Method Article

相关轻型和电子显微镜使用量子点纳米粒子

DOI:

10.3791/54307

⸱

August 7th, 2016

 , 
1South Western Sydney Clinical School, Faculty of Medicine, University of New South Wales Australia, 2School of Medicine, Western Sydney University, 3Correlative Microscopy Group, Ingham Institute for Applied Medical Research, 4Electron Microscopy Laboratory, Department of Anatomical Pathology, Sydney South West Pathology Service, New South Wales Health Pathology, 5School of Medical Sciences, Faculty of Medicine, University of New South Wales Australia

In This Article

Summary

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描述了一种方法，其中量子点 （QD） 纳米颗粒可用于环氧树脂包埋的人类病理组织的相关免疫细胞化学研究。我们采用市售抗体片段偶联的 QD，这些 QD 可通过宽场荧光显微镜和透射电子显微镜进行可视化。

Abstract

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描述了一种方法，即量子点（QD）纳米颗粒可用于使用宽视场荧光光镜和透射电子显微镜（TEM）人体病理学组织相关的免疫细胞化学研究。为了证明我们已经用初级抗体对促生长素抑制素免疫标记人生长抑素瘤的超薄环氧部分的协议，其次是生物素化的二级抗体和可视化用链霉缀585nm的镉 - 硒（硒化镉）量子点（QDs）。的部分被安装在TEM样品网格，然后通过宽视场荧光光镜放置在载玻片观察。光镜显示585纳米量子点标记为明亮的橙色荧光形成肿瘤细胞的细胞质中的颗粒图案。在通过光学显微镜低中档放大率标签图案可以容易地识别和非特异性或背景标记的水平进行评估。这是一个关键步骤，通过TEM免疫标记图案的后续解释和评价形态上下文。然后相同部分被吸干并用TEM观察。 QD探针被视为要附加到包含在个别分泌颗粒无定形物质。图像是从减光镜进行相关性分析可见感兴趣区域（ROI）的同一区域收购。从每个模态对应的图像随后可以被混合以覆盖上相应的区域的TEM超微结构荧光数据。

Introduction

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相关轻型和电子显微镜（CLEM）是一种瞬态动态事件1，罕见的事件2,3和复杂系统4的分析功能强大的方法。有可用5取决于问题的许多不同技术的排列被要求然而一个共同要求是一个单一的样品6中相同的结构由多个显微镜模式成像。我们对特殊CLEM方法被用于存档人体病理学组织的研究，用在这里得到了很好的表征，此前公布的7的情况下开发的。其目的是首先从单个活检或手术样品其次最大化的分析数据，以使用荧光光学显微镜帮助阐明在超微结构水平看到的免疫细胞化学标记图案的情况下。

量子点纳米晶体（量子点）提供了一个通用的标记系统ABL的潜力由两个被看作即，荧光光镜和电镜8，9，10，它们的结晶核结构允许不同尺寸的量子点，当通过光波长远离其发射光谱11激发而产生的广泛的荧光发射峰。其原子量是足以产生电子密度是通过透射电子显微镜，扫描透射电子显微镜（STEM）或场发射扫描电子显微镜检测。它们特别适合于免疫细胞化学研究，作为甚至单个量子点可观察到给予每靶分子12 1 QD的最终的灵敏度。此外，根据不同的QD使用它们可具有适于映射的个体元素的签名。

人体病理学样品提供翻译生物医学研究显著的好处。外科组织活检标本例行提交的生物样本库和appropriate道德间隙....

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Protocol

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1.组织剥离和固定

  1. 组织剥离
    1. 从手术切除肿瘤样品或组织活检解剖组织片。
      注意:在此研究中使用的组织进行常规福尔马林固定，但新鲜组织也是合适的。我们选择了确认，并报告通过解剖病理学家以包含常规的组织学染色和抗促生长素抑制素的免疫染色（未示出）之后生长抑素瘤的区域。
    2. 使用组织片不高于约1.0 立方毫米大。
  2. 二甲胂酸缓冲液配制
    1. 通过加入21.4克二甲胂酸钠中制备储备缓冲溶液（1M）（见材料列表）和3.0毫升的1％氯化钙溶液至90毫升蒸馏水中，然后补足溶液至100ml的最终体积。搅拌溶液，并把它放置过夜使结晶完全试剂溶解。
    2. 通过加入20毫升原液到170毫升水中，然后检查pH值试纸准备一个缓冲工作溶液。 3％的HCl 4滴 - 通过加入3将pH调节至7.4。补足溶液至200毫升的最终体积为0.1米的最终摩尔浓度
  3. 固色剂的制备和使用
    1. 的50％戊二醛溶液1个10 ml安瓿加入到20ml的二甲胂酸钠储备溶液（1 M）。用蒸馏水补足到190毫升检查pH值，并通过添加1调整到7.4 - 3％的盐酸（HCl）如必要4滴。
    2. 补足蒸馏水，使200毫升的最终体积。
    3. 浸入所述组织中含有2.5％戊二醛的0.1....

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Results

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用于该研究的生长抑素瘤样品包括形成具有胶原造口组织混合导管结构的肿瘤细胞。通过荧光光镜，含有丰富的分泌颗粒个体肿瘤细胞表现为生长抑素激素阳性标记。细胞核出现暗孔以最小非特异性标记检测的（ 图1）。在低倍率，可变地激烈粒状橙色荧光被认为在这些充分表征的肿瘤细胞的细胞质中。荧光的橙色由QD使用的大小决定。在这项研究中，我们使用585纳米的量子点时365纳米的光激发时发出橙色信号。

同一小区的CLEM分析是可能的（ 图2）。使用相同的网格，通过光学显微镜透射电镜观察允许的投资回报看，以识别和IM在岁的两种模式。光镜所见有关尘棒相同的组织结构用TEM观察和用于导航。在ROI被通过参照一个20X光学显微镜图像，并注意到组织特性相对于尘棒找到。

TEM示生长抑素阳性细胞的细胞.......

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Discussion

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这项研究表明量子点的潜在效用为CLEM研究通用探头。由宽视场光学显微镜观察和透射电镜容易观察时使用的585纳米的纳米QD显示明亮，稳定的荧光。先前的研究由本作者之一显示量子点还适合于超分辨率光镜7。他们的耐光性是延长时间观看和长成像曝光特别有用。量子点也可以被用于以相同的激发波长下不同尺寸的探头的同时发射不同颜色的光谱多路复用免疫组织化学。

量子点具有足够的原子量，以通过TEM进行可视化，但是这被发现根据所用的纳米颗粒的大小要挑战。光镜，我们已经发现525纳米的量子点（绿色）相比较大的585纳米（橙色）和655纳米（红）的形式产生较少背景标记。然而，我们选择使用较大的585纳米的QD在本研究中，以使通过TEM标记更方便可视化。较小的525纳米的量子点的尺寸大约为3 - 5纳米，而较大的585纳米的形式是约6 - 8纳米和655纳米的量子点约8 - 10纳米。透射电镜观察时，585纳米量子点具有不规则形状的结晶中度电子密度。他们不是圆形或电子致密更传统的胶体金免疫细胞化学探针。然而，量子点已经显示出产量可达10倍更有效的标记比胶体金9

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Disclosures

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作者没有需要披露的利益冲突。

Acknowledgements

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作者感谢 Xiao Juan Wu（免疫组织化学实验室）和澳大利亚新南威尔士州利物浦市新南威尔士州健康病理学悉尼西南病理学服务中心 （SSWPS） 解剖病理学系的支持。

....

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
二甲胂酸钠ProscitechC0205有害化学物质
四氧化锇ProscitechC010仅在通风橱中使用
乙酸铀酰Univar-Ajax569危险化学品
乙醇 100%FronineJJ008
丙酮 100%FronineJJ006
ERL 4221ProscitechC056
DER 732ProscitechC047
NSAProscitechC059
DMAEProscitechC050
偏高碘酸钠Analar BDH10259
抗生长抑素抗体DakoA0566
抗体稀释剂DakoS3022
Qdot 585 链霉亲和素偶联物 InvitrogenQ10113MP
生物素化山羊抗兔 IgG 抗体SigmaB7389-1ML
戊二醛 50%EMS16320
正常山羊血清InvitrogenPCN5000
PBS "Dulbecco A"Oxoid 
BSAc （10%）Aurion900.022
石蜡膜Pechiney PPM
pH 试纸条 （pH 2.0 - 9.0）Merck1.09584.0001
MicromouldsProscitechRL063
金刚石刀硅藻Ultra 45
透射电子显微镜FEIMorgagni 268D
荧光显微镜卡尔蔡司Axioscope A1
网格 300 目镍（薄棒）琼脂科学G2740N
超薄切片机RMCPowertome
TEM 相机控制软件软成像系统AnalySIS3.0
版图像处理软件Adobe Systems合并Photoshop CS2
BR0014G

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Kukulski, W., Schorb, M., Welsch, S., Picco, A., Kaksonen, M., Briggs, J. A. Correlated fluorescence and 3D electron microscopy with high sensitivity and spatial precision. J Cell Biol. 192 (1), 111-119 (2011).
  2. Introduction to correlative light and electron micr....

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