再于加热板上干燥20秒。
    4. 通过明场光学显微镜观察，确认切片中存在肿瘤细胞及感兴趣区域（ROI）。
    5. 将半薄金刚石刀更换为超薄金刚石刀，并根据刀具制造商的建议设置合适的刀角和切削速度。
    6. 以90 nm的厚度切取超薄切片。当切片漂浮于水浴表面时，观察其呈现的金黄色光泽。
    7. 通过在切片上方数毫米处挥动浸有氯仿的1 cm2滤纸，使切片延展并展平。注意避免氯仿浸润的滤纸接触水面。
  2. 超薄切片网格载网装载
    1. 使用已浸入 切片粘附液的300目细条镍制透射电镜载网，从水面上捞起超薄切片。将切片置于载网的哑光面。载网一侧为哑光或无光泽面，另一侧为抛光或光亮面。无需支持膜。注意：必须使用抗磁镊子操作这些载网，以避免载网粘附在镊子上。
    2. 制备切片粘附液：将20 cm透明胶带放入含2.0 ml丙酮的5 ml小瓶中，盖紧并摇匀，静置10分钟后取出胶带，留下粘附溶液。

4. 免疫标记

  1. 抗原修复
    1. 用蒸馏水配制1 ml新鲜的饱和高碘酸钠蚀刻液，并立即使用。将蚀刻液滴加于洁净的实验室用膜表面。
    2. 将完全干燥的载网切片面朝下置于高碘酸钠溶液液滴上，室温孵育30分钟。随后将载网转移至蒸馏水液滴中清洗60秒。
  2. 抗体孵育与量子点探针标记
    1. 所有孵育和标记步骤均在置于洁净Parafilm表面的液滴上进行。
    2. 将载网置于含0.05 M甘氨酸的PBS液滴中孵育10分钟，以封闭切片中残留的醛基。通过轻轻吸去载网边缘液体的方式去除醛基封闭液。
    3. 将载网置于含1%正常山羊血清（NGS）和1% BSAc（10%）的PBS液滴中孵育10分钟。封闭液的配制方法：将10 μl NGS和100 μl BSAc加入890 μl PBS中，终体积为1,000 μl。
    4. 将载网置于抗体稀释液液滴中孵育10分钟，以对切片进行预处理。
    5. 使用抗生长抑素多克隆抗体进行免疫标记孵育，用抗体稀释液按1:10比例稀释，终浓度为3.47 g/L。注意：抗体孵育过程是将载网置于液滴上，在湿润环境中室温孵育1小时。
    6. 通过吸去载网边缘液体的方式去除步骤4.2.5中的抗体试剂，随后在稀释液中清洗切片，每次5分钟，共清洗2次。
    7. 加入二抗（生物素化的山羊抗兔多克隆抗体），按1:10比例稀释，室温孵育1小时。孵育结束后去除二抗溶液，并在稀释液中清洗2次，每次5分钟。
    8. 加入链霉亲和素偶联的量子点（585 nm），按1:10比例稀释，室温孵育1小时。孵育过程中用铝箔包裹以减少光照。
    9. 用新鲜蒸馏水清洗载网2分钟。用吸水纸吸干载网边缘。

5. 荧光显微镜观察

  1. 光源与滤光片组
    1. 使用365 nm发光二极管（LED）照明进行宽场荧光显微镜观察。插入具有以下特性的滤光立方体：（激发滤光片G 365 nm，二向分光镜FT 395，发射滤光片长通420 nm）。
      注意：此滤光立方体可在同一激发波长下同时观察所有尺寸量子点的发射光谱。
  2. 观察与成像切片
    1. 将免疫染色后的网格切片置于载玻片上的水滴中，切面朝下，加盖玻璃盖玻片（厚度1.5）。使用光学显微镜评估标记模式、非特异性标记程度，并确认阴性对照无标记信号。
    2. 根据网格线确定感兴趣区域（ROI）。使用定位网格有助于建立目标结构的坐标。
    3. 使用全彩数码相机，在相机设置为 "FL 自动颜色" 和 "白平衡" 设定为3,200K。使用相机进行 "自动曝光" 模式，具有 "伽马" 将数值设置在0.45至1.00之间，以优化图像的显示效果 "模拟增益" 设置为1倍。在Zen 2 Lite软件图形界面中点击相机图标以 "活体"，聚焦图像，然后单击 "快照" 将图像捕获到帧存储器中。
    4. 将图像保存为 .tif 文件，以避免压缩和像素化问题的出现。
    5. 制备一张显示 ROI 相对于网格条或其他显著组织标志物位置的打印图像。这些打印图像将有助于后续对切片的导航以及通过透射电子显微镜（TEM）重新定位 ROI。
    6. 从载玻片上取下网格，用蒸馏水清洗，并轻轻吸干边缘。
      注意：获取荧光图像时请勿使用过强的照明。量子点（QDs）具有一定的光稳定性，允许长达数秒的成像时间，但需注意避免延长曝光，因为在水中持续约1分钟后可能出现量子点信号淬灭。只有当标记量子点的切片使用甲苯脱水并按照制造商说明在盖玻片下封片后，才能获得延长或永久的光稳定性。然而，此处理过程将排除后续通过透射电子显微镜（TEM）对同一组织切片进行共定位分析的可能性。

6. 透射电子显微镜

  1. 透射电镜设置与观察
    1. 将载网转移至透射电镜中进行观察，加速电压设为 100 kV。使用约 1,400X 的低倍镜观察，浏览载网区域，找到与光学显微镜图像相对应的兴趣区域（ROIs）。在约 50,000X 放大倍数下观察量子点（QDs）的聚集体。
    2. 在 70,000X 或更高放大倍数下观察单个量子点。量子点呈现为具有中等电子密度的不规则晶体结构。
  2. 成像
    1. 使用数码相机进行透射电镜成像。配备 1,392 × 1,040 像素的单色传感器即可满足需求。
    2. 在成像软件的显微镜图形界面中，点击 "Camera" 图标至 "On" 状态以采集图像，再切换至 "Off" 状态将图像存储于帧缓存中。注意：具体操作可能因所使用的显微镜系统而异。将相机设置为自动曝光模式，"Gamma" 值设为 1.00。
    3. 将图像保存为 .tif 文件格式。

7. CLEM 成像

  1. 通过透射电镜定位荧光 ROI
    1. 使用光学显微镜图像的打印件，通过透射电镜（TEM）定位相应的 ROI。组织结构特征（如血管和管腔结构）有助于在切片中利用透射电镜进行导航。
    2. 通过透射电镜拍摄相应 ROI 的图像。
  2. CLEM 图像叠加
    1. 确保透射电镜图像与光学显微镜图像方向一致，并调整各自的放大倍数，使两种成像模式下观察到的相同结构大小相同。
    2. 对齐光学显微镜和透射电镜图像，并将它们并排显示或叠加，以突出免疫标记 ROI 的超微结构特征。
    3. 使用 Photoshop CS2 创建叠加图像。首先，将荧光图像放大至与低倍透射电镜图像相同的放大倍数。对齐两幅图像，然后将它们并排粘贴到同一画布上。
    4. 合并图像图层。
    5. 从此复合图像创建荧光叠加图层。点击 "矩形选框工具"，选中荧光图像，并从中创建一个副本图层。
    6. 调整 "图层样式/混合选项"，设置透明度为 30 - 40%。
    7. 点击 "移动工具"，将荧光叠加图层拖动至对应的透射电镜图像上方，并对齐图像。
    8. 完成对齐后，"合并图层"，生成最终的叠加图像。
    9. 使用 "矩形选框工具"选中新的叠加图像，复制到新画布中。将其保存为 .tiff 文件。

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结果

本研究所用的生长抑素瘤肿瘤标本由形成导管结构的肿瘤细胞与胶原性间质组织混合构成。通过荧光显微镜观察，含有丰富分泌颗粒的单个肿瘤细胞对生长抑素激素呈阳性标记。细胞核表现为暗色空洞，仅见极少量非特异性标记（图1）。在低倍镜下，这些特征明确的肿瘤细胞胞质中可见强度不一的颗粒状橙色荧光。荧光的橙色由所用量子点（QD）的尺寸决定。本研究采用585 nm量子点，其在365 nm光激发下发射橙色信号。

可对同一细胞进行CLEM分析（图2）。通过在透射电子显微镜（TEM）检查中使用与光学显微镜观察相同的载网，可在两种成像模式下识别并成像同一感兴趣区域（ROI）。在光学显微镜下观察到的组织结构与载网条之间的相对位置关系，在TEM中同样可见，并可用于导航定位。通过参考20倍光学显微镜图像，并记录组织特征与载网条的相对位置，即可找到ROI。

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讨论

本研究已证明量子点（QDs）作为CLEM研究通用探针的潜在用途。所使用的585 nm量子点纳米颗粒在宽场光学显微镜下表现出明亮且稳定的荧光，并可被透射电子显微镜轻松观察到。先前由本文作者之一进行的一项研究显示，量子点也适用于超分辨率光学显微镜7。其光稳定性在长时间观察和长时成像曝光中尤为有用。此外，量子点还可用于多重免疫组织化学分析，不同尺寸的探针可在相同激发波长下同时发射不同颜色的光谱。

量子点（QDs）具有足够的原子量，可通过透射电子显微镜（TEM）进行观察，但其可视性取决于所用纳米颗粒的大小，实际操作中存在一定挑战。在光学显微镜下，我们发现525 nm的量子点（绿色）相比更大的585 nm（橙色）和655 nm（红色）形式，产生的背景标记更少。然而，在本研究中我们选择使用较大的585 nm量子点，以便更方便地通过TEM观察标记情况。较小的525 nm量子点尺寸约为3–5 nm，而较大的585 nm形式约为6–8 nm，655 nm量子点则约为8–10 nm。在TEM下观察，585 nm量子点呈不规则的晶体形态，具有中等电子密度。它们的外形不如传统的胶体金...

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披露

作者声明无利益冲突。

致谢

作者希望感谢澳大利亚新南威尔士州利物浦市新南威尔士州卫生病理学悉尼西南病理服务（SSWPS）解剖病理学部门及免疫组织化学实验室吴小娟（Xiao Juan Wu）的支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
二甲胂酸钠ProscitechC0205有害化学品
四氧化锇ProscitechC010仅可在通风橱中使用
醋酸铀酰Univar-Ajax569危险化学品
乙醇 100%FronineJJ008
丙酮 100%FronineJJ006
ERL 4221ProscitechC056
DER 732ProscitechC047
NSAProscitechC059
DMAEProscitechC050
偏高碘酸钠Analar BDH10259
生长抑素抗体DakoA0566
抗体稀释液DakoS3022
Qdot 585 链霉亲和素偶联物 InvitrogenQ10113MP
生物素化山羊抗兔 IgG 抗体SigmaB7389-1ML
戊二醛 50%EMS16320
正常山羊血清InvitrogenPCN5000
PBS "Dulbecco A"Oxoid BR0014G
牛血清白蛋白 c (10%)Aurion900.022
封口膜Pechiney PPM
pH 指示试纸 (pH 2.0 - 9.0)Merck1.09584.0001
微型模具ProscitechRL063
金刚石刀DiatomeUltra 45
透射电子显微镜FEIMorgagni 268D
荧光光学显微镜Carl ZeissAxioscope A1
镍网 300 目（细条型）Agar ScientificG2740N
超薄切片机RMCPowertome
透射电镜相机控制软件Soft Imaging SystemAnalySISVersion 3.0
图像处理软件Adobe Systems IncorporatedPhotoshop CS2

参考文献

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