小鼠高级重复性行为潜在检测方法：新物体探索实验

摘要

高级别的限制性重复行为（RRBs）会扰乱患者的生活。这些行为在啮齿类动物中难以建模，使得针对RRBs潜在治疗或干预措施的基础生物医学研究变得困难。本文介绍了一种新的物体探索方法，可作为检测小鼠高级别RRBs的潜在实验手段。

摘要

刻板重复性行为（RRBs）是自闭症谱系障碍（ASD）的核心特征之一，严重影响患者的生活质量。RRBs 通常被分为低阶和高阶两类，其中低阶 RRBs 主要表现为运动刻板行为，而高阶 RRBs 则包括持续性行为和序列化行为。在小鼠中建立高阶 RRBs 的模型具有挑战性。目前用于检测小鼠 RRBs 的实验方法主要集中在低阶行为成分，这使得针对高阶 RRBs 的基础生物医学研究以及潜在治疗或干预手段的开发变得困难。本文介绍了一种新的实验方法——新物体探索实验。该实验使用一个基础的开放场装置，在其四周放置四个新物体。允许测试小鼠在装置内自由探索，并记录其探索各个新物体的顺序。通过这些数据，可以识别出小鼠探索行为中的模式化序列，并确定每只小鼠最偏好的物体。本文提供的代表性数据以及以往使用新物体探索实验的研究结果表明，近交系小鼠在该实验中表现出不同的行为特征，且低阶 RRBs 水平较高的品系也表现出更强的模式化探索行为。因此，新物体探索实验在表型效度上较好地模拟了人类的高阶 RRBs，可能成为未来研究 ASD 新疗法的一项有价值的实验工具。

引言

自闭症谱系障碍（ASD）是一种神经发育障碍，其核心症状包括三个方面：社交障碍、语言沟通困难以及重复刻板行为¹。自2000年以来，在十年间，被诊断为ASD的个体比例从每150人中1例上升至每68人中1例²。尽管该障碍的患病率持续上升，但其病因至今尚未明确。近年来，人们 increasingly 致力于寻找能够模拟ASD核心症状及相关症状的合适小鼠模型，因为这些模型有助于更深入地理解ASD潜在的症状表现和致病机制。目前已发现多种近交系小鼠品系表现出与ASD核心症状具有表观效度的行为特征，包括重复性行为³。

刻板重复性行为（RRBs）是某些精神疾病（如孤独症谱系障碍，ASD）的核心症状之一。RRBs 随着疾病严重程度的增加而加剧⁴，并可能严重干扰患者的生活方式。RRBs 通常分为两类：低阶重复性行为，在人类中表现为摇晃身体、拍手等动作；以及高阶重复性行为，表现为严格遵守日常程序和抗拒改变^5-8。

低阶重复性行为在啮齿类动物中已被广泛研究，其表现为易于在实验室环境中观察到的运动性刻板行为⁹。这些行为在人类重复性限制性行为（RRBs）中具有良好的表型效度，可能也具有较强的构念效度¹⁰。通过视频监测小鼠活动来检测低阶RRBs的存在，可用来分析这些运动性刻板行为的发生频次和持续时间<....

方案

本方案已获得雷德兰兹大学机构动物照护与使用委员会的批准。 本研究中使用的C58、C57和FVB小鼠均在雷德兰兹大学动物房内繁育，其种源最初购自杰克逊实验室（缅因州巴港）。 该动物房的哨兵鼠每六个月接受一次筛查，结果均无病原体感染。

1. 仪器设备与房间设置

注意：我们使用了两种不同的环境进行新物体测试：一个透明的塑料矩形笼子（45 cm × 24 cm × 20 cm）或一个底部直径为41 cm的不透明圆形笼子；但也可使用其他任何笼子。Pearson et al. 在其检测中使用了一个较小的矩形笼子（20 cm × 30 cm × 20 cm）。本实验设计的具体细节如下所述，但由于该检测方法较新，行为表型分析领域尚未对所描述的任何变量建立公认的标准。 

1. 在测试区域中铺入约½英寸厚的玉米芯垫料。
2. 选择四种不同的新颖物体。所选物体应大小相近，由高密度塑料制成以便清洁并防止啃咬，且在形状和颜色上彼此不同。重要的是，确保测试小鼠在进行实验前未接触过这些物体。
   注：例如，本实验中使用了粉色玩具积木、红色猴子、白色带蓝色文字的瓷砖以及标准白色骰子。
3. 在矩形测试区域中，将这些物体放置在距各个角落约3 cm的位置。在圆形测试区域中，将物体等间距放置，并距离边缘约10 cm。将每个物体的位置编号为1至4（图1）。确保在整个测试过程中，物体的摆放顺序为随机或采用平衡....

结果

代表性数据²²显示，在圆形竞技场中，雌性C58/J小鼠表现出的测序模式数量高于其他品系（图2，面板A），但在矩形竞技场中则无此差异（图2，面板C）。三种雄性品系之间在两种环境中均无显著差异（图2，面板B和D）。代表性数据还显示，雄性和雌性C58/J小鼠在圆形竞技场中对其访问次数最多的物体表现出更强的偏好（相应地，对访问次数最少的物体偏好更低）（图3，面板A和C），但在矩形竞技场中则无此表现（图3，面板B和D）。

讨论

本文介绍了一种近期开发的行为检测方法，该方法可能有助于量化小鼠行为，且在表型效度上与人类高级重复性行为具有相关性。与巴恩斯迷宫或T型迷宫等较为成熟的行为检测方法不同，这种新颖物体探索检测无需对小鼠进行任何训练，也不会显著引发焦虑反应。此外，新颖物体探索检测不依赖食物或社交刺激，从而可更专注于目标行为——即刻板重复行为（RRBs），并降低混杂变量干扰实验结果的可能性。进一步研究表明，不同品系的小鼠在该检测中表现出不同的行为特征：那些表现出较高水平低阶RRBs的小鼠，在新颖物体探索检测中也显示出增强的模式化探索行为和物体偏好倾向^17,22。因此，该检测方法在表型效度上较好地模拟了人类的RRBs。若未来研究者对该检测方法进行修改，应充分考虑上述优势，特别是无需训练以及尽量减少诱发焦虑刺激的特点。检测中所用新颖物体的选择（第1.2节）至关重要，所选物体应易于清洁，外观特征明显不同，且大小相近。使用摄像机记录检测过程（第1.4节）以及让小鼠在测试前适应实验环境（第2.3节）同样至关重要，因为测试环境的新异性或实验人员在场均可能影响小鼠的行为表现。这些是本实验方案中的关键环节。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
标准聚碳酸酯啮齿类动物笼具（45 cm x 24 cm x 20 cm）			建议使用多个笼具，以便同时测试多只小鼠
塑料不透明圆形测试 arena（底面直径 41 cm）	United States Plastic Corp.	13931	建议使用多个 arena，以便同时测试多只小鼠
标准玉米芯啮齿类动物垫料
新物体——红色猴子	Hasbro, Pawtucket RI		来自“猴子桶”（Barrel of Monkeys）
新物体——矩形 2 x 4 LEGO 积木
新物体——拼图块	Thinkfun Inc., Alexandria VA		来自“Toot and Otto”游戏
新物体——标准白色骰子
视频摄像机
行为记录软件——The Observer	Noldus, Wageningen, The Netherlands	也可使用其他程序
视频追踪软件——EthoVision	Noldus, Wageningen, The Netherlands	也可使用其他程序
X-Keys 输入键盘	P.I. Engineering, Williamstown MI	829484
MacroWorks II	P.I. Engineering, Williamstown MI