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成像钙离子 果蝇 在卵子激活时

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DOI：

10.3791/54311

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2016年8月6日

 ,  , 
1Department of Zoology, University of Cambridge

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

本文描述了一种可调节的 离体 Ca成像的实验方案2+ 卵子激活过程中 果蝇.

摘要

卵子激活是一个普遍存在的过程，包含一系列事件，使受精卵能够完成减数分裂并启动胚胎发育。在所有已研究的生物中都保守存在的一种卵子激活特征是细胞内钙离子（Ca2+）浓度的变化，通常称为“Ca2+ 波”。尽管不同物种之间Ca2+波的传播速度和振荡次数有所不同，但细胞内Ca2+的变化对于触发胚胎发育所必需的关键事件至关重要。这些变化包括细胞周期的恢复、mRNA调控、皮质颗粒的胞吐作用以及细胞骨架的重排。

在成熟的Drosophila卵中，激活过程发生在雌性输卵管内，早于受精，启动一系列依赖Ca2+的事件。本文介绍了一种用于成像Drosophila中Ca2+波的实验方案。该方法提供了一个可操控的模型系统，用于探究Ca2+波的机制及其相关的下游变化。

引言

卵母细胞激活时细胞内 Ca2+ 浓度的变化是所有已研究生物体中保守的组成部分1,2。这一事件启动了多种 Ca2+ 依赖性过程，包括细胞周期的恢复以及储存的 mRNA 的翻译。由于 Ca2+ 的这一关键作用，可视化细胞内 Ca2+ 浓度的瞬时变化一直是研究的重点。

历史上，卵子激活研究中模式生物的选择主要基于其卵子的大小和可获得性。在这些系统中，已采用多种可视化方法来追踪和量化细胞内 Ca2+ 浓度的变化，包括：使用光蛋白水母素（aequorin）研究青鳉鱼3；使用对 Ca2+ 敏感的荧光染料 Fura-2 研究海胆和仓鼠4,5；以及使用钙绿-1-葡聚糖（calcium green-1-dextran）研究Xenopus6。

遗传编码钙指示剂（GECIs）的开发与优化极大地提升了对Ca²⁺动态的可视化观测能力2+ 动力学 体内 7这些遗传构建体在特定组织中表达，从而减少了对侵入性组织制备的需求 8.

GCaMP 是一类基于绿色荧光蛋白（GFP）的基因编码钙离子指示剂（GECI），因其对钙离子具有高灵敏度而被广泛应用2+ 亲和力、信噪比和可定制性 9-11。在 Ca 存在的情况下2+，GCaMP复合物会经历一系列构象变化，首先始于Ca²⁺的结合2+ 与钙调蛋白结合，导致GFP组分的荧光强度增加 9.

GCaMP 已被广泛用于研究 果蝇 神经元以可视化细胞内钙的变化12. 近期将GCaMP技术应用于可视化Ca2+ 在成熟阶段 果蝇 卵子的研究揭示了一种单一的瞬时Ca2+ 卵子激活时的波动 13,14. 钙2+ 排卵期间可在低倍镜下观察到波动现象 体内 13 或使用更高放大倍数的 离体 活化检测 13,14. 在 离体 检测时，从卵巢中分离单个成熟卵母细胞，并使用低渗溶液（称为激活缓冲液）进行激活，该溶液已被证明可重现受精过程中的事件 体内 激活 15-17.

该ex vivo检测方法可在不同实验条件下（包括药物干扰、物理操作和基因突变体）实现对Ca2+波的高分辨率便捷观察。本文展示了成熟Drosophila卵的制备过程，用于ex vivo激活，以及随后利用GCaMP进行显微观察以可视化Ca2+波的方法。该方法可用于研究Ca2+波的起始与调控机制，并探究其下游效应。

方案

注意：除非另有说明，所有步骤均在室温下进行。

1. 解剖前准备

注意：此处所述步骤遵循普林斯顿大学 E. Gavis 的方法 & Weil 等 18在成像前两天执行以下步骤。

  1. 取一个含有约 10 ml 固体培养基的果蝇培养管，在其中一个角落加入少量干酵母，少于 1 g 即可。
    注意：有关果蝇培养管或培养基的信息，请参见“Drosophila Maintenance”19。
  2. 加入 1 - 3 滴水以润湿酵母。
  3. 将培养管以 45° 角倾斜放置，静置 3 - 5 分钟，使酵母充分吸水。
  4. 在酵母吸水的同时，选择一瓶近期羽化的、由 tub-VP16GAL4 驱动表达 UASt-myrGCaMP520 的果蝇（以下简称 GCaMP5）；选用该 GCaMP5 的豆蔻酰化形式，可通过将 GECI 锚定在卵细胞膜上，从而提高信噪比。
  5. 用 CO2 气体麻醉瓶中的果蝇。注意保持瓶子倒置，避免果蝇陷入湿润的培养基中而丢失。
  6. 将麻醉后的果蝇轻轻倾倒至 CO2 垫上，在解剖显微镜下用毛笔挑选 10 - 15 只雌蝇和 5 只雄蝇。注意：通常加入雄蝇有助于维持雌蝇的健康状态，便于后续解剖。
  7. 当步骤 1.3 中的培养管准备就绪后，将挑选好的果蝇加入该培养管中。注意在果蝇恢复活动前保持培养管水平放置。
  8. 将培养管置于 25 °C 环境中培养约 36 小时。
  9. 将 CO2 垫上剩余的果蝇放回原瓶或妥善处理。

2. 解剖 Drosophila 卵巢

注意：此处描述的步骤遵循 Weil et. al. 18 的方法。

  1. 36 小时后，用 CO2 麻醉含酵母培养瓶中的果蝇。
  2. 当瓶内果蝇被麻醉后，将其倒在 CO2 垫上，并在解剖显微镜下用毛笔进行分选。
  3. 选择一只雌性果蝇。
  4. 从该雌性果蝇中分离出两枚卵巢。完整详细的操作步骤参见 Weil et. al. 18。简要步骤如下：
    1. 在一块 1.5 号、22 × 40 mm 的盖玻片上，滴加一小滴充氧卤代烃油（95 系列）。
    2. 用镊子夹住果蝇腹部前端。
    3. 在解剖显微镜下固定果蝇，用第二把镊子轻轻移除果蝇的后部。
    4. 用第二把镊子擦拭去除沾附的后部组织。
    5. 用第二把镊子从腹部前端向后端轻轻挤压腹腔，两枚不透明的卵巢应会随镊子被带出体外。
    6. 将卵巢轻轻触入油滴中。
    7. 通过擦拭镊子去除残留组织。
    8. 重复上述步骤（2.4.1–2.4.7），制备三张盖玻片，每张包含一只果蝇的卵巢。

3. 分离单个成熟卵细胞

  1. 在体视显微镜下，将放大倍数设为4倍，取步骤2.4中的第一张盖玻片，通过撕裂输卵管分离两个卵巢。
  2. 将一对闭合的镊子插入单个卵巢的中心，注意不要刺破任何卵室。
  3. 将标准体视解剖探针插入卵巢中心，紧邻闭合的镊子。
  4. 轻轻将解剖探针从卵巢中心向后极拖动，成熟卵（14期卵室）位于后极。
  5. 根据卵巢大小和卵的数量，重复步骤3.1–3.4共2–5次。
    注意：添加CO2通常会导致单个卵的产出，该卵比未产出的卵更大，且背侧附肢隆起。由于该卵已在雌性体内被激活，因此成像时应弃用。
    注意：成熟卵通常容易从卵巢结缔组织中分离。
  6. 如果在卵巢外未见成熟卵，继续用解剖探针轻轻分离。
  7. 当成熟卵出现在盖玻片上卵巢外部时，将3–5个卵在盖玻片中央排成一行。
    注意：为获得最佳效果，可轻轻沿卵的侧面滑动探针。
    注意：避免牵拉背侧附肢，以免损伤卵。
    注意：根据后续成像设置，可将卵垂直于盖玻片方向间隔约200 µm排列，以获得最大成像区域。
  8. 排列完成后，用镊子将剩余的卵巢组织从排列好的卵旁拖走。
  9. 用医用擦拭纸的角落轻蘸去除多余的油。注意不要让擦拭纸接触成熟卵，否则接触的卵将会丢失。
  10. 用记号笔在盖玻片上画十字线，以便在显微镜下快速定位样品。
  11. 将盖玻片置于安全处，让制备好的卵室在盖玻片上静置5–10分钟，使卵在油中稳定。样品在解剖后1小时内均可使用。
  12. 对其他带有卵巢的盖玻片重复步骤3.1–3.11。

4. 成像前准备

  1. 将预先配制的激活缓冲液15恢复至室温。
    注意：激活缓冲液为低渗缓冲液，成分为：3.3 mM NaH2PO4、16.6 mM KH2PO4、10 mM NaCl、50 mM KCl、5% 聚乙二醇 8,000、2 mM CaCl2，用 NaOH 与 KOH 按 1:5 的比例调节 pH 至 6.4。更多详细信息请参见 Mahowald, 1983 15。激活缓冲液分装后可于 -20 °C 保存数月，或于 4 °C 保存最多两周。
  2. 小心地将预先制备的盖玻片、激活缓冲液和玻璃移液管运送至成像实验平台。
    注意：可使用宽场、共聚焦、转盘或光片显微镜。我们建议使用倒置显微镜。本研究的代表性结果使用共聚焦显微镜获得。
  3. 选择适合对完整成熟卵进行成像的物镜（此处使用：20X 0.7 NA）。
  4. 将第一张制备好的盖玻片安装到显微镜载物台上。注意避免盖玻片在载物台上破裂。
  5. 在视野中定性选择一个含有成熟卵室的区域用于激活。避免对已穿刺的卵室或细胞膜出现出泡现象的样本进行成像。
    注意：步骤 4.6 至 4.7 中的软件操作命令将因显微镜型号和制造商而异。
  6. 设置标准 GFP 激发（488 nm）和发射（500 - 580 nm）的成像参数。同时设置明场成像模式，以便观察和定位成熟卵及移位的油滴。
  7. 选择成熟卵可见的最底层 Z 平面，并设置全 Z 层扫描，总厚度 40 µm，步长约为 2 µm。设置参数以确保 Z 层扫描之间无延迟。设置时间序列采集，持续约 30 分钟。

5. 成像 离体 卵子激活

  1. 开始图像采集。
  2. 等待 1 - 2 个完整的 Z 轴扫描完成。此时可观察到激活前的成熟卵子。
  3. 用玻璃移液管吸取约 300 µl 激活缓冲液。
  4. 将装有激活缓冲液的玻璃移液管尖端以 45° 角置于盖玻片上方，缓慢将其移入光路中，直至位于正在成像的成熟卵子正上方。玻璃移液管应位于浸油上方 1 - 2 cm 处。
  5. 在不到 5 秒的时间内从玻璃移液管中加入 1 - 2 滴激活缓冲液，以置换浸油。避免加入过量激活缓冲液或使移液管接触卵子，以免导致成熟卵子移位。注意不要触碰盖玻片，否则可能引起焦平面偏移，或在物镜与盖玻片之间的浸油中产生气泡。
  6. 在图像采集过程中加入激活缓冲液时，应检查明场通道，确认浸油已被激活缓冲液完全置换。
    注意：最初会因移液管阻断光路而出现阴影，随后可见小油滴出现。部分油滴可能仍附着于成熟卵子周围，这将影响实验结果和图像质量。
  7. 若初次加入激活缓冲液未能完全置换浸油，请重复步骤 5.4 - 5.6。
  8. 一旦浸油被成功置换，继续运行时间序列直至采集完成。
    注意：由于卵母细胞在激活时会发生膨胀，部分卵室可能在加入激活缓冲液后显著偏离焦平面或视野范围。若发生此情况，应停止采集，更换下一个盖玻片进行成像。
  9. 图像序列采集完成后，保存数据。

6. 采集后图像处理

  1. 使用 Fiji（http://fiji.sc/Downloads#Fiji）或等效的图像处理软件打开数据集，并选择用于分析的相关文件。
  2. 要对采集的数据生成投影，请选择：图像 > 堆栈 > Z 投影。
  3. 选择起始 Z 层和终止 Z 层，通常为整个切片范围。选择投影类型，通常设置为“最大强度”。勾选“所有时间帧”复选框，以将所选设置应用于整个序列。
  4. 如果成像包含多个荧光通道，请使用通道工具在不同颜色间切换、生成复合图像或转换为灰度图像。选择 图像 > 颜色 > 通道工具。
  5. 要调整图像的亮度和对比度，请选择 图像 > 调整 > 亮度/对比度。
  6. 要导出单张图像，请将时间轴滑块移至目标帧，然后选择 文件 > 另存为 > JPEG 或其他所需格式。
  7. 为导出的文件选择保存位置和文件名，然后保存。
    注意：需要成像软件中的帧率信息，以便在图像上添加时间戳。
  8. 要将时间序列导出为视频，请选择：文件 > 另存为 > AVI，然后选择帧率（约每秒 7 帧）。
  9. 为导出的文件选择保存位置和文件名，然后保存。
  10. 要以 Fiji 格式保存已调整的文件，请选择 文件 > 保存。

结果

在此，我们展示了如何制备成熟的 果蝇 卵 用于离体实验 激活。表达GECI的卵子可用于成像Ca2+ 卵子激活及胚胎发育起始阶段的动力学图1）。需要注意的是，根据所使用的GCaMP类型，特别是是否存在肉豆蔻酰基团，结果可能会有轻微的定性差异。13 14我们还通过向激活缓冲液中添加肌动蛋白聚合抑制剂细胞松弛素D，证明了功能性肌动蛋白在卵子激活过程中的作用。图2) 14.
 
细胞骨架在卵子激活过程中的必要性是保守的。在 秀丽隐杆线虫， 受精后，细胞骨架组分发生重组，以使单细胞胚胎为第一次不对称分裂做好准备 21,22在海胆中，激活后细胞骨架重排受阻已被证明会因抑制收缩环的形成而影响细胞周期 23肌动蛋白在介导钙离子2+ 卵子激活过程中波及其下游功能 果蝇 仍有待完全阐明。
 
在 果蝇，钙信号的共可视化2+ 利用此方法可实现对波和肌动蛋白细胞骨架的观察与分析 离体 活化检测。可获取多通道的时间序列，并分析细胞内 Ca2+ 可与卵母细胞中肌动蛋白组织结构的变化相对应（图3).

延时荧光显微镜，发育胚胎中的细胞活动，间隔成像序列
图1：单个Ca2+ 挥手 果蝇 卵子激活 时间序列的 离体 成熟 果蝇 表达UASt-的卵myrGCaMP5 加入活化缓冲液后 （A-H）. 胞质 Ca²⁺ 浓度的升高2+ 起源于后极 （B） 并传播 （B-F） 平均速度约为 1.5 µm/sec波的起始通常在加入激活缓冲液后3分钟内被观察到。激活后，成熟卵细胞内的钙离子水平恢复至激活前水平。 （G，H）。参见补充视频1（总时长33分钟）。比例尺 = 50 µm最大投影 = 40 µm. 请点击此处以查看此图的放大版本。

活体中蛋白质定位的延时成像；荧光显微镜图像；细胞运动分析
图2：在激活缓冲液中添加细胞松弛素D会干扰Ca2+ 波传播 时间序列的 离体 成熟 果蝇 表达UASt的卵myrGCaMP5 加入含有激活缓冲液后 10 µg/ml 细胞松弛素D终浓度 （A-H）. 尽管 Ca2+ 波从前极启动 （A），其功能受损，无法到达卵的前部 (F) （白色箭头指示波前位置）。无进一步的 Ca2+ 30分钟内未观察到变化）。参见补充视频2（总时长30分钟）。比例尺 = 50 µm最大投影 = 40 µm. 请点击此处以查看此图的放大版本。

延时显微镜，荧光信号，细胞发育，A-H阶段，蛋白质定位
图3：肌动蛋白与钙离子的共可视化2+ 卵子激活过程中 果蝇 时间序列的 离体 成熟 果蝇 表达UASt-的卵myrGCaMP5 （青色）和 UASp-F-肌动蛋白.tdTomato （品红）加入活化缓冲液后 （A-H）. 钙2+ 波从后极开始并恢复，如同 图1肌动蛋白随时间发生变化，白色箭头所示 (A 与 H) 。缺乏Ca2+ 成熟卵细胞中心的信号检测是由于成像过程中样品移动所致。比例尺 = 50 µm最大投影 = 40 µm. 请点击此处以查看此图的放大版本。

讨论

本方案中的第一个关键步骤是在不损伤卵细胞的情况下分离成熟卵子。这可以通过解剖探针轻柔地操作卵子来实现。经过练习，即可熟练完成该操作而不会对卵子造成损伤。第二个关键步骤是在油中向成熟卵子加入激活缓冲液时避免样品丢失。加入激活缓冲液时应缓慢进行，并避免与盖玻片接触。如果显微镜的配置不利于对样品进行便捷操作，该步骤可能会具有挑战性。此时建议移动显微镜的附属部件，例如温度培养箱，以获得更好的操作空间。

为了观察其他荧光标记因子（而非卵子激活过程中的 Ca2+），可对本实验方案进行相应修改。更广泛而言，也可利用该方案分析果蝇（Drosophila）发育的不同阶段，或添加不同缓冲液后的实验结果。

如果显微镜的设置未针对样本信号的观察进行优化，则可能需要进行故障排除。可通过增加或减少激光功率、调整采集范围以及调节Z轴层扫参数来实现优化。另一个问题可能是加入激活缓冲液后，卵子持续移出视野。如果这种情况频繁发生，可让成熟卵子在盖玻片上沉降更长时间，约15至20分钟。需注意，使用黏度更高的油会改变激活缓冲液对油的置换效果。

该技术受限于物镜的工作距离、成熟卵子的脱水以及在不损伤的情况下解剖成熟卵子的能力。然而，与之相比 体内 成像方法，其中成熟卵细胞通过成年雌性并被排出 13我们的方法能够提供更高的空间分辨率，可在激活前对成熟卵细胞进行物理操作，并能够在不经过受精的情况下检测卵细胞激活的作用。

该技术具有多种潜在的未来应用，包括在卵细胞激活时检测细胞组分的报告基因构建体，以及在突变背景下可视化Ca2+波14,24。结合实验与遗传工具，本文所展示的体外（ex vivo）卵细胞激活检测方法可用于研究普遍保守的Ca2+波的触发机制、传播过程及其下游效应。

披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

我们感谢 Laura Bampton、Alex Davidson、Richard Parton 和 Arita Acharya 在本手稿准备过程中提供的帮助；感谢 Mariana Wolfner 就卵子激活问题进行的讨论；感谢 Matt Wayland 提供的成像技术支持；以及感谢 Nan Hu 在实验室中的各项常规支持。

本工作由剑桥大学向 T.T.W. 提供的 ISSF 基金资助 [资助编号 097814]。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
干性活性酵母Fleischman’s#2192
解剖显微镜LeicaMZ6其他型号亦可使用
光源灯Mircotec Fibre opticMF0-90其他型号亦可使用
医用擦拭巾Kimberly-Clark CorporationKLEW3020 
标记笔Stabilo841/46OHPen 通用型，黑色——大多数文具店有售；超细笔尖，宽度 0.4 mm
CO2 培养垫 Genesee Scientific59-114 (789060 Dutscher)
盖玻片 No. 1.5，22 × 50 mmInternational- No1-VWR 目录号=631-0137-22-50mmMenzel-Glaser-22-50mm-MNJ 400-070T 
卤代烃油，95 系列Halocarbon Products Corp.欧洲经销商：
Solvadis (GMBH)
Oil 10 SVWR Chemicals24627.188可替代 95 系列卤代烃油使用
镊子Fine Science Tools11252-00工具应保持清洁，但无需高压灭菌，使用乙醇处理即可。
探针Fine Science Tools10140-01
玻璃移液管Fisherbrand,FB50251巴斯德移液管，玻璃材质，未封口，长度 150 mm 
小瓶Regina IndustriesP1014GPPS  80 mm × 25 mm

参考文献

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