三维培养实验用于探究癌细胞侵袭性及卫星肿瘤形成

摘要

将癌细胞嵌入胶原凝胶中，然后夹在无细胞的纤维蛋白凝胶内，以构建一种三维培养系统，在该系统中可监测癌细胞的侵袭性及卫星肿瘤的形成。

摘要

单层哺乳动物细胞培养被广泛用于研究各种生理和分子过程。然而，这种研究细胞生长的方法常常产生不必要的假象。因此，由于三维（3D）环境下的细胞培养通常使用细胞外基质成分，更接近于天然组织结构，已成为一种颇具吸引力的替代方法 体内 组织或器官。我们开发了一种使用两个区室的三维细胞培养系统，即（i一个中央区室，内含嵌入胶原凝胶中的癌细胞，该胶原凝胶作为模拟原发性大球状肿瘤的假性原发灶ii由纤维蛋白凝胶构成的外周无细胞区室， 即 一种不同于中心区域所用的细胞外基质组分，可用于癌细胞迁移（侵袭前沿）和/或形成代表继发性或卫星肿瘤的微球状肿瘤。外周区域中卫星肿瘤的形成与天然肿瘤细胞已知的侵袭性或转移来源显著相关，这使得该三维培养系统具有独特性。该细胞培养方法可用于评估癌细胞的侵袭性和运动能力、细胞与细胞外基质的相互作用，以及作为评价抗癌药物特性的手段。

引言

研究癌细胞侵袭/迁移的基本特征和生物医学特性以及随后转移灶的形成，是当前 intensely 研究的课题^1,2。转移是癌症的最终阶段，其临床管理仍然难以实现。在细胞和分子水平上更深入地理解转移过程，将有助于开发更有效的治疗方法³。

可探索转移性细胞的多种特性 体外⁴ 包括其干性及获得过渡状态的潜能（例如，上皮-间质转化）以从原发肿瘤内部及向外迁移和侵袭⁵。然而， 体外 侵袭/转移过程的评估一直存在挑战，因为它几乎排除了血液循环/淋巴循环的贡献。此前已采用将肿瘤组织碎片包埋于胶原凝胶中的类器官培养方法来监测癌症的侵袭性。尽管该方法保留了肿瘤的复杂性（例如，非癌细胞的存在），肿瘤碎片暴露于有限的培养基扩散环境，易受取样偏差以及间质细胞过度生长的影响⁶一种替代方法是将癌细胞培养于细胞外基质（ECM）组分中，以模拟三维（3D）细胞环境。乳腺癌细胞系在胶原凝胶和/或基底膜来源基质中的增殖是目前研究最为充分的3D细胞培养实例之一。通过使用特定的3D细胞培养环境，可在一定程度上逆转标准培养条件下乳腺癌细胞所呈现的无序排列状态，进而自发形成乳腺腺泡和管状结构。^7-10此外，利用不同技术聚集腺癌细胞形成的多细胞肿瘤球体（例如悬滴法、悬浮球状体、琼脂包埋法）现已成为最常用的三维....

方案

注意：由于动物和人类癌细胞系为购买或他人馈赠，因此无需伦理审查。

1. 制备胶原塞（模拟原发性肿瘤）

1. 制备胶原蛋白分散液。可按照先前报道的方法提取并灭菌大鼠尾腱（RTT）来源的I型胶原蛋白¹⁷，也可直接购买。将冻干的大鼠尾腱胶原蛋白（3.25–3.50 mg/ml，溶于0.02 N乙酸中）使用搅拌器（高速档；分五次，每次2分钟）充分混匀，以获得均匀的分散液。
2. 用胰蛋白酶-EDTA消化收集细胞，并采用台盼蓝排斥法在血细胞计数板上计数活细胞。调整至所需细胞密度（每凝胶柱5 × 10⁴个细胞）。
3. 在无菌条件下分别配制所有溶液（NaOH、胎牛血清、5倍浓缩DMEM培养基、NaHCO₃）（表1），并置于冰上保持低温。注意：添加各种溶液的顺序至关重要，以避免细胞受到渗透压或酸性冲击。
4. 尽快将细胞悬液（1.25 × 10⁶个细胞）加入终体积为5 ml的胶原蛋白溶液中。通过反复吹打充分混匀，避免产生气泡，随后迅速将200 µl工作液分配至96孔板的每个孔中。轻轻敲击细胞培养操作台上的多孔板，以去除气泡并使溶液在孔内均匀铺展。
5. 待所有孔加样完毕（每块96孔板约需15–20分钟）后，将板放入培养箱中。
6. 将培养板在37 °C条件下孵育2小时至过夜。胶原凝胶化（即纤维形成）通常在3....

结果

如前所述，这种三维细胞培养实验的一个有趣特征是，癌细胞不仅能够从胶原凝胶迁移至相邻的纤维蛋白凝胶中，还能够形成继发性肿瘤例如，卫星瘤样结构）。通过凝胶厚度，使用倒置相差显微镜在低倍和高倍放大下可直接观察到这一现象，尤其是在使用长工作距离聚光镜时更为明显。图2）。利用这种三维细胞培养方法，可反复在不同实验设置中将已知转移性细胞的行为与非转移性细胞中的行为进行 readily 比较。¹⁵例如，在纤维蛋白凝胶中，转移性细胞系 B16F10 呈现大量随机分布的卫星瘤，而其非转移性对应细胞系 B16F0 仅能检测到极少数微小的卫星瘤（图2).

讨论

作为一个重要的技术说明，中心凝胶与周围凝胶之间的界面处不得存在任何间隙。否则，可能会降低细胞向纤维蛋白凝胶迁移或侵袭的能力。如果凝血酶未被适当稀释，在培养的最初24小时内，胶原凝胶与纤维蛋白凝胶之间可能形成空隙。此外，所测试的细胞系也可能导致胶原凝胶在培养过程中发生收缩，从而在两种凝胶之间形成相对较大的空隙。当基质细胞与癌细胞共同混合于胶原凝胶中时，由于类似肌成纤维细胞的活性¹⁸，这种情况尤其可能出现。为避免这一人为假象，应在组装纤维蛋白三明治结构之前，将胶原凝胶塞在37 °C下孵育更长时间（≥48小时），以诱导凝胶预先收缩。

实验过程中可能遇到的另一个问题是存在明显的纤维蛋白纤维或聚集体，这会使纤维蛋白凝胶呈现浑浊而非半透明的外观，从而干扰癌细胞迁移路径，增加数据解读的难度。此类问题可能源于在培养板中进行聚合反应时，纤维蛋白原溶液振荡不足或过度；也可能与凝血酶加入纤维蛋白原溶液的方式不当（步骤2.3）有关。一旦纤维蛋白凝胶凝固，其结构异常或浑浊状态便无法修复。胶原或纤维蛋白凝胶中可能含有气泡，大多数情况下，这些气泡会在培养数.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
冻干胶原蛋白	Sigma-Aldrich	C7661	来自大鼠尾腱（可溶性分散液）或自制（参见 Rajan 等，参考文献编号14）
纤维蛋白原（冻干）	Sigma-Aldrich	F8630	I型-S，蛋白质含量65 - 85% ≥ 75% 的蛋白质可凝固
凝血酶	EMD Chemicals 公司	605157	新泽西州吉布斯敦；NIH 单位/毫克干重
生长因子减少型Matrigel	康宁	356234	此前来自 BD Biosciences
抑肽酶	Sigma-Aldrich	A6279	5 - 10T IU/ml（胰蛋白酶抑制单位）的溶液
微型勺子	Fisher Scientific	2140115	Fisherbrand 手持式微型刮勺
96孔板，圆底	Sarstedt	3925500
24孔板	Sarstedt	3922
Dulbecco改良的Eagle培养基	Sigma化学公司	D5546	DMEM
胎牛血清	VWR	CAA15-701	FBS，加拿大来源
胰蛋白酶-EDTA	Sigma化学公司	T4049
汉克’s 平衡盐溶液	Sigma化学公司	H8264	HBSS