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水培法:研究养分分配及植物对养分可利用性和有毒元素暴露响应的多功能系统

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DOI:

10.3791/54317

2016年7月13日

本文内容

摘要

本文介绍了一种易于操作的水培系统建立方案,适用于植物营养研究。该方案已在拟南芥(Arabidopsis)中经过广泛验证,可轻松适用于其他植物物种,用于研究特定营养需求或非必需元素对植物生长发育的影响。

摘要

水培系统已被用作植物生物学研究的标准方法之一,同时也用于多种作物的商业化生产,包括生菜和番茄。在植物研究领域,研究人员已设计出多种水培系统,用于研究植物对生物和非生物胁迫的响应。本文介绍一种水培实验方案,可供致力于植物矿质营养研究的实验室便捷地实施。

本方案详细描述了水培系统的建立以及植物材料的制备,以确保实验成功。本方案中所述的大部分材料均可在科学供应公司以外获得,从而使水培实验的搭建更加经济且便捷。

在需要对营养培养基进行精确控制,以及需要收获完整根系用于后续实验操作的情况下,使用水培生长系统具有显著优势。我们还展示了如何通过调整营养物质浓度,以诱导植物对必需营养元素和有毒非必需元素产生响应。

引言

植物是少数能够利用太阳光捕获的能量,从无机离子、水和CO2合成所有必需代谢物的生物之一1。水培法是一种植物栽培方法,其利用这一特性,将所有养分以无机形式溶解于液体中,可添加或不添加固体基质。科学家已广泛使用水培系统来研究拟南芥(Arabidopsis)及其他植物物种的营养需求以及某些元素的毒性2-5。例如,Berezin 3、Conn 4 和 Alatorre-Cobos 2 利用水培系统及包括番茄和烟草在内的多种植物,获得了足够的植物生物量用于矿质分析2-4。水培技术在番茄和生菜等作物上的工业应用也已得到发展6。本文概述了水培法在科研中的应用、现有方法的可能变体,并最终介绍一种易于扩展、适用于致力于植物矿质营养研究的实验室的水培系统。

水培系统可轻松分离根组织,并精确控制养分供应

水培系统相较于土壤栽培系统具有多项优势。在脱离土壤的过程中,根系组织常因机械性剪切而造成组织损失或损伤,这一问题对于侧根和根毛等细小根系结构尤为明显。不使用惰性颗粒介质的水培系统 允许 一种侵入性更小的根和茎组织分离方法。

在土壤体系中,养分的生物可利用性会随着土壤基质的变化而改变,因为养分会与土壤颗粒结合,从而在土壤内形成微环境。这种异质性可能为需要精确控制养分或其他分子外部浓度的实验增加额外的复杂性。相比之下,水培溶液具有均一性,并可在实验过程中轻松更换。

水培系统的不同类型

所有水培培养都依赖营养液向植物提供必需元素。除了营养物质外,根部还需要持续供应氧气。当根部处于缺氧状态时,将无法吸收和运输代谢物至植物其他部位7。水培系统可根据其向根部输送氧气和其他营养物质的方式进行分类:通过将溶液用空气饱和来供氧(经典水培法)、不完全持续浸没根部,或让根部完全暴露于空气中(气雾栽培法)8。在水培中,可在使用前将营养液预先用空气饱和并频繁更换,或在整个植物生命周期中持续向溶液中供气9。此外,植物也可种植于惰性介质(例如,岩棉、蛭石或黏土颗粒)上,并通过将营养液滴灌至介质中,或周期性地将基质浸入营养液,从而实现干湿循环10。在气雾栽培中,通过向根部喷洒营养液以防止其脱水。

水培系统的缺点

尽管水培培养系统相较于土壤栽培系统具有明显优势,但在解读相关数据时仍需注意一些问题。例如,水培系统使植物所处的环境条件可能被视为非生理状态。因此,利用水培系统检测到的表型或植物响应,在植物生长于其他栽培系统时,其表现程度可能存在差异。例如, 土壤或基于琼脂的培养基)。这些考虑因素并非水培系统所独有;若植物生长在不同类型的土壤中,也可观察到差异性反应。 11,12.

以下方案提供了在实验室中建立水培系统的逐步操作说明。本方案已针对拟南芥(Arabidopsis thaliana,简称 Arabidopsis)进行优化;然而,其他物种也可采用相似或在某些情况下完全相同的操作步骤进行培养。

方案

1. 幼苗培育

  1. 气相灭菌法 拟南芥 种子
    1. 将种子(40–50 mg)倒入1.5 ml离心管中。(参见 图1 合适的种子用量约为 50 µl). 用铅笔标记每根试管(墨水在灭菌过程中可能会褪色)。将每根已标记的试管打开管盖后放入干燥器中13.
    2. 将干燥器置于正在使用的通风橱中,并关闭干燥器的阀门。
    3. 将100 ml漂白剂(NaClO 6.15%)分装至250 ml烧杯中,然后放入干燥器内。
    4. 使用移液管迅速向漂白剂中加入 3 ml 12 M 盐酸。反应迅速进行,需立即盖紧干燥器盖子。让灭菌过程持续 4 小时(可用墨水标记一支试管,观察墨水褪色,以判断已生成足量氯气)。
      警告:氯气有毒;处理其残留物时,须在通风良好的通风橱内采取额外的安全预防措施。请联系当地主管部门,或访问密苏里大学环境健康与安全部门(ESH-MU)的网页。14 有关化学品安全及通风橱使用指南:https://ehs.missouri.edu/chem/
    5. 灭菌完成前15分钟(即3.75小时时),打开超净工作台,并用70%乙醇擦拭台面。
    6. 消毒4小时后,打开阀门,在通风橱内短暂打开干燥器盖子,取出次氯酸钠溶液,并根据机构规定程序进行处理。此步骤将释放大量氯气。重新密封消毒室,将其移至超净工作台。打开盖子,充分通风约40分钟,使消毒后的种子散气。此后应立即使用种子,或将其储存在干燥处。
      注意:建议对种子进行气相灭菌,但也可采用其他方法,例如按照 Alatorre-Cobos 所述,依次用乙醇、次氯酸钠和水进行交替清洗。 2 效率相同。
  2. 用于种子萌发的培养基
    注意:本步骤中制备的培养基是 ¼ 含维生素的MS培养基15.
    1. 向1 L玻璃烧杯中加入450 ml去离子水(DI水)、0.55 g含维生素的MS培养基、0.3 g MES(4-吗啉乙磺酸水合物)以及一个磁力搅拌子。
    2. 使用 NaOH 溶解并调节 pH 至 5.7,然后加入 3.5 g 植物琼脂。继续搅拌溶液 5 分钟。
    3. 将整个溶液倒入量筒中,并加入去离子水至500 ml。使用1 L可高压灭菌瓶,将此500 ml溶液连同磁力搅拌子一起高压灭菌。
    4. 溶液高压灭菌后,使用瓶中的磁力搅拌器搅拌7-10分钟。
    5. 待培养基冷却至50–60℃后 °C,在无菌条件下将培养基倒入培养皿中,静置使其凝固。培养皿可存放于冷室中以备后续使用。
  3. 种子点播
    1. 在使用前15分钟打开超净工作台,并用70%乙醇清洁台面。所需物品包括:无菌种子、滤纸、牙签、微孔胶带以及 ¼ MS 平板
    2. 将无菌种子置于无菌滤纸上。用无菌水略微润湿一根无菌牙签的一端,或通过轻刺琼脂表面使其略微湿润 ¼ MS 培养基)。用此湿润的一端从滤纸上挑取种子,然后将其放置在培养基表面。
    3. 将种子均匀铺在培养皿上,密度约为每平方厘米1粒种子2 (图2然后使用微孔胶带将培养皿盖固定在培养皿本体上。这种胶带有助于防止污染,同时允许空气与培养皿内部微环境之间的气体交换。
    4. 在种子萌发前,将培养皿置于避光的冷室中低温层积处理两天。
    5. 层积处理后,将种子置于生长室或具有最佳生长条件(23 °C,16小时光照/8小时黑暗,相对湿度60% 拟南芥幼苗在萌发后10至12天即可用于水培。
      注意:在萌发期间,培养皿盖下可能会产生大量冷凝水,为防止幼苗溺亡,应在超净工作台的无菌条件下弃去多余水分。

2. 水培系统设置与移栽过程

  1. 水培溶液
    注意:如引言中所述,植物可能具有特定的营养需求。Arabidopsis 已成功使用 表116 所示的营养液进行培养。根据供应商的不同,此处列出的盐类可能含有不同的结晶水(水合状态),只要保持摩尔浓度恒定,使用此类替代品不会影响营养液的性质。
    1. 分别配制每种大量元素的储备液于不同的瓶中(见表1),除 Fe-EDTA 外的所有微量元素储备液则置于一个无菌瓶中(使用 0.22 µm 滤膜过滤灭菌)。混合溶液时,Fe-EDTA 始终在最后添加。实验前预先配制 10 倍浓度的营养液,并经高压灭菌后于 4 °C 保存。仅当营养液恢复至室温后方可使用或更换。
  2. 移栽
    1. 准备植株固定装置和水培容器
      1. 使用剃刀刀片沿泡沫条长度方向切开一道切口(见图3)。每株植物准备一个泡沫插塞。
      2. 将浸泡在去离子水中的泡沫管插塞进行液体高压灭菌。
      3. 将泡沫板切割成较小的板片,确保泡沫板的宽度和长度比容器尺寸小 0.5–1.0 cm(见图4)。
      4. 使用打孔器在泡沫板上打孔。植株密度应均匀分布,理想情况下每 10 cm2 放置一株植物。该密度可使植株之间保持良好分离;然而更高密度也是可行的,并不会妨碍实验的成功。确保孔的尺寸与插塞大小相匹配(见图4)。
      5. 向容器中加入营养液,确保液面深度足以支持根系发育(至少 5 cm)。然后小心地将泡沫板放置于液面之上。
      6. 设置空气泵系统以向溶液中供氧(见图5)。
        注意:应在将幼苗移栽当天向水培容器中加入营养液。用遮光材料覆盖容器侧面有助于防止藻类生长。
    2. 将幼苗从培养板转移至水培系统
      1. 使用小型镊子轻轻将每株幼苗从培养基平板中取出,并将根部沿泡沫管插塞的切口方向摆放。小心地将夹持幼苗的泡沫管插塞插入泡沫板的孔中,然后将泡沫板放回水培容器中。正确的操作方式参见图6

3. 水培实验

  1. 营养液更换与调控
    1. 营养液更换
      1. 更换营养液时,按照步骤2.1所述配制新鲜的水培溶液。将带有植株的泡沫板从水培容器中取出,暂时放置于盛有水或水培溶液的临时容器中。
      2. 弃去旧的营养液,用去离子水将容器快速冲洗三次。向容器中加入新配制的水培溶液,然后轻柔地将带有植株的泡沫板放回水培容器中。每周更换两次水培溶液。
    2. 改变水培溶液的营养成分
      1. 调整表1所示水培溶液的成分,以改变目标元素的最终浓度。例如,为诱导铁(Fe)缺乏,可调整水培溶液以降低Fe-EDTA的浓度。同时设置对照组植株,使用未作任何修改的完全(或充足)营养液进行培养,以便比较。
      2. 若需向营养液中添加有毒元素,应首先配制所需有毒元素的独立储备液,建议浓度为1,000倍浓缩液。使用移液器将该1,000倍浓缩储备液加入水培溶液中,以达到目标终浓度。
      3. 例如,为配制3 L含20 µM镉的水培溶液,可先配制0.5 M的CdCl2储备液,然后向3 L水培溶液中加入120 µl该0.5 M CdCl2储备液。同时设置对照组植株,使用不含CdCl2的水培溶液培养,用于比较。
        警告:镉、砷和铅等有毒元素对人类健康和环境具有极高危险性。在开展实验前,请联系当地主管部门或访问EHS-MU网站(https://ehs.missouri.edu/train/chemical.html)14 获取环境与健康安全指南。
  2. 仪器灭菌以备后续实验
    1. 由于用于搭建水培系统的几乎所有材料均可重复使用,因此可用稀释的次氯酸钠溶液(NaClO 0.6%)清洗各个部件。
    2. 用次氯酸钠溶液清洗后,需用去离子水彻底冲洗所有材料。将容器、泡沫板和水族箱气石置于干燥处保存,以供后续使用。泡沫塞在去除根系并经高压灭菌后即可再次使用。

结果

本部分展示了利用此处所述水培系统进行的两类实验结果。在第一项实验中,通过调整营养液以获得不同浓度的锌。我们还通过向营养液中添加非致死浓度的有毒元素镉来改变营养液(图7)。在第二项实验中,采用电感耦合等离子体发射光谱法(ICP-OES)1测定在含镉水培液中生长的植物根部和叶片的元素组成(图8)。该实验说明了分别获取根部和叶片样品的优势。

实验 1

将拟南芥(Arabidopsis)幼苗(Col-0)种植于步骤1和2所述的水培系统中。植株生长3周后,分别用不同浓度的锌处理(图7A-B),或用非致死浓度的镉处理(图7C)。处理6天后,生长在高锌浓度(> 42 µM)下的植株因锌毒性而表现出生长迟缓,而未额外添加锌的植株相比添加7 µM Zn2+的植株也表现出生长迟缓。图7还显示了暴露于镉的植株地上部分生长和根系生长的减少,以及典型的叶片黄化症状(图7C)。

实验 2

Col-0 植物的培养方法如步骤 1 和 2 所述。两周后,将未修饰的(完全)培养液替换为含有 20 µM Cd 的 80 ml 水培溶液。72 小时后,通过将带有植物的整个泡沫板转移至含有 80 ml Tris 20 mM(pH 8.0)和 5 mM EDTA 的新容器中,清洗根部组织。该溶液可去除结合在根表面的重金属。植物在含 EDTA 的溶液中于旋转摇床上孵育 5 分钟。随后将 EDTA 溶液替换为 80 ml 去离子水,并在旋转摇床上继续孵育 5 分钟。此去离子水清洗步骤重复两次。用去离子水清洗植物后,分别采集叶片和根部组织,并用于 ICP-OES1 分析。图 8 显示,叶片与根部的元素组成存在差异,其中叶片组织中大量营养元素(Ca、K 和 Mg)的浓度高于根部。另一方面,Zn 和 Fe 等微量元素则优先在根部富集。非必需元素镉的浓度在根部高于地上部分。

微量离心管实验装置、PCR过程、反应孵育示意图
图 1. 拟南芥种子的气相灭菌。A)每支1.5 ml离心管中所装的拟南芥种子量。(B)装有种子的离心管,管盖打开并置于试管架中,准备进行灭菌,其中一支管盖上带有墨水标记。(C)置于干燥器内的灭菌装置,盖子与阀门均已关闭。(D)参与种子灭菌过程的一支离心管管盖上的墨水标记,灭菌前后墨迹颜色均保持深浓。请点击此处查看此图的放大版本。

纸色谱装置中的静态平衡,展示逐步实验过程,托盘中含有溶剂。
图2. 种子接种步骤。 (A) 将种子放置在灭菌后的滤纸上,准备接种;此步骤还需使用灭菌牙签。(B) 用培养基或培养皿边缘的水将牙签末端轻微润湿。(C) 将种子转移至¼ MS培养基平板上。(D) 种子的理想密度约为≈1粒种子/cm2请点击此处查看该图的放大版本。

解剖装置、剃刀切割泡沫、精密技术演示。
图3. 用于将幼苗固定在营养液中的泡沫塞。泡沫管塞一半位置上的切口有助于在将幼苗从培养板移植到水培系统时固定幼苗。请点击此处查看该图的放大版本。

使用泡沫切割实验的静态平衡过程;示意图展示逐步操作流程。
图4. 泡沫板的制备。A)在批量制备泡沫板前,需先核对模板泡沫板的尺寸与容器尺寸是否匹配。在泡沫板中心位置制作两个微小穿孔,便于使用镊子夹持和操作泡沫板。(B-C)使用打孔器在泡沫板上打孔。(D)检查泡沫管塞与泡沫板上所打孔洞之间的适配性。请点击此处查看该图的放大版本。

电泳装置设置带管路;凝胶分离过程;显示设备布局的示意图。
图 5. 水培实验的气泵设置(俯视图 A 和侧视图 B)。 图中数字表示:1 — 供气泵;2 — 连接气泵与阀门系统的塑料管路,用于控制气流;3 — 阀门系统;4 和 5 — 连接阀门系统与曝气石的塑料管路;6 和 7 — 曝气石(市售用于鱼缸)。 请点击此处查看此图的放大版本。

利用外植体和培养基进行植物微繁殖的过程;实验装置序列。
图 6. 将幼苗转移至水培系统。A)使用镊子将一株幼苗从培养基平板中取出。(B)将幼苗根部沿泡沫管塞上的切口放置。(C)将泡沫管塞插入泡沫板中。(D)已完成的泡沫板装置,幼苗已准备就绪,可置于营养液上。请点击此处查看该图的高清版本。

镉胁迫下的植物生长阶段、延时系列、生长比较、研究实验。
图7. 可通过调整营养液来测试元素的缺乏或毒性效应。 水培种植4周龄的Arabidopsis在处理6天后的生长情况:(A-B)在含0、7、14、21、28、35、42和50 µM Zn的条件下培养的植株。在高浓度Zn(> 42 µM)下生长的植株表现出生长迟缓(毒性效应),而未添加Zn的植株也表现出生长迟缓(营养缺乏),与添加7 µM Zn2+的植株相比。(C) 在营养液中不含(左侧)或含有20 µM Cd的条件下培养的植株(Cd暴露6天后拍摄的照片)。镉暴露导致植株出现失绿症并抑制生长。请点击此处查看该图的放大版本。

根与莲座叶中矿物质含量比较图;Ca、K、Mg、Fe、Mn、Zn、Cd,柱状图。
图8. 水培植物根部与地上部的元素组成。与根部相比,地上部含有更多的大量营养元素(Ca、K、Mg),而必需的微量元素锌和铁在根部更为富集。同样,非必需元素镉也优先在根部积累。误差线表示95%置信区间(n = 14,地上部;n = 9,根部)。请点击此处查看该图的放大版本。

营养素类型盐/试剂水培溶液中的浓度单位
大量营养素KNO31.250mM
大量营养素KH2PO40.625mM
大量营养素MgSO40.500mM
大量营养素Ca(NO3)20.500mM
微量营养素H3BO317.500µM
微量营养素MnCl25.500µM
微量营养素ZnSO40.500µM
微量营养素Na2MoO40.062µM
微量营养素NaCl22.500µM
微量营养素CoCl20.004µM
微量营养素FeEDTA12.500µM

表1. 水培溶液中营养物质的有效浓度。

讨论

用于水培的幼苗健康状况是影响水培实验成功的主要因素之一。对仪器、种子和培养基进行灭菌处理在降低污染风险方面也起着重要作用,可为植物在移栽至水培系统前提供良好的生长起点。一个配备有高压灭菌器、通风橱、冷藏室(4 °C)以及具有可控环境条件(光照强度和温度)的生长空间的工作环境,是建立良好实验体系所必需的。

营养液的新鲜程度也决定了植物的健康状况,进而影响水培实验的成功与否。由于在直接光照下水分蒸发较快,溶液总体积减少会导致盐分浓度发生变化;因此,最好每周至少更换两次水培营养液。然而,如果使用配备有气泵系统的较大且较深的容器,则对于持续时间较短的实验,可能无需更换营养液。需要注意的是,在拟南芥(Arabidopsis)实验中,我们使用了Magenta培养皿(77 mm 宽 × 77 mm 长 × 97 mm 高),但也可使用其他更大容器来培育体型较大的植物。

对于研究植物营养的研究人员而言,水培实验提供了一个独特的环境,可用于检测植物表型及其对不同养分供应的响应17。通过调控目标元素的浓度,研究人员可设计多种实验,以检验必需和非必需营养元素在充足、缺乏或毒性浓度下的影响。与土壤栽培系统相比,水培系统为植物提供了更均一的营养环境,且土传病害风险更低。此外,可方便地分别采集根系和地上组织,用于对特定植物组织进行后续分析。

在代表性实验部分,我们介绍了两个利用简单水培系统对植物营养进行更深入研究的实例。在第一个实例中,通过在锌浓度梯度条件下培养植物,我们展示了利用该水培系统对营养成分实现精确调控的能力。在7 µM Zn条件下生长的植物比在50 µM Zn条件下生长的植物生长更为旺盛,而未额外添加锌的培养条件下,植物的生长则明显受到抑制,与7 µM Zn条件下的植物相比表现出明显的矮小现象。部分原因在于植物在充足条件下生长的时间长短不同;更早地从培养基中去除锌可能会引发更显著的缺锌症状。基于相同的原理,我们还利用非必需金属镉诱导了植物的毒性反应,已知镉会抑制植物生长。

在第二个示例中,采用20 µM Cd处理72小时后,通过电感耦合等离子体发射光谱法(ICP-OES)测定了Col-0植株根和地上部分的元素组成。我们发现根与地上部分中所有被检测金属的含量均存在差异。大量元素在地上部分的浓度高于根部,而铁和锌在根部更为富集。镉的分布模式与铁和锌相似,在根部的浓度高于地上部分。这些数据进一步支持了叶片和根部可提供关于植物离子组状态不同信息的观点,因此需分别分析这两种组织,以全面理解整株植物的矿质营养状况和元素组成。除ICP-OES外,还可采用多种光谱技术测定植物组织的元素组成(离子组),例如原子吸收光谱法(AAS)或电感耦合等离子体质谱法(ICP-MS)18-20

在水培实验中,植物对不同营养条件产生的症状和表型是进一步开展更深入分析(如基因表达分析(转录组学)和蛋白质丰度分析(蛋白质组学))的基础。这些 -组学 技术是通过以组织特异性方式考虑过程来整合植物代谢的关键。

披露

作者声明不存在相互竞争的经济利益。

致谢

本研究由密苏里大学研究委员会(项目编号 CB000519)和美国国家科学基金会(IIA-1430428,授予 DMC)资助。Nga T. Nguyen 得到了越南教育基金会培训项目(交流访问者计划编号 G-3-10180)的支持。我们还感谢 Roger Meissen(密苏里大学邦德生命科学中心)在视频录制和编辑过程中提供的协助与专业支持。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
用于种子灭菌
次氯酸钠溶液The Clorox CompanyNA常规漂白剂
www.cloroxprofessional.com
盐酸Fisher ScientificA144-500
干燥器本体NalgeneD2797 SIGMA由 Sigma-Aldrich 销售
干燥器板Nalgene5312-0230由 Thermo Scientific 销售
用于四分之一浓度 MS 培养基的制备
MESAcros Organics1725910004-吗啉乙磺酸水合物
Murashige 和 Skoog (MS)Sigma-AldrichM0404-10L
KOHFisher ScientificP250-500
植物凝胶Duchefa BiochemieP1003.1000
方形培养皿Fisher Scientific0875711A带网格的一次性培养皿
种子接种 
滤纸沃特曼1004090
牙签Jarden Home BrandsNA
铝箔Reynolds WrapNA标准铝箔
微孔胶带3M 医疗保健19-898-074外科手术胶带;由 Fisher Scientific 销售
用于水培溶液的制备
KNO3Fisher Scientific BP368-500
KH2PO4Fisher ScientificP386-500
MgSO₄4Fisher ScientificM63-500
Ca(NO3)2Acros OrganicsA0314209
H3BO3SigmaB9645-500G
MnCl2Sigma-AldrichM7634-100G
ZnSO₄4SigmaZ0251-100G
2MoO4Aldrich737-860-5G
NaCl2Fisher ScientificS271-1
CoClSigma-Aldrich232696-5G
FeEDTASigmaE6760-100G
“Stericup & Steritop” 瓶 默克密理博公司SCGVU02RE微量元素容器
www.milipore.com
用于根部清洗缓冲液的配制
EDTAAcros OrganicsA0305456
TrisFisher ScientificBP154-1
用于水培系统搭建
可高压灭菌泡沫试管塞Jaece Industries Inc.L800-AIdenti-Plugs 可适配直径为 6–13 mm 的孔
泡沫板Styrofoam 品牌  道ESR-2142厚度为1/2英寸
打孔器HumboldtH-9662带手柄软木钻套装,镀镍黄铜,6 件装,3/16" 至1/2" OD 规格
空气泵水培MK-1504
空气泵由沃尔玛公司(Wal-mart Stores, Inc.)销售
airline管和水族箱气泡石水培管路:928/25-S
airline 管道和水族箱气泡石由沃尔玛商店股份有限公司销售石料:ASC-1
其他
乙醇Fisher ScientificA995-4试剂酒精
氯化镉(CdCl₂)2)Sigma-Aldrich10108-64-2

参考文献

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