小鼠高级重复性行为潜在检测方法：新物体探索实验

摘要

高级别的限制性重复行为（RRBs）会扰乱患者的生活。这些行为在啮齿类动物中难以建模，使得针对RRBs潜在治疗或干预措施的基础生物医学研究变得困难。本文介绍了一种新的物体探索方法，可作为检测小鼠高级别RRBs的潜在实验手段。

摘要

刻板重复性行为（RRBs）是自闭症谱系障碍（ASD）的核心特征之一，严重影响患者的生活质量。RRBs 通常被分为低阶和高阶两类，其中低阶 RRBs 主要表现为运动刻板行为，而高阶 RRBs 则包括持续性行为和序列化行为。在小鼠中建立高阶 RRBs 的模型具有挑战性。目前用于检测小鼠 RRBs 的实验方法主要集中在低阶行为成分，这使得针对高阶 RRBs 的基础生物医学研究以及潜在治疗或干预手段的开发变得困难。本文介绍了一种新的实验方法——新物体探索实验。该实验使用一个基础的开放场装置，在其四周放置四个新物体。允许测试小鼠在装置内自由探索，并记录其探索各个新物体的顺序。通过这些数据，可以识别出小鼠探索行为中的模式化序列，并确定每只小鼠最偏好的物体。本文提供的代表性数据以及以往使用新物体探索实验的研究结果表明，近交系小鼠在该实验中表现出不同的行为特征，且低阶 RRBs 水平较高的品系也表现出更强的模式化探索行为。因此，新物体探索实验在表型效度上较好地模拟了人类的高阶 RRBs，可能成为未来研究 ASD 新疗法的一项有价值的实验工具。

引言

自闭症谱系障碍（ASD）是一种神经发育障碍，其核心症状包括三个方面：社交障碍、语言沟通困难以及重复刻板行为¹。自2000年以来，在十年间，被诊断为ASD的个体比例从每150人中1例上升至每68人中1例²。尽管该障碍的患病率持续上升，但其病因至今尚未明确。近年来，人们 increasingly 致力于寻找能够模拟ASD核心症状及相关症状的合适小鼠模型，因为这些模型有助于更深入地理解ASD潜在的症状表现和致病机制。目前已发现多种近交系小鼠品系表现出与ASD核心症状具有表观效度的行为特征，包括重复性行为³。

刻板重复性行为（RRBs）是某些精神疾病（如孤独症谱系障碍，ASD）的核心症状之一。RRBs 随着疾病严重程度的增加而加剧⁴，并可能严重干扰患者的生活方式。RRBs 通常分为两类：低阶重复性行为，在人类中表现为摇晃身体、拍手等动作；以及高阶重复性行为，表现为严格遵守日常程序和抗拒改变^5-8。

低阶重复性行为在啮齿类动物中已被广泛研究，其表现为易于在实验室环境中观察到的运动性刻板行为⁹。这些行为在人类重复性限制性行为（RRBs）中具有良好的表型效度，可能也具有较强的构念效度¹⁰。通过视频监测小鼠活动来检测低阶RRBs的存在，可用来分析这些运动性刻板行为的发生频次和持续时间¹¹。对于利用啮齿类动物开展的基础生物医学研究而言，高阶重复性行为则构成了挑战，因为这些RRBs无法通过简单观察轻易识别。由于识别这些行为存在困难，目前可用于评估高阶重复性行为的成熟检测方法较少。传统上，啮齿类动物中的高阶RRBs通常采用迷宫范式进行测量，即先训练实验动物掌握逃离任务的能力，随后改变逃离位置，并记录动物重新学习新逃离位置所需的试验次数¹²。这类检测方法并不理想，因其需要较长的训练周期，常引发焦虑情绪，且可能导致结果变异度较高。孔板探索实验也被用于量化高阶RRBs^13,14。该方法无需长时间训练，但依赖于食物动机和/或嗅觉辨别能力。因此，若能开发出不引发焦虑且无需训练的高阶RRBs检测方法，将是对当前所用孔板探索和基于迷宫的检测手段的有力补充。

C58/J（C58）近交系小鼠是自闭症谱系障碍（ASD）相关刻板行为的典型代表，表现出高水平的重复性、无目的性的运动性刻板行为以及显著增加的自我理毛行为^3,11。此外，C58小鼠还通过频繁直立、后空翻和抓挠等行为表现出重复性刻板行为（RRBs）^11,14,16。该品系从小鼠新生期早期即开始出现这些行为，并持续至成年期。  若能检测该品系及其他小鼠品系中是否存在升高的高级RRBs，将有助于补充目前已充分记录的低级RRBs表现，具有重要意义。  本文所述的新物体探索实验为研究者提供了同时观察低级和高级RRBs的机会，因其能够测量模式化行为以及重复性运动刻板行为。

利用新物体探索作为检测高级重复性行为的方法由 Pearson 等¹⁷ 建立。该新评估方法是在成熟的行为旷场实验^18-21 基础上发展而来，通过在实验区域内增加四个新物体实现。允许小鼠自由探索这些陌生物体，并记录其探索物体的次数和顺序。随后分析物体探索行为中是否存在特定模式，结果显示 BTBR 小鼠在物体间的模式化探索次数显著增加。通过该方法，可在无需训练动物学习特定行为且避免引入不必要刺激的条件下，检测小鼠的高级重复性和模式化行为。新物体探索可诱发高级刻板重复行为（RRBs），因为它允许小鼠在自然探索过程中自主形成行为模式和序列。使用该检测方法可对这些高级 RRBs 的存在进行量化分析。

Pearson 等 开发了该检测方法，并利用其检测BTBR近交系小鼠中是否存在潜在的高级重复行为，得到了引人注目的结果¹⁷。我们最近发表了一项后续研究，考察了C58、C57BL/6J（C57）和FVB/NJ（FVB）品系的行为特征，以及对该检测方法中可能存在的混杂变量进行了更详细的分析，并探讨了可能用于分析所生成数据的统计学方法²²。

方案

本方案已获得雷德兰兹大学机构动物照护与使用委员会的批准。 本研究中使用的C58、C57和FVB小鼠均在雷德兰兹大学动物房内繁育，其种源最初购自杰克逊实验室（缅因州巴港）。 该动物房的哨兵鼠每六个月接受一次筛查，结果均无病原体感染。

1. 仪器设备与房间设置

注意：我们使用了两种不同的环境进行新物体测试：一个透明的塑料矩形笼子（45 cm × 24 cm × 20 cm）或一个底部直径为41 cm的不透明圆形笼子；但也可使用其他任何笼子。Pearson et al. 在其检测中使用了一个较小的矩形笼子（20 cm × 30 cm × 20 cm）。本实验设计的具体细节如下所述，但由于该检测方法较新，行为表型分析领域尚未对所描述的任何变量建立公认的标准。 

1. 在测试区域中铺入约½英寸厚的玉米芯垫料。
2. 选择四种不同的新颖物体。所选物体应大小相近，由高密度塑料制成以便清洁并防止啃咬，且在形状和颜色上彼此不同。重要的是，确保测试小鼠在进行实验前未接触过这些物体。
   注：例如，本实验中使用了粉色玩具积木、红色猴子、白色带蓝色文字的瓷砖以及标准白色骰子。
3. 在矩形测试区域中，将这些物体放置在距各个角落约3 cm的位置。在圆形测试区域中，将物体等间距放置，并距离边缘约10 cm。将每个物体的位置编号为1至4（图1）。确保在整个测试过程中，物体的摆放顺序为随机或采用平衡设计。
4. 在测试区域正上方架设摄像机，以完整记录适应期和测试期间整个区域的情况。
   注：实验人员若在测试期间与小鼠处于同一房间，可能会影响小鼠的活动水平和探索行为。

2. 新物体探索实验

1. 在光周期开始时进行测试，测试房间使用荧光灯照明，照度约为100勒克斯。确保测试区域光照均匀，以在视频录制过程中保持外观一致。
2. 将一张已知尺寸的卡片放置在测试区域底部，并开始视频录制。
3. 将待测小鼠放入空的测试区域中，持续10分钟，作为适应期。在此期间进行视频记录。
4. 适应期结束后，将小鼠留在测试区域内，迅速加入四个新物体，并继续记录小鼠行为10分钟。
5. 当完整的20分钟适应/测试期结束后，将待测小鼠放回其饲养笼，使用无香味的洗洁精和水彻底清洗并擦干新物体及测试区域。

3. 视频评分

1. 使用视频完成所有行为评分，以提高可靠性。
   注意：使用行为记录软件 Noldus The Observer 执行以下步骤²² 如上所述，但无需使用专用程序：
   1. 在对首个视频进行评分之前，通过创建新项目或编辑一个已有的相似项目，在行为记录软件中设置项目的编码方案。
      1. 在项目设置框中，将数据采集设置为“离线观察”。在行为编码框中，进行编程 "斯克拉布勒", "挖掘", "饲养", "梳理行为" 和 "嗅闻物体1、2、3和4" 作为“状态事件”。程序 "跳跃" 作为“点事件”。注：这些行为的定义在其他地方有详细描述¹¹.
         注意：状态事件具有开始和结束时间，而点事件仅收集计数数据。每种离散行为对应的按键由软件生成，并将这些相应按键编程到辅助键盘中（步骤 3.1.2）。
      2. 要编程设置辅助键盘，请打开键盘软件，点击屏幕上显示的相应辅助键盘按钮，输入相应的按键组合，然后点击“确定”。完成辅助键盘编程后，关闭软件，程序将在计算机后台运行。
   2. 项目设置完成后，使用行为记录软件对以下行为的次数和持续时间进行评分：后肢直立（定义为小鼠两只前爪同时接触测试 arena 的侧壁）、挖掘（定义为小鼠两只前爪同时向 arena 垫料中挖掘）、自我理毛（定义为小鼠舔舐自身身体任何部位和/或以前爪触碰面部任何部位）以及跳跃（定义为小鼠后肢直立后腾跃，使四肢同时离开地面）。
      1. 要对视频进行评分，请转到文件 > 打开项目，然后观察 > 观察 > 新建。程序将提示输入文件名。命名后，选择相应的视频媒体文件。
      2. 点击“开始观察”按钮以开始评分。
         注意：在对小鼠重复性行为进行评分时，所有状态事件（State Events）均需要两次按键，第一次按键对应行为的开始，第二次按键对应行为的结束；而点事件（Point Events）仅需要一次按键。
   3. 记录小鼠嗅探每个物体的次数。嗅探定义为小鼠将鼻部移动至距物体0.5 cm范围内的任何情况。使用行为记录软件测量嗅探持续时间，方法与测量重复性行为持续时间相同（步骤3.1.2）。
      1. 每次小鼠嗅探物体时，记录相应的位置编号，10分钟测试期结束时将得到一串数字（例如 1243421…）。手动记录这些数据。
         注意：为了提高评分视频的效率和一致性，数字始终对应于特定位置，而非特定物体。
      2. 如果一只小鼠嗅探一个物体，然后移开视线，接着再次嗅探该物体，则应将该嗅探次数计为两次。
      3. 完整评分10分钟视频后，点击“分析”以可视化数据 > 行为分析 > 新。数据出现在屏幕上后，导出或复制粘贴到单独的电子表格中。
   4. 记录小鼠在测试期间于旷场内移动的总距离。
      注意：使用已校准的视频追踪软件来追踪测试小鼠并记录其移动的总距离（单位：厘米）以完成此步骤。所有由视频追踪软件分析的视频，在录制开始时均在实验区域内放置一张已知尺寸的卡片。
      1. 使用卡片在软件中校准每个视频，方法是在卡片的每一端设置一条校准线，并在校准界面中输入相应的长度。绘制完线条后，输入与每条线对应的卡片已知长度和宽度。
      2. 在 Arena 设置中，选择整个 arena。
         注意：如果在软件中对竞技场的不同区域进行区分，则可以分别设置 例如，小鼠沿墙壁移动与穿过中心区域的活动情况是关注重点。
      3. 在试验控制设置中，选择十分钟的持续时间。在检测设置中，选择亮背景上的暗物体。
         注意：如果使用的是白化小鼠或背景颜色较深，则需要对此进行调整。
      4. 设置编程完成后，对视频进行评分。点击 Acquisition > 开始采集。在采集控制框中，点击“新建试验”，然后点击“开始试验”。十分钟后，程序自动停止，数据可被可视化。
      5. 点击分析 > 计算统计量。数据出现在屏幕上后，导出或复制并粘贴到单独的电子表格中。

4. 统计分析、测序

1. 在每只小鼠生成的对应于物体探索的数字串中，识别所有不重复数字的三位数组合的总数例如 121、123、124，但不包括112或122。
   注意：使用了用 Python 编程语言编写的程序来识别每个可能序列在数字字符串中出现的次数。使用外部程序并非必需，此步骤可通过多种不同方法完成例如 使用 Microsoft Word 或 Excel 中的查找功能）。
2. 记录每条序列出现的次数，并确定每只小鼠中重复次数最多的三条序列。
   注意：不同小鼠的个体序列会有所差异，与序列本身相比，序列重复的次数更具研究意义即 遵循模式的重要性超过模式本身。
3. 由于小鼠重复序列的总次数与其活动水平呈正相关，因此需通过将每只小鼠最频繁出现的模式数量除以其序列模式总数来校正该值。这将得到一个与总体活动水平无关的序列重复指数。
4. 使用适当的方差分析（ANOVA）和多重比较方法（如Dunnett检验），比较各组小鼠重复其最常见序列的次数（已根据活动水平校正） 例如）以及事后检验。

5. 统计分析，对象偏好

1. 使用上述生成的相同数字序列（步骤 3.1.3.1），通过统计每只小鼠对每个物体的探索总次数来确定其对新物体的偏好，换句话说，即统计该数据序列中 1 秒、2 秒、3 秒和 4 秒出现的总次数。根据活动水平进行校正，并按照上述方法（步骤 4.3–4.4）进行 ANOVA 比较。
   注意：本实验室发表的这些方法²²，以及此处描述的内容，主要基于 Pearson et al.¹⁷

结果

代表性数据²²显示，在圆形竞技场中，雌性C58/J小鼠表现出的测序模式数量高于其他品系（图2，面板A），但在矩形竞技场中则无此差异（图2，面板C）。三种雄性品系之间在两种环境中均无显著差异（图2，面板B和D）。代表性数据还显示，雄性和雌性C58/J小鼠在圆形竞技场中对其访问次数最多的物体表现出更强的偏好（相应地，对访问次数最少的物体偏好更低）（图3，面板A和C），但在矩形竞技场中则无此表现（图3，面板B和D）。

讨论

本文介绍了一种近期开发的行为检测方法，该方法可能有助于量化小鼠行为，且在表型效度上与人类高级重复性行为具有相关性。与巴恩斯迷宫或T型迷宫等较为成熟的行为检测方法不同，这种新颖物体探索检测无需对小鼠进行任何训练，也不会显著引发焦虑反应。此外，新颖物体探索检测不依赖食物或社交刺激，从而可更专注于目标行为——即刻板重复行为（RRBs），并降低混杂变量干扰实验结果的可能性。进一步研究表明，不同品系的小鼠在该检测中表现出不同的行为特征：那些表现出较高水平低阶RRBs的小鼠，在新颖物体探索检测中也显示出增强的模式化探索行为和物体偏好倾向^17,22。因此，该检测方法在表型效度上较好地模拟了人类的RRBs。若未来研究者对该检测方法进行修改，应充分考虑上述优势，特别是无需训练以及尽量减少诱发焦虑刺激的特点。检测中所用新颖物体的选择（第1.2节）至关重要，所选物体应易于清洁，外观特征明显不同，且大小相近。使用摄像机记录检测过程（第1.4节）以及让小鼠在测试前适应实验环境（第2.3节）同样至关重要，因为测试环境的新异性或实验人员在场均可能影响小鼠的行为表现。这些是本实验方案中的关键环节。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
标准聚碳酸酯啮齿类动物笼具（45 cm x 24 cm x 20 cm）			建议使用多个笼具，以便同时测试多只小鼠
塑料不透明圆形测试 arena（底面直径 41 cm）	United States Plastic Corp.	13931	建议使用多个 arena，以便同时测试多只小鼠
标准玉米芯啮齿类动物垫料
新物体——红色猴子	Hasbro, Pawtucket RI		来自“猴子桶”（Barrel of Monkeys）
新物体——矩形 2 x 4 LEGO 积木
新物体——拼图块	Thinkfun Inc., Alexandria VA		来自“Toot and Otto”游戏
新物体——标准白色骰子
视频摄像机
行为记录软件——The Observer	Noldus, Wageningen, The Netherlands	也可使用其他程序
视频追踪软件——EthoVision	Noldus, Wageningen, The Netherlands	也可使用其他程序
X-Keys 输入键盘	P.I. Engineering, Williamstown MI	829484
MacroWorks II	P.I. Engineering, Williamstown MI