三维培养实验用于探究癌细胞侵袭性及卫星肿瘤形成

摘要

将癌细胞嵌入胶原凝胶中，然后夹在无细胞的纤维蛋白凝胶内，以构建一种三维培养系统，在该系统中可监测癌细胞的侵袭性及卫星肿瘤的形成。

摘要

单层哺乳动物细胞培养被广泛用于研究各种生理和分子过程。然而，这种研究细胞生长的方法常常产生不必要的假象。因此，由于三维（3D）环境下的细胞培养通常使用细胞外基质成分，更接近于天然组织结构，已成为一种颇具吸引力的替代方法 体内 组织或器官。我们开发了一种使用两个区室的三维细胞培养系统，即（i一个中央区室，内含嵌入胶原凝胶中的癌细胞，该胶原凝胶作为模拟原发性大球状肿瘤的假性原发灶ii由纤维蛋白凝胶构成的外周无细胞区室， 即 一种不同于中心区域所用的细胞外基质组分，可用于癌细胞迁移（侵袭前沿）和/或形成代表继发性或卫星肿瘤的微球状肿瘤。外周区域中卫星肿瘤的形成与天然肿瘤细胞已知的侵袭性或转移来源显著相关，这使得该三维培养系统具有独特性。该细胞培养方法可用于评估癌细胞的侵袭性和运动能力、细胞与细胞外基质的相互作用，以及作为评价抗癌药物特性的手段。

引言

研究癌细胞侵袭/迁移的基本特征和生物医学特性以及随后转移灶的形成，是当前 intensely 研究的课题^1,2。转移是癌症的最终阶段，其临床管理仍然难以实现。在细胞和分子水平上更深入地理解转移过程，将有助于开发更有效的治疗方法³。

可探索转移性细胞的多种特性 体外⁴ 包括其干性及获得过渡状态的潜能（例如，上皮-间质转化）以从原发肿瘤内部及向外迁移和侵袭⁵。然而， 体外 侵袭/转移过程的评估一直存在挑战，因为它几乎排除了血液循环/淋巴循环的贡献。此前已采用将肿瘤组织碎片包埋于胶原凝胶中的类器官培养方法来监测癌症的侵袭性。尽管该方法保留了肿瘤的复杂性（例如，非癌细胞的存在），肿瘤碎片暴露于有限的培养基扩散环境，易受取样偏差以及间质细胞过度生长的影响⁶一种替代方法是将癌细胞培养于细胞外基质（ECM）组分中，以模拟三维（3D）细胞环境。乳腺癌细胞系在胶原凝胶和/或基底膜来源基质中的增殖是目前研究最为充分的3D细胞培养实例之一。通过使用特定的3D细胞培养环境，可在一定程度上逆转标准培养条件下乳腺癌细胞所呈现的无序排列状态，进而自发形成乳腺腺泡和管状结构。^7-10此外，利用不同技术聚集腺癌细胞形成的多细胞肿瘤球体（例如悬滴法、悬浮球状体、琼脂包埋法）现已成为最常用的三维细胞培养检测方法^11-13然而，该检测方法受限于能够形成球状体的癌细胞系种类有限，以及在这些条件下研究细胞的时间较短。

在此可视化技术中，我们介绍一种复杂的三维细胞培养检测方法，其中将目标癌细胞包埋于胶原凝胶中，以允许其 体外 由基底膜来源的基质替代包被形成的假性原位肿瘤。一旦形成，该假性原位肿瘤即被夹在无细胞基质（本实验中为纤维蛋白凝胶）中，使癌细胞能够穿越两个基质区室之间的界面（参见 图1）。有趣的是，在纤维蛋白凝胶中，可观察到由假性原发性肿瘤产生的继发性肿瘤样结构以及具有侵袭性的癌细胞。这种三维培养系统具有足够的灵活性，可用于研究抗癌药物、基因表达以及细胞间和/或细胞与细胞外基质（ECM）间的相互作用^14-16.

图 1：方法概述。 生成用于癌症研究的三维细胞培养系统的示意图解。请点击此处查看该图的放大版本。

方案

注意：由于动物和人类癌细胞系为购买或他人馈赠，因此无需伦理审查。

1. 制备胶原塞（模拟原发性肿瘤）

1. 制备胶原蛋白分散液。可按照先前报道的方法提取并灭菌大鼠尾腱（RTT）来源的I型胶原蛋白¹⁷，也可直接购买。将冻干的大鼠尾腱胶原蛋白（3.25–3.50 mg/ml，溶于0.02 N乙酸中）使用搅拌器（高速档；分五次，每次2分钟）充分混匀，以获得均匀的分散液。
2. 用胰蛋白酶-EDTA消化收集细胞，并采用台盼蓝排斥法在血细胞计数板上计数活细胞。调整至所需细胞密度（每凝胶柱5 × 10⁴个细胞）。
3. 在无菌条件下分别配制所有溶液（NaOH、胎牛血清、5倍浓缩DMEM培养基、NaHCO₃）（表1），并置于冰上保持低温。注意：添加各种溶液的顺序至关重要，以避免细胞受到渗透压或酸性冲击。
4. 尽快将细胞悬液（1.25 × 10⁶个细胞）加入终体积为5 ml的胶原蛋白溶液中。通过反复吹打充分混匀，避免产生气泡，随后迅速将200 µl工作液分配至96孔板的每个孔中。轻轻敲击细胞培养操作台上的多孔板，以去除气泡并使溶液在孔内均匀铺展。
5. 待所有孔加样完毕（每块96孔板约需15–20分钟）后，将板放入培养箱中。
6. 将培养板在37 °C条件下孵育2小时至过夜。胶原凝胶化（即纤维形成）通常在30分钟内完成。随后向每孔加入100 µl培养基，进行过夜培养。

2. 纤维蛋白凝胶的第一层

1. 纤维蛋白原溶液的制备
   注意：为了获得更可重复的结果，建议使用同一批次的纤维蛋白凝胶，因为不同批次的商用冻干纤维蛋白原在形成纤维蛋白凝胶时可能存在差异。
   1. 始终使用新鲜配制的纤维蛋白原溶液。在打开冻干纤维蛋白原小瓶前，应将其恢复至室温，以避免水合结晶的形成。
   2. 逐步将纤维蛋白原溶解于预热（37 °C）的含钙汉克平衡盐溶液（HBSS）中²⁺/毫克²⁺ 工作浓度为 3 mg/ml（建议准备所需最小终体积的 15% 过量）： 例如，5.75 ml 中含 17.25 mg，配制 5 ml 溶液。
      1. 首先逐滴加入预热的HBSS以溶解纤维蛋白原碎片。使用刮勺在烧杯中将较大的碎片捣碎。不时摇动烧杯以促进混合。操作过程中不得使用磁力搅拌器。通过反复吹打悬浮液使剩余粉末完全溶解。
   3. 在通过0.22 µm滤器过滤溶液以灭菌时，保持纤维蛋白原溶液处于温热状态。注意：如果HBSS温度不够高或纤维蛋白原未完全溶解，溶液可能会堵塞滤器。如确有需要，可更换滤器一至两次，但可能导致纤维蛋白原浓度降低，从而影响纤维蛋白凝块的刚度。
   4. 重悬目标细胞（例如，内皮细胞）加入现成的纤维蛋白原溶液中，同时调整其最终体积，作为替代方案。
2. 制备凝血酶溶液。
   1. 用ddH₂O配制储备液₂O（50 NIH 单位/毫升），然后使用 0.22 µm 滤器进行过滤除菌。
   2. 使用纤维蛋白原与凝血酶体积比 ≥1:0.0075 来制备纤维蛋白凝胶。
3. 制备纤维蛋白凝胶
   1. 在接下来的所有步骤中，将无菌的纤维蛋白原和凝血酶储备液置于冰上。纤维蛋白凝胶在24孔板中形成。
   2. 每孔立即加入纤维蛋白原溶液（200 µl/孔），覆盖孔表面，避免产生气泡。每次处理6个孔。
   3. 一旦纤维蛋白原溶液完全覆盖孔板表面，将孔板倾斜至45°角，通过将凝血酶溶液滴加至第一孔的中心位置，加入1.5 µl凝血酶溶液，然后轻轻水平旋转孔板1–2秒。
      1. 将培养板置于超净工作台内稳定位置，静置5-10分钟，直至凝胶/凝固过程完成（注意：聚合过程不得受到扰动）。 例如，通过将培养板转移至培养箱中。
   4. 一旦前六个孔凝固后，重复相同的步骤（即 重复上述三个步骤，依次处理接下来的六个孔，直至所有孔均完成处理。

3. 纤维蛋白凝胶的第二层及夹心胶原塞

1. 选项A：（立即使用胶原塞）
   1. 轻轻倾斜培养板，确保纤维蛋白凝胶在所有孔中均已聚合。将含有胶原凝胶塞的96孔板与含有纤维蛋白凝胶的24孔板并排放置，以便转移胶原凝胶塞。
   2. 向含有胶原塞的培养板各孔中加入一滴 HBSS。
   3. 用装在注射器上的细针（作为手柄使用）或使用微型勺，从孔中取出每个胶原蛋白栓（参见视频）。用一至两把微型勺将每个胶原蛋白栓转移至第一层纤维蛋白凝胶上，确保胶原蛋白栓准确居中置于孔内，并始终保持无菌条件。
   4. 将先前形成的纤维蛋白凝胶覆盖第二层纤维蛋白原溶液（300 µl/孔），并按照步骤2.3所述加入凝血酶，保持最低1:0.0075的比例，每次处理六个孔的顺序进行。
2. 选项B（在胶原蛋白栓上包被一层薄薄的生长因子减少型基底膜（GFRBM））
   1. 提前将所有配制好的溶液和仪器冷却，并保持在 4 °C 或冰上（例如，移液器，吸头，试管）操作过程中，由于GFRBM的冷冻分装样品在解冻时对过快的加热速率非常敏感（请遵循制造商的说明）。
   2. 从孔板中取出后，将每个胶原塞放入含有100 µl纯GRFBM溶液的1.5 ml离心管中，冰上浸泡2分钟。
   3. 将每个包被好的凝胶塞转移至第一层纤维蛋白层上，确保其中心位置准确，操作方法如前所述。将含有凝胶塞的培养板在37 °C孵育5分钟，使GRFBM形成凝胶。按照步骤3.1.4加入第二层纤维蛋白层。

4. 细胞培养基条件

1. 向每个孔中加入培养基（400 µl）。培养基及添加剂的选择应根据细胞系和实验条件而定。
2. 将抑肽酶（一种抗纤溶剂）加入培养基中，使其终浓度为 100 激肽释放酶抑制单位（KIU）/ml。
   注意：将培养板置于细胞培养箱中，培养条件应与所测试细胞系的常规培养条件一致。
3. 每隔一天或按照实验计划用新鲜培养基更换培养液，并重新添加抑肽酶。更换新鲜培养基前，将培养板轻轻倾斜至 30–35° 角，将移液器管口靠在孔壁上，在持续观察下小心吸出条件培养基。

结果

如前所述，这种三维细胞培养实验的一个有趣特征是，癌细胞不仅能够从胶原凝胶迁移至相邻的纤维蛋白凝胶中，还能够形成继发性肿瘤例如，卫星瘤样结构）。通过凝胶厚度，使用倒置相差显微镜在低倍和高倍放大下可直接观察到这一现象，尤其是在使用长工作距离聚光镜时更为明显。图2）。利用这种三维细胞培养方法，可反复在不同实验设置中将已知转移性细胞的行为与非转移性细胞中的行为进行 readily 比较。¹⁵例如，在纤维蛋白凝胶中，转移性细胞系 B16F10 呈现大量随机分布的卫星瘤，而其非转移性对应细胞系 B16F0 仅能检测到极少数微小的卫星瘤（图2).

讨论

作为一个重要的技术说明，中心凝胶与周围凝胶之间的界面处不得存在任何间隙。否则，可能会降低细胞向纤维蛋白凝胶迁移或侵袭的能力。如果凝血酶未被适当稀释，在培养的最初24小时内，胶原凝胶与纤维蛋白凝胶之间可能形成空隙。此外，所测试的细胞系也可能导致胶原凝胶在培养过程中发生收缩，从而在两种凝胶之间形成相对较大的空隙。当基质细胞与癌细胞共同混合于胶原凝胶中时，由于类似肌成纤维细胞的活性¹⁸，这种情况尤其可能出现。为避免这一人为假象，应在组装纤维蛋白三明治结构之前，将胶原凝胶塞在37 °C下孵育更长时间（≥48小时），以诱导凝胶预先收缩。

实验过程中可能遇到的另一个问题是存在明显的纤维蛋白纤维或聚集体，这会使纤维蛋白凝胶呈现浑浊而非半透明的外观，从而干扰癌细胞迁移路径，增加数据解读的难度。此类问题可能源于在培养板中进行聚合反应时，纤维蛋白原溶液振荡不足或过度；也可能与凝血酶加入纤维蛋白原溶液的方式不当（步骤2.3）有关。一旦纤维蛋白凝胶凝固，其结构异常或浑浊状态便无法修复。胶原或纤维蛋白凝胶中可能含有气泡，大多数情况下，这些气泡会在培养数...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
冻干胶原蛋白	Sigma-Aldrich	C7661	来自大鼠尾腱（可溶性分散液）或自制（参见 Rajan 等，参考文献编号14）
纤维蛋白原（冻干）	Sigma-Aldrich	F8630	I型-S，蛋白质含量65 - 85% ≥ 75% 的蛋白质可凝固
凝血酶	EMD Chemicals 公司	605157	新泽西州吉布斯敦；NIH 单位/毫克干重
生长因子减少型Matrigel	康宁	356234	此前来自 BD Biosciences
抑肽酶	Sigma-Aldrich	A6279	5 - 10T IU/ml（胰蛋白酶抑制单位）的溶液
微型勺子	Fisher Scientific	2140115	Fisherbrand 手持式微型刮勺
96孔板，圆底	Sarstedt	3925500
24孔板	Sarstedt	3922
Dulbecco改良的Eagle培养基	Sigma化学公司	D5546	DMEM
胎牛血清	VWR	CAA15-701	FBS，加拿大来源
胰蛋白酶-EDTA	Sigma化学公司	T4049
汉克’s 平衡盐溶液	Sigma化学公司	H8264	HBSS