使用量子点纳米颗粒的关联光镜与电镜技术

摘要

本文描述了一种方法，即利用量子点（QD）纳米颗粒对环氧树脂包埋的人类病理组织进行相关免疫细胞化学研究。我们采用 commercially available 的抗体片段偶联量子点，可通过宽场荧光显微镜和透射电子显微镜进行观察。

摘要

本文介绍了一种方法，即利用量子点（QD）纳米颗粒对人类病理组织进行相关免疫细胞化学研究，结合宽场荧光光学显微镜与透射电子显微镜（TEM）进行分析。为展示该实验方案，我们对人类生长抑素瘤肿瘤的超薄环氧切片进行了免疫标记：首先使用针对生长抑素的一抗，随后加入生物素化二抗，并用与链霉亲和素偶联的发射波长为585 nm的硒化镉（CdSe）量子点（QDs）进行显影。将切片置于TEM样品载网上，再放置于玻片上，用于宽场荧光光学显微镜观察。光学显微镜下可见585 nm量子点标记在肿瘤细胞胞质内呈现明亮的橙色荧光，呈颗粒状分布。在低倍至中倍放大条件下，可清晰识别标记模式，并评估非特异性或背景标记水平。此步骤对于后续通过TEM解读免疫标记模式及评估其形态学背景至关重要。随后将同一张切片 blot 干燥后进行TEM观察。结果显示量子点探针结合于单个分泌颗粒内的无定形物质上。从光学显微镜所观察到的同一感兴趣区域（ROI）采集图像，用于相关性分析。随后可将两种模态获得的对应图像进行融合，将荧光数据叠加至相应区域的TEM超微结构图像上。

引言

相关联的光学显微镜与电子显微镜技术（CLEM）是一种用于分析瞬时动态事件¹、稀有事件^{2, 3}以及复杂系统⁴的强有力方法。根据所研究问题的不同，存在多种不同的技术组合方式⁵，但一个共同的要求是，需对同一样本中的相同结构⁶采用多种显微成像模式进行观察。我们所采用的CLEM方法专为研究存档的人类病理组织而开发，本研究中使用的案例此前已被充分表征并发表⁷。该方法的目标首先是最大限度地从单个活检或手术样本中获取分析数据，其次利用荧光光学显微镜帮助阐明在超微结构水平上观察到的免疫细胞化学标记模式的背景信息。

量子点纳米晶体（QDs）具有成为通用标记系统的潜力，可通过荧光显微镜和电子显微镜进行观测^{8, 9, 10}。其晶体核心结构使得不同尺寸的量子点在远偏离其发射光谱波长的光激发下，能够产生广泛的荧光发射峰¹¹。它们的原子量足够高，可产生可通过透射电子显微镜、扫描透射电子显微镜（STEM）或场发射扫描电子显微镜检测到的电子密度。量子点特别适用于免疫细胞化学研究，因为即使单个量子点也可被观察到，从而实现每个靶分子对应一个量子点的极高灵敏度¹²。此外，根据所使用的量子点类型，它们可能具有适合进行元素定位的独立元素特征。

人体病理学样本为转化生物医....

方案

1. 组织解剖与固定

1. 组织解剖
   1. 从手术切除的肿瘤标本或组织活检中解剖获取组织块。
      注意：本研究中使用的组织通常用福尔马林固定，但新鲜组织同样适用。我们选择了一个经解剖病理学家通过常规组织学染色及抗生长抑素免疫组化染色（未显示）确认并报告含有生长抑素瘤的区域。
   2. 使用的组织块体积不应超过约 1.0 mm³。
2. 卡考基酸盐缓冲液的配制
   1. 通过将 21.4 g 二甲胂酸钠（见材料清单）和 3.0 ml 1% 氯化钙溶液加入 90 ml 蒸馏水中，再加水定容至 100 ml，配制储备缓冲液（1 M）。搅拌溶液后静置过夜，使结晶试剂充分溶解。
   2. 取 20 ml 储备液加入 170 ml 水中，配制成工作缓冲液，并用 pH 试纸检测 pH 值。如需调节，加入 3–4 滴 3% 盐酸（HCl）将 pH 调至 7.4，最后加水定容至 200 ml，得到终浓度为 0.1 M 的缓冲液。
3. 固定液的配制与使用
   1. 将一管 10 ml 的 50% 戊二醛溶液加入 20 ml 二甲胂酸钠储备液（1 M）中，再用蒸馏水稀释至 190 ml。检测 pH 值，必要时滴加 1–4 滴 3% 盐酸（HCl）将....

结果

本研究所用的生长抑素瘤肿瘤标本由形成导管结构的肿瘤细胞与胶原性间质组织混合构成。通过荧光显微镜观察，含有丰富分泌颗粒的单个肿瘤细胞对生长抑素激素呈阳性标记。细胞核表现为暗色空洞，仅见极少量非特异性标记（图1）。在低倍镜下，这些特征明确的肿瘤细胞胞质中可见强度不一的颗粒状橙色荧光。荧光的橙色由所用量子点（QD）的尺寸决定。本研究采用585 nm量子点，其在365 nm光激发下发射橙色信号。

可对同一细胞进行CLEM分析（图2）。通过在透射电子显微镜（TEM）检查中使用与光学显微镜观察相同的载网，可在两种成像模式下识别并成像同一感兴趣区域（ROI）。在光学显微镜下观察到的组织结构与载网条之间的相对位置关系，在TEM中同样可见，并可用于导航定位。通过参考20倍光学显微镜图像，并记录组织特征与载网条的相对位置，即可找到ROI。

讨论

本研究已证明量子点（QDs）作为CLEM研究通用探针的潜在用途。所使用的585 nm量子点纳米颗粒在宽场光学显微镜下表现出明亮且稳定的荧光，并可被透射电子显微镜轻松观察到。先前由本文作者之一进行的一项研究显示，量子点也适用于超分辨率光学显微镜⁷。其光稳定性在长时间观察和长时成像曝光中尤为有用。此外，量子点还可用于多重免疫组织化学分析，不同尺寸的探针可在相同激发波长下同时发射不同颜色的光谱。

量子点（QDs）具有足够的原子量，可通过透射电子显微镜（TEM）进行观察，但其可视性取决于所用纳米颗粒的大小，实际操作中存在一定挑战。在光学显微镜下，我们发现525 nm的量子点（绿色）相比更大的585 nm（橙色）和655 nm（红色）形式，产生的背景标记更少。然而，在本研究中我们选择使用较大的585 nm量子点，以便更方便地通过TEM观察标记情况。较小的525 nm量子点尺寸约为3–5 nm，而较大的585 nm形式约为6–8 nm，655 nm量子点则约为8–10 nm。在TEM下观察，585 nm量子点呈不规则的晶体形态，具有中等电子密度。它们的外形不如传统的胶体金.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
二甲胂酸钠	Proscitech	C0205	有害化学品
四氧化锇	Proscitech	C010	仅可在通风橱中使用
醋酸铀酰	Univar-Ajax	569	危险化学品
乙醇 100%	Fronine	JJ008
丙酮 100%	Fronine	JJ006
ERL 4221	Proscitech	C056
DER 732	Proscitech	C047
NSA	Proscitech	C059
DMAE	Proscitech	C050
偏高碘酸钠	Analar BDH	10259
生长抑素抗体	Dako	A0566
抗体稀释液	Dako	S3022
Qdot 585 链霉亲和素偶联物	Invitrogen	Q10113MP
生物素化山羊抗兔 IgG 抗体	Sigma	B7389-1ML
戊二醛 50%	EMS	16320
正常山羊血清	Invitrogen	PCN5000
PBS "Dulbecco A"	Oxoid	BR0014G
牛血清白蛋白 c (10%)	Aurion	900.022
封口膜	Pechiney PP	M
pH 指示试纸 (pH 2.0 - 9.0)	Merck	1.09584.0001
微型模具	Proscitech	RL063
金刚石刀	Diatome	Ultra 45
透射电子显微镜	FEI	Morgagni 268D
荧光光学显微镜	Carl Zeiss	Axioscope A1
镍网 300 目（细条型）	Agar Scientific	G2740N
超薄切片机	RMC	Powertome
透射电镜相机控制软件	Soft Imaging System	AnalySIS	Version 3.0
图像处理软件	Adobe Systems Incorporated	Photoshop CS2