本方案描述了一种基于惯性微流控的缓冲液置换策略，用于纯化经微/纳米颗粒工程化的细胞，并高效去除未结合的颗粒。
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摘要
摘要
利用负载活性成分的微/纳米颗粒（NPs）对细胞进行工程化改造，正成为增强细胞固有治疗特性、实现生物成像及调控细胞表型的一种日益流行的方法。一个关键但尚未充分解决的问题是，在细胞标记后仍有大量颗粒未结合，而这些颗粒难以通过常规离心法有效去除。这会导致生物成像背景噪声增加，并可能对邻近的非靶向细胞产生转化效应。在本实验方案中，我们介绍一种基于惯性微流控的缓冲液置换策略，称为迪恩流分馏（Dean Flow Fractionation, DFF），可高效、高通量地将标记细胞与游离NPs分离。所开发的螺旋微流控装置能够连续收集悬浮于新缓冲液中的纯化细胞（THP-1 和 MSCs），细胞回收率超过>90%，同时实现对未结合的荧光染料或载染料NPs（二氧化硅或PLGA）超过>95%的去除。这种一步式、基于尺寸的细胞纯化策略具有高细胞处理通量（106 个细胞/分钟），在大体积微/纳米颗粒工程化细胞的纯化中具有重要应用价值，有助于实现无干扰的临床应用。
引言
利用载剂微/纳米颗粒（NPs）对细胞进行工程化改造是一种简单、无需基因组整合且具有高度通用性的方法，可增强生物成像能力，并在再生医学中增强或补充细胞固有的治疗特性。1-3 通过使用负载试剂的纳米颗粒（NPs）以过量浓度标记细胞质膜或细胞质，可实现细胞修饰，从而饱和结合位点。然而，该方法的主要缺点是在细胞标记过程后，溶液中仍残留大量未结合的颗粒，这些游离颗粒可能干扰对颗粒工程化细胞的精确定位，或使治疗结果复杂化。4,5 此外，暴露于含有转化因子（生长因子、皮质类固醇）的纳米颗粒 等等。浓度过高时可能引起细胞毒性，而非靶向暴露可能对非靶细胞产生 unintended 后果。即使是颗粒载体，若由 "生物相容性" 材料例如，聚乳酸-羟基乙酸共聚物（PLGA）在特定条件下也能引发强烈的免疫细胞反应。6 这对于免疫功能受损的个体尤其危险（例如，类风湿关节炎）可能会延缓纳米颗粒的全身清除。7 因此，在引入颗粒工程化细胞之前，有效去除游离颗粒对于最小化毒性特征并减少载药颗粒的非靶向暴露至关重要。 体内.
传统的梯度离心法常用于将工程化细胞与游离颗粒分离，但该方法操作繁琐且为批次式运行。此外，细胞在高速离心过程中所经历的剪切应力以及密度梯度介质的组分可能破坏细胞完整性或影响细胞行为。8 微流控技术是一种具有吸引力的替代方案，已发展出多种分离技术，包括确定性侧向位移（DLD）9、介电泳10,11和声泳12，适用于小颗粒分离及缓冲液置换应用。然而，这些方法通量较低（1–10 µl·min−1），且容易发生堵塞问题。基于介电泳等主动分离方法还要求细胞在固有介电泳表型上存在差异，或需额外的细胞标记步骤才能实现分离。一种更具前景的方法是惯性微流控技术——在高雷诺数（Re）条件下，由于主导的升力（FL）作用，颗粒或细胞在流线间发生横向迁移，并聚焦于特定位置。13 由于其高流速条件和优异的尺寸分辨能力，该技术常被用于基于尺寸的细胞分离14,15以及缓冲液置换应用16–18。然而，缓冲液置换效率仍然较差，残留的原始溶液污染通常达∼10–30%，因为分离后的细胞通常仍靠近原始缓冲液与新缓冲液之间的界面。16–18 更重要的是，目标细胞的尺寸分布必须较为均一，才能实现从原始缓冲液中精确的惯性聚焦与分离，这在处理如间充质干细胞（MSCs）等尺寸异质性较高的细胞类型时尤为困难。19
我们先前开发了一种新的惯性微流控细胞分选技术，称为迪恩流分馏（Dean Flow Fractionation, DFF），用于从全血中分离循环肿瘤细胞（CTCs）20 和细菌21，该技术采用具有两个入口和两个出口的螺旋微通道装置。在本视频方案中，我们将描述使用负载钙黄绿素的纳米颗粒（NPs）标记THP-1（人急性单核细胞白血病细胞系）悬浮单核细胞（约15 µm）以及间充质干细胞（MSCs，10–30 µm）的过程，随后介绍DFF螺旋微流控装置的制备与操作，以高效回收标记细胞并去除未结合的纳米颗粒22。这种单步纯化策略能够在无需离心的情况下，连续地从新鲜缓冲液中回收标记的悬浮细胞和贴壁细胞。此外，该方法可处理高达10×10⁶ 个细胞·ml−1 的细胞密度，适用于再生医学应用。
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方案
1. 间充质干细胞和单核细胞的纳米颗粒（NPs）标记
- 在标记前，将间充质干细胞（MSCs）在添加了10%胎牛血清（FBS）和抗生素的杜尔贝科改良伊格尔培养基（DMEM）中培养至≥80%融合度。同样，将THP-1细胞（ATCC）在添加了10% FBS的罗斯韦尔帕克纪念研究所（RPMI）1640培养基中培养至密度约为~106 个细胞/ml。
- 使用200 µM的钙黄绿素染料溶液对二氧化硅纳米颗粒（NPs）（~500 µm）进行负载，并在4 °C下搅拌过夜。采用先前报道的方法22制备包载钙黄绿素的PLGA微球（CAM）。
- 在4 °C下，将250 µg CAM和100 mg PLGA（50:50）溶解于氯仿中。
- 在室温下，使用高速匀浆机（13,600 × g，60秒）生成单乳液纳米颗粒。在化学通风橱中蒸发氯仿（≥3小时），然后通过离心（3,400 × g，5分钟）收集颗粒，用双蒸水洗涤，冷冻干燥后储存于-20 °C。
- 将CAM-PLGA纳米颗粒（1 mg）或钙黄绿素标记的二氧化硅纳米颗粒（150 µg）在0.01%聚-L-赖氨酸（PLL）溶液中室温孵育15–20分钟。
- 以3,400 × g离心5分钟，去除多余的PLL上清液，随后将纳米颗粒重悬于1 ml相应的培养基中。
- 将纳米颗粒与细胞（MSCs或THP-1，总计~1–2 × 106 个细胞）在0.1 mg·ml−1的标记浓度下共孵育约24小时。
- 使用2 ml 0.25%胰蛋白酶（37 °C，5分钟）消化并收集标记后的贴壁MSCs，加入6 ml DMEM终止反应。以1,000 × g离心4分钟沉淀细胞，重悬至浓度为105–106 个细胞/ml，用于微流控处理。标记后的THP-1细胞（105–106 个细胞/ml）可直接用于微流控纯化。
2. 微流控装置制备
- 装置制备
- 使用商用试剂盒中的聚二甲基硅氧烷（PDMS），通过标准软光刻步骤制备微流控螺旋装置（500 µm（宽）× 115 µm（高））23。
- 在称量皿中将30 g基础预聚物与3 g固化剂充分混合。将混合物置于干燥器中脱气60分钟，以去除所有气泡。
- 小心地将PDMS混合物倒入带有螺旋通道设计图案的硅晶片母模上，高度约为5–10 mm。
- 再次将混合物置于干燥器真空环境中脱气60分钟，以去除任何残留气泡。重复此过程，直至所有气泡完全消除。
- 将PDMS混合物置于80 °C烘箱中固化2小时，直至PDMS完全固化。确保在固化过程中晶片不倾斜，以保证装置高度均匀。
- 使用手术刀切割出PDMS螺旋装置，并小心地将PDMS块从母模上剥离。
- 用手术刀修整装置边缘，确保表面平整，便于后续键合。
- 使用1.5 mm活检打孔器在PDMS装置上打两个1.5 mm的孔作为入口，另打两个1.5 mm的孔作为出口。
- 用异丙醇（IPA）清洗装置以去除碎屑，并将装置置于80 °C烘箱中干燥5分钟。
- 使用遮蔽胶带清洁PDMS装置的底面（带通道结构的一面）。
- 使用遮蔽胶带清洁一张载玻片（2" × 3"）的一侧表面。
- 小心地将清洁后的PDMS装置和载玻片表面放入等离子清洗仪腔室内，抽真空60秒。然后打开等离子电源至最大，并降低腔室压力，直至腔室呈现粉红色。
- 使表面暴露于空气等离子体中60秒。等离子体在PDMS和玻璃暴露表面产生反应性物质，当两者接触时可实现牢固键合。关闭等离子电源，并释放等离子清洗仪内的压力，取出装置和载玻片。
- 通过压紧经等离子处理的PDMS装置与载玻片表面，实现两者键合，确保两表面之间无气泡夹杂。
- 将键合后的装置置于设定为80 °C的加热板上加热2小时，以增强键合强度。
- 装置操作
- 剪取两段长约15–20 cm、外径为1.52 mm的管路用于进样端注射器，并在每段管路一端连接一个23号规格的注射器接头。
- 剪取两段长约5–10 cm、外径为1.52 mm的管路用于出口端，并将其连接至PDMS装置的出口孔。
- 在样品运行前，使用装有70%乙醇的注射器手动预冲装置，直至液体从出口管路流出。让乙醇在装置中停留30秒至1分钟，以实现装置灭菌。
- 将30 ml经过滤（0.2 µm孔径）的鞘液缓冲液（含0.1%牛血清白蛋白（BSA）的磷酸盐缓冲液（PBS））装入60 ml注射器中，并将注射器固定在注射泵上。设置泵参数（注射器尺寸：60 ml，体积：60,000 µl）。
注：在PBS中添加BSA是为了最小化细胞间粘附以及细胞与PDMS装置之间的非特异性结合。 - 将3 ml标记后的细胞装入3 ml注射器中，并将注射器固定在另一台注射泵上。设置泵参数（注射器尺寸：3 ml，体积：3,000 µl）。
- 检查注射器中是否残留气泡，以确保流体流动稳定。通过轻轻推出喷嘴处几滴液体来排除任何气泡。
- 将进样端注射器接头和管路连接至注射器，并插入装置相应的入口（鞘液入口和样品入口）。确保管路中无气泡存在。
- 将装置安装在倒置相差显微镜上，以便在细胞分选过程中进行实时成像。
- 使用粘合剂将一个小废液杯和两个15 ml离心管固定在显微镜载物台上靠近装置的位置。
- 将出口管路放入废液杯中。
- 设置样品与鞘液缓冲液的流速比为1:10，并启动两台注射泵以开始分选过程（示例：样品注射器流速为120 µl/min，鞘液注射器流速为1,200 µl/min；通道流速约为0.38 m/sec）。
- 运行装置1.5分钟，使流速达到稳定。可通过高速相机（约5,000–10,000帧每秒（fps），曝光时间：10–50 µsec）在明场加相差条件下观察通道内壁附近是否存在惯性聚焦的细胞来确认流速稳定。
- 将出口管路分别置于不同离心管中，以分别收集来自细胞出口和废液出口的洗脱液。
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结果
将细胞与负载生物成像剂的纳米颗粒（NPs）共同孵育过夜后，收集标记后的细胞（含游离颗粒），并通过DFF螺旋微流控装置进行单步纯化，以去除游离的NPs（图1A）。该微流控芯片采用工程软件设计，具有双入口、双出口的螺旋微通道结构，并使用SU-8光刻胶通过微加工技术制备。将图案化的硅片作为模板，利用软光刻技术对聚二甲基硅氧烷（PDMS）进行复制 molding（图1B）。进行细胞分选时，将细胞样品泵入螺旋微流控装置的外壁入口，同时以更高的流速（1:10）将新鲜缓冲液通入内壁入口，以压缩细胞样品流。通过较大的标记细胞在内壁处的惯性聚焦，以及小尺寸未结合NPs在Dean涡作用下向外壁再循环，实现分离（图2A）。该装置首先用于从负载钙黄素（calcein）的荧光二氧化硅NPs（粒径约500 nm）中分离标记的悬浮单核细胞（THP-1）。高速成像（图2A）和流式细胞术分析（图2B）结果均证实获得了较高的分离效率。从装置...
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讨论
本文所述的 DFF 细胞纯化技术能够以高通量的方式快速、连续地分离标记细胞。该分离方法适用于大样本体积或高细胞浓度样本的处理，优于传统的基于膜的过滤技术，后者在长时间使用后容易发生堵塞。类似地，基于亲和性的磁性分离需要额外的细胞标记步骤，操作繁琐且成本较高。由于细胞在通道内的停留时间短（< 1 秒），纯化后的细胞能够很好地保持其标记物和细胞形态（图 3），并几乎不受流动/剪切力引起的效应影响（剪切应力 τ，约 200–250 dyne/cm2）20,24。此外，用户可通过将鞘液缓冲液（生理盐水）替换为所需的培养基或缓冲溶液，自由选择被分选标记细胞的洗脱溶液。
使用前必须确保微通道内无任何灰尘或碎屑，否则可能对细胞聚焦行为产生不利影响。可通过异丙醇彻底清洗进样孔，并在等离子体键合前使用遮蔽胶带清洁PDMS表面，以实现这一目的。由于微流控装置在高流速条件下运行（约1 - 1.5 ml/min），因此在键合后还需将PDMS器件置于加热板上加热，以确保PDMS与玻片之间形成牢固的键合。在装置运行过程中，若...
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
衷心感谢南洋理工大学化学与生物医学工程学院的 Mark Chong 博士惠赠 THP-1 细胞，以及 Yuejun Kang 博士和 Nishanth V. Menon 博士在微加工技术方面的协助。本项目由南洋理工大学-西北大学纳米医学研究所（Nanyang Technological University）提供经费支持。H.W.H. 受李光前医学院（LKCMedicine）博士后奖学金资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| <强>细胞系 &和培养基 | |||
| 间充质干细胞（MSCs） | Lonza | PT-2501 | |
| 杜尔贝科’s 改良的 Eagle’s 培养基（DMEM） | Lonza | 12-614F | |
| 胎牛血清（FBS） | Gibco | 10270-106 | |
| THP-1 单核细胞（THP-1） | ATCC | TIB-202 | |
| Roswell Park Memorial Institute（RPMI）1640 培养基 | Lonza | 12-702F | |
| <强>试剂 &材料与试剂 | |||
| 0.01% 多聚-L-赖氨酸（PLL） | Sigma-Aldrich | P8920 | |
| 3 ml 注射器 | BD | 302113 | 3 ml 鲁尔锁注射器 |
| 60 ml 注射器 | BD | 309653 | 60 ml 鲁尔锁注射器 |
| 牛血清白蛋白（BSA） | Biowest | P6154-100GR | |
| 钙黄绿素AM（Calcein, AM，简称CAM） | Life Technologies | C1430 | |
| 钙黄绿素 | Sigma-Aldrich | C0875 | |
| 异丙醇 | Fisher Chemical | #P/7507/17 | HPLC 级 2.5 L |
| 磷酸盐缓冲液（PBS） | Lonza | 17-516Q/12 | |
| 普通载玻片 | Fisher Scientific | FIS#12-550D | 75 x 25 x 1 毫米3 |
| 聚二甲基硅氧烷（PDMS） | 道康宁 | SYLGARD® 184 | |
| 透明胶带 | 3M | 21200702044 | 18 mm x 25 m |
| 二氧化硅纳米颗粒（Silica NPs）∼200 μm) | Sigma-Aldrich | 748161 | 孔径 4 nm |
| 注射器针头 | JEC 技术 | 7018302 | 23 G 0.013 x 0.25 |
| 0.25% 胰蛋白酶-EDTA | Life Technologies | 25200-056 | |
| Tygon 管 | Spectra-Teknik | 06419-01 | 0.02 × 0.06" 100 |
| 聚(D,L-丙交酯-共-乙交酯)（PLGA；50:50） | Sigma-Aldrich | P2191 | |
| <强>仪器设备 | |||
| 活检穿孔器 | Harris Uni-Core | 69036-15 | 1.50 mm |
| 干燥器 | 科学工具软件 | 111/4 OD | |
| 高速相机 | 幻影 | V9.1 | |
| 倒置相差显微镜 | 尼康 | Eclipse Ti | |
| 等离子清洗机 | Harrick Plasma | PDC-002 | |
| 注射泵 | Chemyx | CX Fusion 200 |
参考文献
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