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方法文章

胰腺癌荧光原位小鼠模型

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DOI：

10.3791/54337

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2016年9月20日

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1College of Pharmacy, Western University of Health Sciences, 2UVP, LLC, 3Department of Surgery, School of Medicine, University of California San Diego, 4Anticancer Inc.

本文内容

摘要

本文介绍了一种将表达绿色荧光蛋白的胰腺癌细胞（PANC-1 GFP）原位植入Balb-c Ola Hsd-Fox1nu小鼠胰腺以评估肿瘤进展和转移的实验方法。

摘要

胰腺癌仍是近几十年来生存率未显著改善的癌症之一。仅有7%的患者在确诊后存活超过五年。为了理解并模拟胰腺肿瘤的微环境，我们采用了一种小鼠原位胰腺癌模型，可实现对肿瘤进展的无创实时成像。表达绿色荧光蛋白的胰腺癌细胞（PANC-1 GFP）被悬浮于基底膜基质（高浓度）中，（例如，Matrigel HC）与无血清培养基混合后，通过开腹手术注入胰腺尾部。高浓度基底膜基质中的细胞悬液在达到室温时会转变为凝胶状物质；因此，当其接触胰腺组织时即发生凝胶化，在注射部位形成密封，防止细胞外漏。通过活体动物荧光成像监测肿瘤生长及其他器官的转移情况。使用适合GFP激发和发射的滤光片至关重要。本文详细描述了原位移植的各个步骤，以便研究人员能够在裸鼠中轻松重复该操作。本方案的主要步骤包括细胞悬液制备、手术移植及全身荧光成像 体内 成像。该原位模型旨在研究新型治疗药物对原发性和转移性肿瘤的疗效。

引言

胰腺癌的诊断频率相比其他癌症更高，是第4th 美国癌症相关死亡的主要原因。从诊断时起，超过90%的患者在五年内死亡 1,2目前，手术切除肿瘤是治愈胰腺癌的唯一方法，但仅有不到20%的患者适合接受手术，主要原因是在确诊时疾病已处于晚期并发生转移 3,4缺乏特异性症状使得胰腺癌成为一种隐匿性疾病；部分症状包括腹痛、背痛、食欲减退、黄疸和恶心，这些症状很容易被误认为是常见的消化系统疾病。 4因此，开发新的药理学工具以辅助胰腺癌的诊断和治疗显得尤为重要。

使用动物模型有助于我们理解胰腺癌的生物学特性，并为将这些知识应用于人类提供了见解。胰腺癌的异种移植原位模型具有较高的真实性，因为肿瘤在起源器官内生长5。与将细胞系或肿瘤组织片段皮下植入的异位模型相比，原位模型能够重建肿瘤微环境，并模拟肿瘤细胞与其周围环境之间的相互作用6。本文所述的异种移植模型来源于经基因工程改造、可表达绿色荧光蛋白（GFP）的人胰腺癌细胞系PANC-1 GFP。通过检测GFP，可实现对肿瘤生长和转移的无创成像与实时监测7。该模型中的肿瘤发展迅速、自发形成，且与人类胰腺癌患者的原发肿瘤高度相似8。原位模型不仅能更准确地预测治疗药物对肿瘤的疗效，还可有效模拟肿瘤微环境。

如上所述，该动物模型可实现对肿瘤生长和转移的实时荧光检测。与生物发光相比，荧光检测能够提供更直接的活体成像。在荧光检测中，发射光是由较短波长的激发光激发而产生的；而在生物发光中，发射光则源于化学反应，其发光强度可能较弱。9此外，全身 体内 荧光成像对动物无损害，可使研究人员长期监测肿瘤在治疗干预下的生长情况。

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方案

以下方案在西安大略大学动物护理与使用委员会的指导和批准下实施。所有实验均符合所有相关指南、法规及监管机构的要求。

1. 细胞培养

  1. 完全培养基的制备
    1. 在II级生物安全柜中，将胎牛血清（FBS）和青霉素-链霉素溶液（P/S）无菌加入500 ml RPMI培养基瓶中，轻轻旋转混匀。每种添加剂的终浓度分别为10% FBS和1% P/S（v/v）。例如，向500 ml培养基中加入56 ml FBS和6 ml P/S。
    2. 将完全培养基置于37 °C水浴中预热。
  2. 细胞的复苏与传代
    1. 从液氮中取出PANC-1 GFP细胞，将冻存管在37 °C水浴中轻轻振荡以快速解冻。
      注意：解冻过程应迅速（约2–3分钟）。
    2. 标记T-75培养瓶，标注内容包括：(a) 细胞系名称，(b) 传代次数，(c) 日期，(d) 研究人员姓名首字母。
    3. 用70%乙醇擦拭冻存管外壁，并将其转移至生物安全柜中。
    4. 为进行细胞扩增，向一个15 ml锥形离心管中加入9.0 ml完全培养基。使用1.0 ml移液器小心转移细胞悬液，并将其混入9 ml完全培养基中。
    5. 在室温下以125 × g离心8分钟。将锥形管转移至生物安全柜中，小心吸除上清液，避免扰动沉淀。
    6. 用移液器轻轻吹打，将沉淀重悬于10 ml新鲜完全培养基中。
    7. 使用血细胞计数板对细胞进行计数，并以2.1 × 106 个细胞/瓶的密度接种至T-75培养瓶中。将培养瓶置于37 °C、5% CO2的培养箱中培养。
    8. 每日肉眼及显微镜下观察细胞状态。如需更换培养液，无菌吸除培养瓶中的完全生长培养基并弃去，加入等体积的新鲜完全培养基。
  3. 细胞传代
    1. 无菌操作吸除培养瓶中的培养基，加入5 ml杜氏磷酸盐缓冲液（DPBS）清洗细胞后弃去。
    2. 加入3 ml 0.25%胰蛋白酶使细胞脱离培养瓶表面，将含胰蛋白酶的培养瓶置于37 °C、5% CO2条件下孵育5至10分钟。
    3. 在显微镜下（10倍物镜）观察细胞，确认细胞变圆并脱落。
    4. 加入等体积的完全培养基以中和胰蛋白酶活性，并通过轻柔吹打使细胞团块分散。
    5. 使用血细胞计数板对细胞进行计数，根据步骤1.2.7中所述的细胞密度，将适量细胞悬液转移至新培养瓶中；加入足够量的新鲜培养基，使每瓶终体积为10 ml。
  4. 注射用细胞悬液的制备
    注意：由于高浓度基底膜基质在室温下会凝固，所有材料均需保持在冰上。所有无菌移液器吸头和离心管应提前一夜置于冷冻保存，并在操作过程中持续置于冰上。
    1. 将一瓶不含任何添加剂的RPMI培养基置于冰上。按照生产商说明书解冻高浓度基底膜基质。建议将其分装至小管中，以避免反复冻融10。
    2. 吸除所有培养瓶中的培养基，并用5 ml DPBS清洗一次。重复上一节中所述步骤至步骤1.3.4。
    3. 将内容物转移至15 ml锥形离心管中，在室温下以125 × g离心8分钟。将离心管转移至生物安全柜中，用10 ml DPBS重悬沉淀。
    4. 轻柔吹打细胞悬液以充分分散沉淀，使用血细胞计数板进行细胞计数。
    5. 按照步骤1.4.3再次离心，吸除上清液。根据细胞数量，加入适量稀释液，使最终细胞数为3 × 106个，总体积为50 µl。稀释液由无血清培养基与高浓度基底膜基质按1:1（v/v）比例混合而成。
    6. 轻柔涡旋混匀细胞悬液，并始终置于冰上。此时细胞悬液已准备好用于注射。
  5. 手术植入
    注意：确保所有手术器械和材料均处于无菌状态，全程严格遵守无菌操作规范。
    1. 将加热垫放置于操作台上，并覆盖无菌手术单。设置麻醉机，确保所有所需物品均在伸手可及范围内。
    2. 将动物鼻部置于麻醉面罩中，调节麻醉气体为1 L/min氧气和2.5%异氟烷。
    3. 用碘伏轻轻擦拭动物侧腹部皮肤，再用70%乙醇冲洗。重复该过程三次。
    4. 通过轻捏后肢足部确认动物是否完全麻醉。若无反应，则表明动物已充分麻醉，可进行手术；若出现肢体抽动，应检查麻醉挥发罐中麻醉剂是否充足，并给予更长时间使动物完全进入麻醉状态。
    5. 将约200 µl细胞悬液吸入一支预先冷却的1.0 ml TB注射器（配18 G针头）中。更换为27 G针头后放回冰上，待用。
    6. 定位脾脏位置（腹部左上象限），用镊子夹起该区域皮肤，使用手术剪剪开约1.0 cm切口以形成皮下袋。同样方法夹起脾脏表面的平滑肌层并剪开，以进入腹腔。
    7. 轻柔夹住脾脏尾端并将其拉出体外。胰腺附着于脾脏，使用湿润的无菌棉签展开胰腺组织，定位胰腺尾部。
    8. 将50 µl细胞悬液注射至胰腺尾部，留针10秒后缓慢旋转退出针头。成功的植入表现为局部形成无渗漏的浅表性泡状隆起。
    9. 将胰腺和脾脏复位至腹腔内。先缝合肌肉层，再单独缝合皮肤层。使用6-0缝线或皮肤钉闭合切口。 为减轻动物疼痛，需皮下注射酮洛芬（SC，5 mg/kg），每24小时一次；或每12小时皮下注射布托啡诺（0.05–0.1 mg/kg），持续36小时。
    10. 使动物从麻醉中恢复，并放回笼中。同时密切监测其疼痛表现。根据IACUC规程或主管兽医或其指定人员的建议，动物必须在手术时（甚至术前——即预防性镇痛）给予镇痛处理，术后若出现疼痛症状，须追加镇痛措施。
  6. 体内成像
    注意：图像采集使用配备暗室及适用于GFP成像的滤光片的商用成像系统。图像获取通过CCD相机和包含可更换激发/发射镜头的光学系统完成（激发波长：455–495 nm；发射波长：513–557 nm）。每个时间点均在无滤光片条件下以1×1 binning模式采集明场图像。GFP激发采用氙灯多光谱光源。在整个成像过程中，通过将麻醉机连接至集成于成像系统暗室内的气体麻醉歧管，维持动物处于麻醉状态。
    1. 按照步骤1.5.2对动物进行麻醉。商用成像系统的暗室内设有麻醉面罩，以确保成像过程中动物持续处于麻醉状态。
    2. 设置正确的激发和发射滤光片。
    3. 首先仅使用白光获取初始图像。在整个成像过程中保持动物位置不变，随后切换至GFP滤光片采集第二张图像。
    4. 为获得最佳效果，将两张图像叠加。分析图像中的荧光区域及其强度。

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结果

该方法描述了荧光标记的人胰腺癌细胞的原位移植手术，重点介绍用于注射的细胞悬液制备、啮齿类动物的适当麻醉、通过剖腹手术递送细胞悬液，以及荧光成像技术的应用 体内 小动物成像。在植入后两到三周内检测到绿色荧光信号（GFP信号），可为研究人员提供视觉提示，以确认胰腺癌肿瘤的存在和发展图1). 图1 由三幅带有PANC-1 GFP荧光肿瘤的小鼠图像组成。第一幅为白光下拍摄（图1A）；第二张图像在蓝色荧光下拍摄（激发光：455 - 495 nm；发射光：513 - 557 nm），用于成像PANC-1胰腺肿瘤发出的绿色荧光（图1B）；第三个是前两者的合成图像，显示了肿瘤在小鼠体内的位置（图1C）。不产生肿瘤的动物不会显示 GFP 信号（图2）。此外，可通过在不同时间点记录GFP信号，非侵入性地监测肿瘤进展的代表性图像。图3). <...

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讨论

我们描述了一种表达绿色荧光蛋白（GFP）的原位小鼠胰腺癌模型，从而可通过活体成像无创监测肿瘤生长 体内 荧光成像图1）。该技术使我们能够实时监测肿瘤的发展过程（图3）；它可作为研究人员研究新型药物对胰腺癌治疗效果的重要工具。该模型的另一个重要特点是，GFP荧光可作为视觉指示，表明胰腺癌成功植入并生长，否则在活体动物中难以判断。该模型与临床情况一致，能够提供有关转移的信息，显示肿瘤向周围器官转移，包括脾脏、肠系膜淋巴结、肝脏和胃肠道（图4我们观察到移植后最早在第7周即出现转移。文献报道的PANC-1转移时间为10至18周。11转移灶的出现时间可能取决于移植细胞的数量、移植方法及成像技术。在本研究中，我们选用了一种 commercially available 的绿色荧光细胞系 PANC-1 GFP。此处描述的模型具有可重复性，且由于转移灶具有明亮的荧光信号，可被轻松观察。由已建立的肿瘤细胞系构建的异种移植裸鼠模型存在一个局限性，即与原始人类肿瘤相比，其肿瘤异质性可能降低。12；...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

感谢西部健康科学大学提供的校内资助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
RPMI 1640 培养基Caisson LabsRPL03-500ML
胎牛血清 Gibco10437-077
青霉素-链霉素  Thermo Ficher Sci15140-122
Matrigel HC 基底膜基质，高浓度Corning354248
SutureVet PGA 6-0 聚乙醇酸缝线Henry Schein39010
Alcare 或泡沫型抗菌洗手液Steris639680
DPBS（杜氏磷酸盐缓冲液） Thermo Ficher Sci21300025
TB 注射器 27 G 1/2Becton Dickinson305620
异氟烷Butler Schein50562
酮洛芬Fort Dodge Animal Health
手术剪，5.5"直型 Mayo 剪 Henry Schein22-1600
PANC-1 GFP 细胞系 Anticancer, Inc
小动物成像系统：iBox ScientiaUVP, LLC. Upland, CA.用于在活体动物中观察荧光标记肿瘤的小动物成像系统

参考文献

  1. Siegel, R. Pancreatic Cancer Stats: American Cancer Society: Cancer Facts & Figures. , Available from: http://www.cancer.org/acs/groups/content/@research/documents/webcontent/acspc-042151.pdf (2014).
  2. Smyth, E., Cunningham, D. Harrison's Principles of Internal Medicine. Kasper, D., et al. , 19th edn, McGraw-Hill Education. (2015).
  3. Mahipal, A., Frakes, J., Hoffe, S., Kim, R. Management of borderline resectable pancreatic cancer. World J Gastrointest Oncol. 7, 241-249 (2015).
  4. De La Cruz, M. S., Young, A. P., Ruffin, M. T. Diagnosis and management of pancreatic cancer. Am Fam Physician. 89, 626-632 (2014).
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