快速分子检测与区分甲型和乙型流感病毒

摘要

我们介绍一种快速的基于分子检测的甲型与乙型流感病毒检测方法。该流感检测方法采用针对流感病毒特异性引物的等温扩增技术，结合分子信标探针进行靶标检测，可在15分钟内分别检测出甲型和乙型流感病毒。该甲型与乙型流感病毒检测方法操作简便，实验人员所需操作时间极少。

摘要

流感是由甲型和乙型流感病毒引起的一种传染性呼吸道疾病，在人类中每年都会导致大量的发病和死亡。甲型和乙型流感检测试剂盒是首个获得临床实验室改进修正案（CLIA）豁免的分子快速流感检测方法。该甲型和乙型流感检测通过使用针对流感病毒特异性的引物进行等温扩增，随后利用分子信标探针检测目标序列来实现。本文中，将甲型和乙型流感检测试剂盒对保存于病毒运输培养基（VTM）中的冷冻存档鼻咽拭子（NPS）标本的检测性能，与一种呼吸道病原体联合检测试剂盒进行了比较。

通过与呼吸道病原体检测组合的参考方法进行比较，评估了甲型和乙型流感病毒检测的性能。甲型流感病毒总体检测的灵敏度为67.5%（95%置信区间（CI），56.6–78.5），特异性为86.9%（CI，71.0–100）。对于乙型流感病毒检测，其灵敏度和特异性分别为90.2%（CI，68.5–100）和98.8%（CI，68.5–100）。

该系统相较于目前其他可用的分子检测方法，具有显著缩短检测时间的优势，且操作简单，无需移液，可在完全集成、封闭式、占地空间小的系统上运行。总体而言，本研究评估的甲型与乙型流感检测方法有望作为即时检测的快速流感诊断手段。

引言

每年流感病毒感染都会导致大量的发病和死亡^1,2,3。单纯性流感的特征是出现全身性和呼吸道症状，例如发热、肌痛、头痛和干咳^4,5。老年人、幼儿、免疫功能低下者以及患有基础合并症的患者发生肺炎、心肌炎、中枢神经系统疾病或死亡等严重并发症的风险更高^6,7。

流感感染与其他呼吸道病毒不同，症状出现后48小时内及时给予抗病毒治疗可减轻疾病严重程度并缩短病程⁸。快速识别流感还被证实可减少不必要的抗生素使用^9,10。此外，感染流感的住院患者必须安置在隔离病房，并采取适当的感染控制措施。然而，由非流感病毒引起的呼吸道疾病在临床上难以与流感区分。因此，快速且准确的流感诊断检测对于临床患者管理至关重要。

目前有多种检测和鉴定流感病毒的实验方法。快速流感抗原检测（....

方案

伦理声明：剩余临床样本的使用已获批准，并遵循纪念斯隆-凯特琳癌症中心机构审查委员会的指南。

1. 运行检测前的准备

注意：甲型和乙型流感检测适用于鼻咽拭子样本以及保存在病毒运输培养基中的鼻咽拭子。试剂盒中包含拭子，应使用这些拭子以获得最佳性能。然而，也可使用棉质、泡沫、植绒或聚酯鼻拭子来采集鼻拭子样本。

1. 采集鼻拭子样本时，将拭子插入分泌物最明显或堵塞最严重的鼻孔。轻轻旋转并推进拭子，直至遇到阻力，然后在鼻腔壁上多次旋转，再缓慢从鼻孔中取出。将拭子收集后置于含有 3 ml 病毒运输介质（VTM）的试管中进行储存和运输。
   注意：必须谨慎规范地进行样本采集，因为不充分的样本采集可能导致错误结果。
   注意：采集后的拭子样本应尽快进行检测。若无法立即检测，可在室温下保存最多 2 小时，或在 2–8 °C 冷藏最多 24 小时。新鲜采集的样本最有利于实现最佳检测性能。不恰当的样本处理、储存和/或运输可能导致错误结果。
   注意：作为预防措施，执行本检测的人员在处理样本时应遵循普遍性防护原则，将所有样本视为可能具有传染性。
2. 检测前将所有样本恢复至室温。
   注意：所有检测试剂组件仅限一次性使用，不得用于多次检测。不得混用不同批号的试剂盒组件。不得使用超过有效期的试剂盒试剂。
3. 检测前将蓝色样本接收器恢复至室温。橙色测试底座无需预热至室温即可使用。
4. 所有测试组件应在使用前一刻才从铝箔包装中取出....

结果

本研究中，于2012年12月15日至2013年3月1日流感暴发期间，在纪念斯隆-凯特琳癌症中心（MSKCC）因流感样症状住院的患者中收集了存档的鼻咽拭子（NPS）标本。NPS标本采集于3 ml病毒运输液（VTM）中，并作为常规临床检测的一部分，使用可检测多种呼吸道病毒（RP）的分子检测方法进行检测，包括甲型流感病毒、A-1、A-3和乙型流感病毒。在研究期间，共有3,675份NPS标本被送至MSKCC临床实验室进行检测。其中，分别有45份、425份、37份和77份标本经RP检测呈甲型流感病毒A-1、A-3、未分型甲型流感病毒（A-u）和乙型流感病毒阳性。共选取360份阳性标本，其中每种甲型流感病毒亚型各40份，A-u型37份。此外，针对每份阳性标本，选择在实验室接收时间上紧邻的1至2份阴性标本，用于后续甲型和乙型流感病毒检测。

总体而言，甲型和乙型流感病毒检测共检出79例甲型流感病毒、37例乙型流感病毒、240例阴性结果和4例无效结果（内部质控失败）（<.......

讨论

流感病毒是全球范围内导致发病和死亡的重要原因。在呼吸道疾病流行季节，快速且准确地诊断流感是控制流感暴发的关键之一。其他基于抗原的检测方法虽然快速且易于操作，但其灵敏度较低¹³。相比之下，传统的分子检测方法虽然灵敏度更高，但需要经验更丰富的实验室技术人员操作，且成本较高。本研究和实验方案中描述的甲型与乙型流感病毒检测方法是一种经CLIA豁免的快速分子检测技术，用于甲型和乙型流感病毒的检测。该技术基于等温扩增方法，可实现对甲型和乙型流感病毒的检测与区分。我们展示了代表性结果，以证明该甲型与乙型流感病毒检测方法在一组存档的冷冻鼻咽拭子病毒转运培养基（NPS VTM）样本中的性能，并将其与另一种基于分子检测的呼吸道病原体联合检测试剂盒进行了比较评估。

在RP检测中被判定为"不确定"或"无法分型"的样本，在甲型和乙型流感病毒检测中的敏感性最低。此外，RP检测中C_T值较高的标本更常出现不一致的结果，提示该检测方法较低的检出率与较低的病毒滴度相关。该检测方法对乙型流感病毒的检测性能优于甲型流感病.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
Alere i 仪器	Alere	NAT-000（全球），NAT-024（美国）
Alere i 流感A & B 24 测试试剂盒	Alere	425-000（全球），425-024（美国）
Alere i 条形码扫描仪	Alere	EQ001001
Alere Universal Printer	Alere	55115（全球），alereiprinter (美国)
200 µ精密移液器
200 µ一次性移液器吸头
病毒运输培养基	Remel	M4-RT