疏水性阿霉素前药胶束的制备与表征

摘要

本文描述了一种制备和表征负载亲脂性阿霉素前药的1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酰乙醇胺-N-[氨基-聚乙二醇-2000]（DSPE-PEG）胶束的方法。

摘要

胶束已成功用于抗癌药物的递送。两亲性聚合物在水性环境中通过自组装形成具有核-壳结构的胶束。胶束的疏水性核心可作为药物储库，包载疏水性药物。亲水性外壳可防止胶束聚集，并延长其在体内的系统循环时间。in vivo。本实验方案描述了一种合成阿霉素脂溶性前药——阿霉素-棕榈酸（DOX-PA）的方法，以提高药物在胶束中的载药量。采用pH敏感的腙键将阿霉素与脂质连接，有助于在癌细胞内释放游离的阿霉素。合成的DOX-PA使用二氯甲烷/甲醇作为洗脱剂，通过硅胶柱进行纯化。纯化后的DOX-PA采用薄层色谱法（TLC）和¹H-核磁共振波谱（¹H-NMR）进行分析。采用薄膜分散法制备载有DOX-PA的DSPE-PEG胶束。此外，本文还描述了多种胶束制剂的表征方法，包括测定DOX-PA浓度和包封率、测量粒径及粒径分布，以及评估体外抗癌活性。in vitro。本方案为载药胶束的制备与表征提供了有用的信息，有助于推动新型胶束基癌症纳米药物的研究与开发。

引言

化疗常用于治疗多种癌症。大多数（即使不是全部）化疗药物都具有毒性副作用，这些副作用可能从可管理的轻微症状（如恶心和腹泻）到更严重的危及生命的状况不等。由于大多数抗癌药物具有毒性，其对正常组织的非选择性暴露不可避免地导致毒性反应。因此，迫切需要一种能够将药物选择性递送至癌细胞的治疗策略。抗癌药物应用的另一挑战是其水溶性差。通常需要使用增溶剂来配制这些难溶性药物。然而，大多数增溶剂（如二甲基亚砜（DMSO）、Cremophor EL 和聚山梨酯80（Tween 80））可能引起肝肾毒性、溶血、急性超敏反应以及周围神经病变。¹ 因此，临床应用中亟需安全且生物相容性良好的制剂来递送难溶性抗癌药物。纳米载体是应对上述挑战的有前景的药物递送系统。这些纳米载体包括脂质体²、纳米颗粒³、胶束^4-7、聚合物-药物偶联物⁸以及无机材料⁹。已有多种纳米药物产品（例如，Doxil、Abraxane 和 Genexol）获得监管机构批准用于癌症患者的治疗。¹⁰

聚合物胶束是一种有前景的纳米级药物递送载体，已成功用于抗癌药物的递送。^4-7,11,12 典型的聚合物胶束由两亲性聚合物通过自组装过程制备而成。这种具有核-壳结构的聚合物胶束包含一个亲水性外壳和一个疏水性内核。亲水性外壳可通过空间位阻效应稳定胶束，并延长....

方案

1. DOX-PA 的合成

1. 称取 390 mg 阿霉素和 243 mg 棕榈酸肼，转移至圆底烧瓶中。
2. 用玻璃注射器向烧瓶中加入 150 ml 无水甲醇。用移液器加入 39 µl 三氟乙酸（TFA）。使用磁力搅拌器，在室温避光条件下搅拌反应混合物 18 小时。
   注意：可根据需要按比例放大或缩小反应物料的用量，以获得不同量的 DOX-PA。反应物的比例应保持不变。使用 78 mg 至 1,170 mg 范围内阿霉素的反应可在普通化学实验室中进行。
3. 使用硅胶柱纯化 DOX-PA。¹⁷
   1. 用旋转蒸发仪除去反应混合物中的溶剂。当混合物体积浓缩至约 20 ml 时，加入 3 g 硅胶。继续旋转蒸发，得到干燥粉末，并使产物吸附于硅胶上。干燥粉末形成后，再将样品在真空下保持 30 分钟。
   2. 使用二氯甲烷作为溶剂，将 50 g 硅胶装填入层析柱中。小心地将含有吸附产物的硅胶样品加至柱顶。
   3. 用二氯甲烷与甲醇的混合溶剂进行洗脱，并逐步增加甲醇的比例，从而提高溶剂极性（表 1）。
   4. 将洗脱液按每管 25 ml 收集于试管中，并通过薄层色谱法（TLC）监测分离进程。
   5. 合并所有含有纯 DOX-PA 的组分，用旋转蒸发仪除去溶剂至形成干燥粉末。产物再于真空下干燥过夜。
   ....

结果

图1展示了DOX-PA的合成路线。DOX-PA通过棕榈酸与阿霉素经由pH敏感的腙键连接而成。反应中使用了略微过量的棕榈酸肼，以促进反应完全。该反应方法效率很高，反应18小时后仅残留少量阿霉素（图2），产率约为88%。反应结束后，采用硅胶柱层析纯化DOX-PA，并干燥得到纯净的红色固体产物。通过薄层色谱（TLC）对DOX-PA进行分析，结果显示纯化后的DOX-PA呈现单一斑点（图2）。图3展示了DOX-PA的¹H-NMR谱图，可观察到阿霉素和棕榈酸各自的特征性核磁共振峰，进一步证实了偶联反应的成功。

本方案制备的胶束外观如图4所示。不含药物的空白DSPE-PEG胶束呈透明液体状；DOX-PA载药的DSPE-PEG胶束则呈红色液体，其红色来源于胶束中所载的DOX-PA.......

讨论

在本研究中，我们描述了一种简单且快速的薄膜分散法制备胶束。该方法利用两亲性聚合物（例如，DSPE-PEG）在水环境中通过自组装形成具有核-壳结构的胶束。该胶束制备方法具有多项优势：1. 制备工艺简单，避免了脂质体、纳米颗粒及纳米乳剂制备中常用的复杂粒径减小步骤（如挤出或均质化）¹⁹；2. 具有良好的可重复性，一旦配方经过优化并确立，即可实现优异的批间一致性。该方案对制备过程中的工艺参数变化（如超声强度和时间）具有较高的耐受性。尽管存在其他胶束制备方法（如透析法或乳化-溶剂蒸发法），但薄膜分散法更为便捷高效，因此在制药工业中大规模生产胶束方面具有广阔的应用前景。该方法的局限性在于其依赖于载体材料的自组装特性，因而仅适用于具备此类性质的材料。若聚合物材料选择不当，可能导致无法获得理想的胶束制剂。此外，该制备方法依赖超声处理来分散聚合物/药物薄膜并促进胶束形成。大多数市售超声水浴设备均适用，因为形成胶束仅需较低的超声功率。然而，若使用超声功率过弱的设备，则可能存在问题。

药物负载率低和药物过早释放是胶束药物递送系统面临的主要问题。本实验方案中，我们.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
DSPE-PEG2K	Cordenpharm	LP-R4-039	>95%
阿霉素	LC Laboratories	D-4000	>99%
棕榈酸酰肼	TCI AMERICA	P000425G	>98.0%
甲醇	ACROS Organics	610981000	无水
二氯甲烷	FISHER	D151-4	99.90%
二甲基亚砜-d6	ACROS Organics	AC320760075	NMR溶剂
三氟乙酸	ACROS Organics	AC293811000	99.50%
硅胶	FISHER	L-7446	230-400目
Baker Flex TLC板	FISHER	NC9990129
DPBS	Sigma-Aldrich	D8537
DU 145  前列腺癌细胞	ATCC	HTB-81
MTT	ACROS Organics	158990050	98%
RPMI 1640培养基	MEDIATECH INC	10041CV
抗生素-抗真菌剂	LIFE TECHNOLOGIES	15240062	100倍储存液
胎牛血清	LIFE TECHNOLOGIES	10437077
核磁共振波谱仪	Varian, Inc		300 NMR
Büchi R-3旋转蒸发仪	Buchi	1103022V1	旋转蒸发仪
超声波清洗槽	BRANSON ULTRASONICS CORPORATION	CPX952318R
UV-VIS分光光度计Biomate 3	Thermo Spectronic
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96孔细胞培养板	Becton Dickinson	353072
胰蛋白酶  0.25%	Corning Cellgro	25-053-CI