胰腺癌荧光原位小鼠模型

摘要

本文介绍了一种将表达绿色荧光蛋白的胰腺癌细胞（PANC-1 GFP）原位植入Balb-c Ola Hsd-Fox1nu小鼠胰腺以评估肿瘤进展和转移的实验方法。

摘要

胰腺癌仍是近几十年来生存率未显著改善的癌症之一。仅有7%的患者在确诊后存活超过五年。为了理解并模拟胰腺肿瘤的微环境，我们采用了一种小鼠原位胰腺癌模型，可实现对肿瘤进展的无创实时成像。表达绿色荧光蛋白的胰腺癌细胞（PANC-1 GFP）被悬浮于基底膜基质（高浓度）中，（例如，Matrigel HC）与无血清培养基混合后，通过开腹手术注入胰腺尾部。高浓度基底膜基质中的细胞悬液在达到室温时会转变为凝胶状物质；因此，当其接触胰腺组织时即发生凝胶化，在注射部位形成密封，防止细胞外漏。通过活体动物荧光成像监测肿瘤生长及其他器官的转移情况。使用适合GFP激发和发射的滤光片至关重要。本文详细描述了原位移植的各个步骤，以便研究人员能够在裸鼠中轻松重复该操作。本方案的主要步骤包括细胞悬液制备、手术移植及全身荧光成像 体内 成像。该原位模型旨在研究新型治疗药物对原发性和转移性肿瘤的疗效。

引言

胰腺癌的诊断频率相比其他癌症更高，是第4^th 美国癌症相关死亡的主要原因。从诊断时起，超过90%的患者在五年内死亡 ^1,2目前，手术切除肿瘤是治愈胰腺癌的唯一方法，但仅有不到20%的患者适合接受手术，主要原因是在确诊时疾病已处于晚期并发生转移 ^3,4缺乏特异性症状使得胰腺癌成为一种隐匿性疾病；部分症状包括腹痛、背痛、食欲减退、黄疸和恶心，这些症状很容易被误认为是常见的消化系统疾病。 ⁴因此，开发新的药理学工具以辅助胰腺癌的诊断和治疗显得尤为重要。

使用动物模型有助于我们理解胰腺癌的生物学特性，并为将这些知识应用于人类提供了见解。胰腺癌的异种移植原位模型具有较高的真实性，因为肿瘤在起源器官内生长⁵。与将细胞系或肿瘤组织片段皮下植入的异位模型相比，原位模型能够重建肿瘤微环境，并模拟肿瘤细胞与其周围环境之间的相互作用⁶。本文所述的异种移植模型来源于经基因工程改造、可表达绿色荧光蛋白（GFP）的人胰腺癌细胞系PANC-1 GFP。通过检测GFP，可实现对肿瘤生长和转移的无创成像与实时监测⁷。该模型中的肿瘤发展迅速、自发形成，且与人类胰腺癌患者的原发肿瘤高度相似⁸。原位模型不仅能更准确地预测治疗药物对肿瘤的疗效，还可有效模拟肿瘤微环境。

如上所述，该动物模型....

方案

以下方案在西安大略大学动物护理与使用委员会的指导和批准下实施。所有实验均符合所有相关指南、法规及监管机构的要求。

1. 细胞培养

1. 完全培养基的制备
   1. 在II级生物安全柜中，将胎牛血清（FBS）和青霉素-链霉素溶液（P/S）无菌加入500 ml RPMI培养基瓶中，轻轻旋转混匀。每种添加剂的终浓度分别为10% FBS和1% P/S（v/v）。例如，向500 ml培养基中加入56 ml FBS和6 ml P/S。
   2. 将完全培养基置于37 °C水浴中预热。
2. 细胞的复苏与传代
   1. 从液氮中取出PANC-1 GFP细胞，将冻存管在37 °C水浴中轻轻振荡以快速解冻。
      注意：解冻过程应迅速（约2–3分钟）。
   2. 标记T-75培养瓶，标注内容包括：(a) 细胞系名称，(b) 传代次数，(c) 日期，(d) 研究人员姓名首字母。
   3. 用70%乙醇擦拭冻存管外壁，并将其转移至生物安全柜中。
   4. 为进行细胞扩增，向一个15 ml锥形离心管中加入9.0 ml完全培养基。使用1.0 ml移液器小心转移细胞悬液，并将其混入9 ml完全培养基中。
   5. 在室温下以125 × g离心8分钟。将锥形管转移至生物安全柜中，小心....

结果

该方法描述了荧光标记的人胰腺癌细胞的原位移植手术，重点介绍用于注射的细胞悬液制备、啮齿类动物的适当麻醉、通过剖腹手术递送细胞悬液，以及荧光成像技术的应用 体内 小动物成像。在植入后两到三周内检测到绿色荧光信号（GFP信号），可为研究人员提供视觉提示，以确认胰腺癌肿瘤的存在和发展图1). 图1 由三幅带有PANC-1 GFP荧光肿瘤的小鼠图像组成。第一幅为白光下拍摄（图1A）；第二张图像在蓝色荧光下拍摄（激发光：455 - 495 nm；发射光：513 - 557 nm），用于成像PANC-1胰腺肿瘤发出的绿色荧光（图1B）；第三个是前两者的合成图像，显示了肿瘤在小鼠体内的位置（图1C）。不产生肿瘤的动物不会显示 GFP 信号（图2）。此外，可通过在不同时间点记录GFP信号，非侵入性地监测肿瘤进展的代表性图像。图3). <.......

讨论

我们描述了一种表达绿色荧光蛋白（GFP）的原位小鼠胰腺癌模型，从而可通过活体成像无创监测肿瘤生长 体内 荧光成像图1）。该技术使我们能够实时监测肿瘤的发展过程（图3）；它可作为研究人员研究新型药物对胰腺癌治疗效果的重要工具。该模型的另一个重要特点是，GFP荧光可作为视觉指示，表明胰腺癌成功植入并生长，否则在活体动物中难以判断。该模型与临床情况一致，能够提供有关转移的信息，显示肿瘤向周围器官转移，包括脾脏、肠系膜淋巴结、肝脏和胃肠道（图4我们观察到移植后最早在第7周即出现转移。文献报道的PANC-1转移时间为10至18周。¹¹转移灶的出现时间可能取决于移植细胞的数量、移植方法及成像技术。在本研究中，我们选用了一种 commercially available 的绿色荧光细胞系 PANC-1 GFP。此处描述的模型具有可重复性，且由于转移灶具有明亮的荧光信号，可被轻松观察。由已建立的肿瘤细胞系构建的异种移植裸鼠模型存在一个局限性，即与原始人类肿瘤相比，其肿瘤异质性可能降低。¹²；.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
RPMI 1640 培养基	Caisson Labs	RPL03-500ML
胎牛血清	Gibco	10437-077
青霉素-链霉素	Thermo Ficher Sci	15140-122
Matrigel HC 基底膜基质，高浓度	Corning	354248
SutureVet PGA 6-0 聚乙醇酸缝线	Henry Schein	39010
Alcare 或泡沫型抗菌洗手液	Steris	639680
DPBS（杜氏磷酸盐缓冲液）	Thermo Ficher Sci	21300025
TB 注射器 27 G 1/2	Becton Dickinson	305620
异氟烷	Butler Schein	50562
酮洛芬	Fort Dodge Animal Health
手术剪，5.5"直型 Mayo 剪	Henry Schein	22-1600
PANC-1 GFP 细胞系	Anticancer, Inc
小动物成像系统：iBox Scientia	UVP, LLC. Upland, CA.		用于在活体动物中观察荧光标记肿瘤的小动物成像系统