本文介绍了一种利用1.94 µm连续波激光辐射加热培养皿中细胞的原创实验装置。利用该方法，可研究视网膜色素上皮（RPE）细胞在不同热暴露条件下的生物学反应。
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摘要
摘要
本文介绍了一种使用1.94 µm连续波铥激光对培养细胞进行加热以用于生物学评估的原创方法。铥激光辐射被水强烈吸收，通过热扩散使培养皿底部的细胞受热。一根直径为365 µm的激光光纤被放置在培养皿上方约12 cm处，不使用任何光学元件，使激光光束直径几乎等于培养皿的内径（30 mm）。通过在每次实验中保持培养基体积一致，可实现对细胞施加高度可重复的温度升高。
为校准每个功率设置下单个细胞培养皿内的温度升高及其分布情况，在不同位置及细胞水平上测量了激光照射10秒期间的温度变化。使用数学图形软件对温度分布进行可视化表征，结果显示培养皿中的温度分布呈高斯形式。激光照射后，可开展不同的生物学实验以评估温度依赖性的细胞反应。本文中采用的是活/死染色（即， 引入区分活细胞、凋亡细胞和死细胞的方法，以帮助确定在不同时间点后细胞发生凋亡和死亡的阈值温度。
该方法的优点在于加热温度和时间的精确性，以及其在整块细胞培养皿中对细胞进行加热的高效率。此外，该方法允许在广泛的温度和时间范围内开展研究，并可通过计算机操作系统实现良好的控制。
引言
理解温度依赖性的细胞生物学反应对于成功实施热疗至关重要。在眼科中使用的可见光热激光视网膜光凝治疗是医学领域最成熟的激光治疗手段之一。视网膜激光治疗主要采用绿光至黄光波段的可见光。该光被视网膜色素上皮（RPE）细胞中的黑色素强烈吸收，而RPE细胞构成视网膜最外层的单细胞层。近年来，临床医生和研究人员对极轻微热辐射（即亚可见光凝）作为多种视网膜疾病新型治疗策略的兴趣日益增加1,2。顺应这一趋势，我们的研究关注在精确温度控制下对RPE细胞进行亚致死性加热，该技术称为温度控制光热疗法（TC-PTT）。
我们研究所近期开发的光声技术，可实现对视网膜照射部位温度升高的实时测量，从而在照射过程中对温度升高进行有效控制3然而，由于此前无法测量和控制温度，由RPE细胞亚致死性加热引起的视网膜亚致死性热损伤一直未被重视，因此热激光照射后RPE细胞的温度依赖性细胞反应至今研究甚少。此外，不仅不同温度条件下的差异尚未被深入讨论，亚致死性与致死性照射后存活细胞行为的差异也未得到充分阐明。因此，为了积累基于TC-PTT治疗的科学证据，本研究旨在阐明RPE细胞温度依赖性的生物学反应及其作用机制 体外 实验装置。
为此，有必要建立一种满足以下条件的细胞加热装置：1）能够实现快速升温；2）温度和时间可精确控制；3）适用于生物学实验中相对大量的细胞检测。就加热方法而言，临床激光器（如倍频Nd:YAG激光器，532 nm）并不适合用于细胞培养物的加热。这是因为培养的视网膜色素上皮（RPE）细胞中黑色素体数量显著减少，导致激光光吸收不均匀，即使在相同辐射功率照射下，不同实验间细胞水平的温度升高也存在差异。已有若干先前研究报道在培养皿底部放置黑色纸张以改善这一问题。4 或在实验前由培养细胞吞噬的额外黑色素体的使用5,6许多 体外 利用热板、水浴或CO₂培养箱进行生物学研究以评估热疗诱导的细胞反应2 温度设定的培养箱7。这些方法需要较长的加热时间，因为需要一定时间（即， 数分钟）以达到目标温度。此外，使用这些方法难以获得详细的热历史记录（即， 在细胞层面，温度与时间的乘积（温度×时间）具有重要意义。此外，由于温度扩散的不均匀性，同一培养皿中不同位置的细胞所处的温度可能存在差异。大多数情况下，尽管细胞的生物学反应可能受到升温温度及其持续时间的显著影响，但在进行生物学分析时，热疗过程中的这种时间和空间上的温度信息往往未被充分考虑。
为克服这些问题，本研究采用连续波铥激光对细胞进行加热。铥激光辐射（λ = 1.94 µm）可被水强烈吸收8，因此培养皿底部的细胞仅通过热扩散实现热刺激。直径为365 µm的激光光纤置于培养皿上方约12 cm处，中间无任何光学元件。激光光束发散后的直径在培养基表面几乎等于培养皿的内径（30 mm）。在培养基体积恒定的条件下，可实现细胞照射温度升高过程的高度重复性。通过调节不同的功率设置，最大可实现20 W的照射功率，在10秒内可使细胞层面的培养基温度升高最高达ΔT ≈ 26 °C。
通过调整辐照条件，还可以改变激光束的轮廓，从而改变培养皿中的温度分布。例如，可以采用类似高斯分布的温度分布进行研究（如本研究中所示），也可以采用均匀的温度分布。后者可能更有利于特异性地研究亚致死性温度升高对细胞反应的影响，但不适用于细胞死亡应激或伤口愈合反应的研究。
总之，铥激光辐照可在不同热暴露条件下，用于研究多种生物因素，如基因/蛋白表达、细胞死亡动力学、细胞增殖以及细胞功能发育等。
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方案
1. 视网膜色素上皮细胞培养
- 从猪眼分离视网膜色素上皮细胞
- 从当地屠宰场获取新鲜摘除的猪眼，保持低温（4 °C）并在避光环境中。
- 用剪刀去除眼组织的外部组织，并将眼球置于消毒液中浸泡5分钟。
- 将眼球置于无钙、无镁的灭菌磷酸盐缓冲液（PBS (-)）中，待用。
- 使用手术刀在角膜缘后约5 mm处刺穿巩膜。用剪刀沿与角膜缘平行的方向完全剪切，切除眼球的整个前部。
- 移除眼部的前部结构（即， 角膜和晶状体）以及玻璃体。加入1 mL PBS (-)，轻轻去除神经视网膜。
注意：此“眼杯”（由巩膜、脉络膜和视网膜色素上皮组成）现已准备就绪。 - 加入预热的（37 °C向眼杯中加入 PBS (-) 配制的 0.25% 胰蛋白酶，调整体积使胰蛋白酶溶液约占眼杯容积的 80%。
- 将眼杯与胰蛋白酶溶液在5% CO₂条件下孵育2 孵育箱在 37 °C 10 分钟
- 将眼杯从培养箱中取出，弃去0.25%胰蛋白酶溶液，加入含0.05%胰蛋白酶和0.2%乙二胺四乙酸四钠盐（EDTA·4N）的PBS（-）溶液。将眼杯置于培养箱中孵育45分钟。
注意：45 分钟后，RPE 细胞将仅松散地附着于布鲁赫膜，或已完全脱离并漂浮于胰蛋白酶-EDTA 溶液中。 - 通过轻柔吹打收集RPE细胞。将细胞和溶液收集至含有10 mL培养基（DMEM高糖，含L-谷氨酰胺）的锥形管中，培养基中包含10%猪血清、抗生素/抗真菌剂和丙酮酸钠（1 mM）。
注意：血清可能中和胰蛋白酶的作用。 - 将细胞悬液在室温下以 400 x g 离心 5 分钟。
- 吸除上清液，加入10 mL新鲜培养基。在相同条件下再次离心5分钟。
- 移去上清液并加入新鲜培养基，使细胞浓度达到 5 x 105细胞/mL（通过血细胞计数板计数确定）。轻轻吹打混匀。
- 将细胞悬液分装至细胞培养皿中，每皿（直径60 mm）加入3 mL。
注意：该培养物称为零代培养（P0）。 - 将细胞维持在5% CO₂的环境中2 孵育箱于 37 °C每隔两天将一半的条件培养基更换为新鲜培养基。
- 若细胞长满培养皿，则进行传代培养（步骤 1.2）。
- RPE细胞培养物的传代培养
- 移除培养基，用 PBS (-) 洗涤细胞两次。
- 在5% CO₂培养箱中，用含0.05%胰蛋白酶和0.2% EDTA的PBS(-)溶液孵育细胞2 孵育箱于 37 °C 5 分钟。
- 通过轻柔吹打使RPE细胞脱落，并将细胞悬液收集至含有10 mL培养基（含10%猪血清）的锥形管中。
- 将细胞悬液在室温下以 400 x g 离心 5 分钟。
- 吸除上清液，加入新鲜培养基，调整细胞浓度至 5 x 105 细胞/mL（通过血细胞计数板计数细胞数量确定）。按照步骤1.1.13所述，将细胞接种至新的60 mm培养皿中。
注意：细胞培养现为第1代（P1）。 - 待细胞达到汇合后，使用步骤1.2.1–1.2.5中所述相同方法将P1代细胞传代至P2代。从P2代细胞开始，将细胞接种于较小的培养皿（内径30 mm）中，而非60 mm直径的培养皿。
- 实验请使用第2代或第3代细胞。
2. 铥激光照射
- 辐照装置的构建
- 将一台铥激光器（1.94 µm，功率范围：0–20 W）连接至数值孔径为0.22、纤芯直径为365 µm的光纤。
- 将光纤末端机械固定在金属臂上，该金属臂水平固定于辐照装置的垂直金属支柱上。调整垂直支柱的位置，使激光光纤末端位于加热板上方，细胞培养皿在辐照过程中将放置于该加热板上。
- 在加热板上铺一张白纸，打开瞄准光束（λ = 635 nm，最大功率 = 1 mW，纸面处光束直径 ≈ 30 mm）。在白纸上标记出瞄准光束的轮廓，以确定辐照时培养皿的放置位置。
注：光纤末端的z平面位置可能可调。在不附加成像光学元件的情况下，当细胞培养平面位于光纤末端下方12 cm处时，激光光斑直径约为30 mm，几乎等于细胞培养皿的内径。装置示意图见图1。
图1：铥激光照射系统的示意图。 将培养皿放置在加热板上。细胞位于铥激光光纤尖端下方12 cm处，使激光光斑大小几乎与培养皿内径相同（约30 mm）。激光照射程序由自行设计的系统平台通过时间控制程序进行调控。在启动照射程序前，必须预先设定激光功率。 请点击此处查看该图的放大版本。
- 细胞培养的激光照射
- 照射前1 h，将培养基完全更换为1.2 mL新鲜培养基。
注意：此为关键步骤，必须严格遵守。 - 将辐照站（即， 热板和用于固定激光光纤的支架）置于洁净工作台上。
- 将细胞培养皿从培养箱中取出，放置在加热板上标记的位置（步骤 2.1.3）。
- 佩戴护目镜。打开铥激光器。根据需要在激光设备上设置功率（可调范围为 0 - 20 W）。开启激光发射。
- 启动一个系统设计平台，用于控制激光照射及时间程序（补充文件）。
- 将培养皿放置于加热板上后，立即点击“预热时间”以启动140秒的计时（“预热时间1”）；此操作可使培养基温度保持在 37 °C 照射前
注意：预热140秒后，蜂鸣声将响起，下一个计时器（“预热时间2”）将自动开始计时8秒。在此8秒期间，操作者可打开培养皿。预热148秒后，将自动对细胞培养物进行持续10秒的激光照射。在紧急情况下，激光设备应配备强制终止按钮，以便立即停止激光。此为关键步骤，必须严格遵守。需特别注意的是，在8秒预热时间开始时、即照射前立即打开培养皿盖的操作。打开皿盖可能导致培养基表面迅速降温。 - 辐照后，立即将盖子放回培养皿上，将培养皿继续留在加热板上 7 秒，然后放回 5% CO₂ 培养箱中2 孵育箱于 37 °C.
- 照射前1 h，将培养基完全更换为1.2 mL新鲜培养基。
- 细胞水平温度分布的测量（温度校准）
- 制作小孔（约 300 µm 直径）靠近底部四侧（每个 90°直径为30 mm的培养皿（无细胞）；使用经本生灯加热的20G针尖。从外部用电气绝缘胶带密封孔洞，并用细针刺一个小孔，仅能插入细小的热电偶（200 µm 直径）可在密封条件下通过此孔插入。
- 在培养皿底部外侧，画出两条相互垂直的直径，并标记其交点（即， 以底部中心为坐标原点（0），从该点开始沿径向向外每隔3 mm标记一次，直至培养皿边缘即， 0、3、6、9、12 和 15 mm）沿各条线在每个方向上图2，蓝色圆点）；点的总数应为21个。
- 向细胞培养皿中加入 1.2 mL 新鲜培养基。将培养皿放置于加热板上 37 °C，插入一根细小的热电偶（200 µm 将直径为 [具体数值] 的探头插入侧孔，并将其敏感端置于待测的标记位置。
- 佩戴护目镜。打开铥激光器，并手动设置激光设备的功率（在0至20 W之间，以0.1 W为增量）。
注意：进行温度校准时，以3 W为增量进行功率测量即可满足要求。 - 打开系统设计平台，点击“开始温度采集”按钮（补充文件），以启动温度测量。
- 执行与步骤 2.2.6 相同的操作。
注意：控制程序每100 ms测量一次插入的热电偶温度，并在图形用户界面（GUI）中显示辐照过程中的温度变化。 - 对全部21个测量点及不同功率设置执行上述操作。针对所有测量点和所有功率设置，重复整个操作流程三次，以获得可靠的数据。
- 将温度数据导出为 csv 格式，以便最终转换为电子表格。对每个位置的三次重复测量在辐照结束时的最高温度取平均值。对同一圆周上各点的数值取平均值（除中心点外，每圈共 4 个点）。
- 将获得的平均最高温度绘制成图，以培养皿中心的距离（mm）为横轴，温度升高值（ΔT， °C以y轴表示。使用数学软件程序的拟合功能，将高斯模型拟合到原始数据上，生成高斯拟合的温度分布。
图2：一个细胞培养皿中的温度校准测量点。 温度数据在中心点以及5个不同半径位置、4个不同角度方向上进行测量（蓝色圆点）。请点击此处查看该图的放大版本。
3. 不同热辐射后细胞反应的生物学评估
- 不同功率设置下细胞活力（即 活细胞、凋亡细胞和死亡细胞）的评估及细胞死亡阈值的确定
- 在指定时间点（即 照射后 3、24 和 48 小时），用 PBS (-) 洗涤细胞，并根据制造商说明书使用 commercially available kit 检测细胞活力（即 活细胞、凋亡细胞、死亡细胞）。
- 在 100 µL 1x 结合缓冲液（均为试剂盒组分）中加入 5 µL 异硫氰酸荧光素（FITC）-Annexin V、5 µL 碘化乙啶同源二聚体 III（ethidium homodimer III）和 5 µL Hoechst 33342，配制染色液。配制足够覆盖细胞的染色液体积。将细胞孵育 15 分钟。
- 用结合缓冲液洗涤细胞培养物两次，更换为 PBS (-)，并将培养物置于荧光显微镜载物台上。
- 切换光路至目镜，选择 4',6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）滤光片，打开照明光源，使用 4x 物镜找到清晰焦平面。
- 将光路切换至相机，在显微成像软件的计算机屏幕上观察图像，并调节焦距。
- 使用显微镜专用软件的拼接功能（即 记录培养皿多个区域图像并生成单张大图的功能），获取整个细胞培养皿的荧光图像。分别使用三种不同的滤光片组——DAPI、FITC 和四甲基罗丹明（TRITC）——对 Hoechst 33342 阳性细胞（所有细胞核）、FITC-Annexin V 阳性细胞（凋亡细胞）和 ethidium homodimer III 阳性细胞（死亡细胞）进行成像。
- 测量染色细胞培养物中死亡区域（ethidium homodimer III 阳性）的半径（mm），以及凋亡带状区域（annexin V 阳性）的外半径和内半径。将这些半径值代入对应功率设置下温度分布的拟合高斯函数中，计算死亡或凋亡区域边缘的精确温度，以明确细胞死亡和凋亡转变的阈值温度。
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结果
不同功率设置后的温度分布
在温度校准过程中，监测了每次单独辐照的所有温度变化。根据这些数据，获得测量点的最高温度，并将其定义为 Tmax (°C)。如图3A所示，当培养皿放置在加热板上时，程序即开始运行。在需要使培养基温度稳定在 37 °C 的 140 秒“预热时间1”之后，进入持续 8 秒的“预热时间2”，在此期间移除培养皿盖。在“预热时间2”结束时，激光发射自动开始。该曲线代表了持续 10 秒辐照的典型温度变化过程。在辐照期间，温度上升；激光发射关闭后，温度立即开始下降。本研究中将培养皿中心点的最高温度定义为 Tmax (°C)。Tmax 与激光功率成正比（图3B）。图3C展示了不同功率下培养皿内最高温度的分布情...
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讨论
在讨论与温度相关的生物细胞反应时，不仅温度本身，而且温度升高的持续时间也十分重要，因为大多数生化过程都具有时间依赖性。尤其在眼科领域的激光诱导热疗中，由于作用时间极短——从毫秒到秒量级——在精确控温条件下研究细胞的热效应十分困难。因此，亟需一种适用于细胞培养模型、并配备能够严格控制温度和时间的操作系统的激光照射装置。对热刺激后细胞反应（如蛋白质表达或分泌）进行生物学评估时，需要对足够数量的受影响细胞进行重复的定量分析。而临床治疗中常用的直径达数百微米的激光光斑，给此类研究带来了障碍，因为在单个激光照射区域进行定量分析工作量极大。本研究尽可能地尝试满足上述需求。通过使用波长为1.94 µm的连续波铥激光器，并结合照射控制程序，可在短时间内对整个细胞培养体系实现可控的温度上升。由于通过调节光路可调整温度分布，因此该装置可用于开展多种类型的与热疗相关的实验。
本技术的局限性在于无法在激光照射细胞的同时进行温度测量。由于热电偶不适用于无菌的细胞培养环境，温度校准必须在细胞照射之外单独进行。考虑到激光输出功率可能存在波动，若能在每次激光照射过程中实时测量温度，将有助于直接评估与热剂量相对应的...
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
本研究得到了德国联邦教育与研究部（BMBF）（资助号 #13GW0043C）以及欧洲航空航天研究与发展办公室（EOARD，资助号 # FA9550-15-1-0443）的研究资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| <强>试剂 | |||
| 杜尔贝科’s 改良伊格尔’s 中等-高葡萄糖培养基 | Sigma-Aldrich | D5796-500ML | 使用前添加（2）-（4），37℃温育 °使用前将水浴箱预热至 C。 |
| 抗生素-抗真菌溶液（100 ×) | Sigma-Aldrich | A5955-100ML | 含有10,000单位青霉素、10 mg链霉素和25 μg 两性霉素B溶于1 mL。使用前，在500 mL培养基瓶（1）中加入5.5 mL。 |
| 丙酮酸钠（100 mM） | Sigma-Aldrich | S8636-100ML | 使用前向500 mL培养基瓶（1）中加入5.5 mL（终浓度：1 mM） |
| 猪血清 | Sigma-Aldrich | 12736C-500ML | 使用前在500 mL培养基瓶中加入50 mL（1）（终浓度：10%） |
| 磷酸盐缓冲液（PBS） | Sigma-Aldrich | D8537-500ML | |
| 猪胰蛋白酶 | Sigma-Aldrich | T4799-25G | |
| 乙二胺四乙酸（EDTA） | Sigma-Aldrich | ED-100G | |
| 人VEGF Quantikine ELISA试剂盒 | R&D 系统 | DVE00 | |
| Oxiselect 总谷胱甘肽检测试剂盒 | Cell Biolabs, Inc | STA-312 | |
| 凋亡/坏死/健康细胞检测试剂盒 | PromoKine | PK-CA707-30018 | |
| <强>名称 | <强>公司 | <强>货号 | <强>评论 |
| <强>设备 | |||
| 铥激光 | Starmedtec GmbH | 原型 | 0-20 W |
| 365 mm 芯径光纤 | LASER COMPONENTS 德国 | CF01493-52 | |
| 热电偶 | Omega Engineering Inc | HYP-0-33-1-T-G-60-SMPW-M | |
| 加热板 | MEDAX | ||
| 酶标仪（荧光分光光度计） | 分子装置 | Spectramax M4 | |
| 细胞匀浆器 | QIAGEN | TissueLyser LT | |
| 荧光显微镜 | 尼康 | ECLIPSE Ti | |
| 数学软件程序 | The Mathworks. Inc | MATLAB R2015b 版本 | |
| 系统设计平台 | 国家仪器公司 | Labview | 实验室虚拟仪器工程工作台 |
参考文献
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