微流控缓冲液更换为无干扰微/纳米颗粒细胞工程

Summary

这个协议描述了使用惯性基于微流体缓冲交换策略的纯化微/纳米工程细胞与未结合的颗粒的有效消耗。

Abstract

与活性成分载微/纳米工程细胞（NPS）正在成为一个日益流行的方法，以提高本地治疗特性，使生物成像和控制细胞表型。一个关键尚未充分解决的问题是，仍无法通过常规的离心容易地除去细胞标记后未结合颗粒的显著数目。这导致增加的生物成像的背景噪声，并且可以赋予变革效应到相邻的非靶细胞。在这个协议中，我们提出称为院长流分离（DFF）惯性微流体为基础的缓冲区交换策略，以高通量的方式免费纳米粒子标记细胞有效地分离。发达螺旋微型装置便于悬浮在新的缓冲溶液纯化的细胞（THP-1和干细胞）的连续集合（> 90％细胞回收），同时实现未结合的荧光染料或染料加载纳米粒（SIL的> 95％的耗尽ICA或PLGA）。这个单步，基于大小的细胞纯化策略使高细胞处理吞吐量（10 ^6个细胞/分），并且是微/纳米工程细胞大容积细胞纯化以实现无干扰的临床应用是非常有用的。

Introduction

由代理加载微/纳米颗粒（纳米颗粒）的工程细胞是一种简单的，基因组整合-自由，和通用的方法，以提高生物成像能力和增加/再生医学补充其天然的治疗性质^。1-3蜂窝修改都通过标记所获得的质膜或细胞质剂加载纳米粒的过量浓度以饱和结合位点。然而，这种方法的主要缺点是留在溶液中后细胞标记过程未结合颗粒的显著数量时，其可以潜在地混淆颗粒工程细胞的精确识别或^4,5-复杂化的治疗效果。此外，接触含变革纳米粒在浓度过高剂（生长因子，皮质类固醇等 ）可导致细胞毒性和误导暴露可引起对非靶细胞意想不到的后果。甚至包括o颗粒载体F"生物相容性"的材料[ 例如 ，聚（乳酸共乙醇酸），PLGA]可以煽动在某些条件下，以及有效的免疫细胞反应^。6这与免疫功能受损（ 例如 ，类风湿性关节炎），其潜在的延迟个体特别危险全身纳米间隙^。7因此，现有的引入颗粒的工程细胞的高效去除游离颗粒是非常重要的，以减少毒性和降低误导暴露于体内剂加载颗粒。

常规梯度离心常被用来改造的细胞从游离颗粒中分离，但是费力的和在批处理模式操作。此外，通过高速离心期间细胞和密度梯度介质可能损害细胞的完整性和/或影响细胞行为的组分经历剪切应力^。8微流体是与SEV一个有吸引力的替代方案ERAL分离技术，包括确定性的横向位移^{（DLD）9，dieletrophores....}

Protocol

间充质干细胞和单核细胞的纳米1.（NPS）标签

1. 在Dulbecco改良的Eagle培养基（DMEM）培养间充质干细胞（MSCs）补充有10％胎牛血清（FBS）和抗生素，以≥80％汇合标记之前。类似地，培养的THP-1细胞（ATCC）在罗斯韦尔园区纪念研究所（RPMI）1640培养基中补充有10％FBS的至〜10 ^6个细胞/ ml的密度。
2. 负载二氧化硅纳米粒子（〜500微米）用搅拌一夜钙黄绿素染料溶液（200微米）。制造使用前述协议PLGA-AM钙黄绿素^{（CAM）。22}
   1. 溶解250微克的CAM和100mg PLGA（50:50）的氯仿，在4℃。
   2. 生成在室温下使用高速均化器（13600 XG，60秒）的单乳剂纳米粒。使用离心分离（3400×g离心5分钟），洗涤（双分销商蒸发在收集之前的化学罩（≥3小时）的氯仿LLED水），冷冻干燥和储存于-20℃。
3. 孵育CAM-PLGA纳米颗粒（1毫克），或钙黄绿素的二氧化硅纳米粒子（150微克）在0.01％聚-L-赖氨酸（PLL），在室温下溶液15 - 20分钟。
4. 离心机在3400×g离心5分钟以在1毫升各自培养基的纳米颗粒再悬浮之前除去过量的PLL上清液。
5. 孵育细胞（MSC或THP-1，〜1 - 2×10 ^6个细胞在总）的纳米颗粒约24小时（0.1毫克·毫升^-1贴标....

Results

标记与生物显像剂装载纳米粒过夜细胞后，将标记的细胞（含有自由粒子）收获并通过DFF螺旋微型纯化以除去游离的NP在单一步骤的过程（ 图1A）。该2入口，2出口螺旋微通道是由工程软件设计和使用微制造SU-8光刻胶。然后将图案化的硅晶片被用作用于使用软光刻技术（ 图1B）的PDMS复制品成型的模板。来执行细胞分选，而内壁入口运行在一个较高的流速（1:10）的新鲜缓冲溶液捏细胞样品流动细胞样品泵入螺旋微型装置的外壁的入口。分离是通过惯性聚焦较大标记的细胞在内壁和朝向外壁（ 图2A）小未结合的纳米粒子的迪安-引起的回流来实现。该器件是第一APPLI编辑从装有荧光钙黄绿素纳米颗粒二氧化硅悬浮标记细胞的单核细胞（THP-1）进行排序（〜大小500纳米）。通过高速摄像（ 图2A），为确认和流式细胞术分析（ 图2B），获得较高的分离效率。从设备细胞出口收集洗脱液的图像还表明有效地除去二氧化硅和PLGA纳米颗粒 - 从THP.......

Discussion

本文所描述的DFF细胞纯化技术使以高通量的方式标记的细胞的快速和连续分离。这种分离方法非常适合于大样本容量或高浓度的细胞样本处理，比传统的基于膜过滤是容易长时间使用后堵塞更好。同样，基于亲和力的磁选需要这是费力又昂贵的附加细胞标记的步骤。纯化的细胞被示为在通道内保持它们的标记，由于停留时间短剂和细胞形态以及（ 图3）以最小流量/剪切诱导的作用（剪切应力τ，〜200-250达因/厘米^2）（< 1秒^）20,24。此外，用户可以通过简单地代与所需介质或缓冲溶液鞘缓冲液（盐水）选择排序标记的细胞的洗脱溶液中。

这是至关重要的有一个在微通道之前使用它可以细胞集中行为产生不利的影响没有灰尘或碎屑。这可以通过彻底用IPA清洗入口孔，以及使用掩蔽胶带清洁等离子体接合之前与PDMS表面来实现。由于微型高流量条件下运行（〜1 - 1.5毫升/分钟），它也是重要的加热在电炉上键合的PDMS装置，确保与PDMS和载玻片之间的强粘接。在器件操作中，如果细胞不聚焦良好，这意味着流率是不充分的。人们可以通过检查设备的入口区域.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
细胞系 &培养基
间充质干细胞 （MSCs）	Lonza	PT-2501
Dulbecco's 修改后的鹰's 培养基 （DMEM）	Lonza	12-614F
胎牛血清 （FBS）	Gibco	10270-106
THP-1 单核细胞 （THP-1）	ATCC	TIB-202
罗斯威尔公园纪念研究所 （RPMI） 1640 培养基	Lonza	12-702F
试剂 &材料
0.01% 聚-L-赖氨酸 （PLL）	Sigma-Aldrich	P8920
3 ml 注射器	BD	302113	注射器 3 ml Luer-Lock
60 ml 注射器	BD	309653	注射器 60 ml Luer-Lock
牛血清白蛋白 （BSA）	Biowest	P6154-100GR
钙黄绿素，AM （CAM）	生命科技	C1430
钙黄绿素	Sigma-Aldrich	C0875
异丙醇	Fisher Chemical	#P/7507/17	HPLC 2.5 L
磷酸盐缓冲盐水 （PBS）	Lonza	17-516Q/12
普通显微镜载玻片	Fisher Scientific	FIS#12-550D	75 x 25 x 1 mm3
聚二甲基硅氧烷 （PDMS）	道康宁	SYLGARD® 184
胶带	3M	21200702044	18毫米x 25
硅胶NPs （∼200 亩;m）	Sigma-Aldrich	748161	孔径 4 nm
注射器尖端	JEC 技术	7018302	23 G 0.013 x 0.25
胰蛋白酶-EDTA （0.25%）	Life Technologies	25200-056
Tygon 管	Spectra-Teknik	06419-01	0.02 x 0.06" 100
聚（D，L-丙交酯-乙交酯共聚物） （PLGA;50：50）	Sigma-Aldrich	P2191
<强>设备
活检打孔器	Harris Uni-Core	69036-15	1.50 毫米
Dessicator	Scienceware	111/4 英寸 OD
高速摄像机	幻影	V9.1
倒置相差显微镜	尼康	Eclipse Ti
等离子清洗机	Harrick Plasma	PDC-002
注射泵	Chemyx	CX Fusion 200