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方法文章

疏水性阿霉素前药胶束的制备与表征

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DOI：

10.3791/54338

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2016年8月2日

 ,  ,  ,  ,  , 
1School of Pharmacy, Hampton University

本文内容

摘要

本文描述了一种制备和表征负载亲脂性阿霉素前药的1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酰乙醇胺-N-[氨基-聚乙二醇-2000]（DSPE-PEG）胶束的方法。

摘要

胶束已成功用于抗癌药物的递送。两亲性聚合物在水性环境中通过自组装形成具有核-壳结构的胶束。胶束的疏水性核心可作为药物储库，包载疏水性药物。亲水性外壳可防止胶束聚集，并延长其在体内的系统循环时间。in vivo。本实验方案描述了一种合成阿霉素脂溶性前药——阿霉素-棕榈酸（DOX-PA）的方法，以提高药物在胶束中的载药量。采用pH敏感的腙键将阿霉素与脂质连接，有助于在癌细胞内释放游离的阿霉素。合成的DOX-PA使用二氯甲烷/甲醇作为洗脱剂，通过硅胶柱进行纯化。纯化后的DOX-PA采用薄层色谱法（TLC）和1H-核磁共振波谱（1H-NMR）进行分析。采用薄膜分散法制备载有DOX-PA的DSPE-PEG胶束。此外，本文还描述了多种胶束制剂的表征方法，包括测定DOX-PA浓度和包封率、测量粒径及粒径分布，以及评估体外抗癌活性。in vitro。本方案为载药胶束的制备与表征提供了有用的信息，有助于推动新型胶束基癌症纳米药物的研究与开发。

引言

化疗常用于治疗多种癌症。大多数（即使不是全部）化疗药物都具有毒性副作用，这些副作用可能从可管理的轻微症状（如恶心和腹泻）到更严重的危及生命的状况不等。由于大多数抗癌药物具有毒性，其对正常组织的非选择性暴露不可避免地导致毒性反应。因此，迫切需要一种能够将药物选择性递送至癌细胞的治疗策略。抗癌药物应用的另一挑战是其水溶性差。通常需要使用增溶剂来配制这些难溶性药物。然而，大多数增溶剂（如二甲基亚砜（DMSO）、Cremophor EL 和聚山梨酯80（Tween 80））可能引起肝肾毒性、溶血、急性超敏反应以及周围神经病变。1 因此，临床应用中亟需安全且生物相容性良好的制剂来递送难溶性抗癌药物。纳米载体是应对上述挑战的有前景的药物递送系统。这些纳米载体包括脂质体2、纳米颗粒3、胶束4-7、聚合物-药物偶联物8以及无机材料9。已有多种纳米药物产品（例如，Doxil、Abraxane 和 Genexol）获得监管机构批准用于癌症患者的治疗。10

聚合物胶束是一种有前景的纳米级药物递送载体，已成功用于抗癌药物的递送。4-7,11,12 典型的聚合物胶束由两亲性聚合物通过自组装过程制备而成。这种具有核-壳结构的聚合物胶束包含一个亲水性外壳和一个疏水性内核。亲水性外壳可通过空间位阻效应稳定胶束，并延长其在血液中的循环时间。疏水性内核则可有效包载疏水性药物。由于胶束尺寸较小（通常小于200 nm）并具有长循环特性，聚合物胶束被认为可通过增强的通透性和滞留效应（EPR效应）实现对肿瘤的靶向（即被动肿瘤靶向）。

药物负载的稳定性对胶束的肿瘤靶向能力至关重要。为了实现最佳的肿瘤靶向效果，胶束在到达肿瘤部位之前应尽量减少药物泄漏，而在进入癌细胞后则能迅速释放药物。此外，制剂稳定性也是产品开发中的基本要求，因为制剂稳定性决定了产品开发的可行性以及所开发产品的保质期。近年来，人们已投入大量努力以提高药物在递送载体中的装载效率。亲脂性前药策略是一种已被探索用于改善药物在脂质纳米粒和乳剂中装载的方法13,14。将脂质与药物共价连接可显著提高药物的亲脂性，从而增强其在纳米载体亲脂组分中的装载效率和滞留能力。

本文介绍了一种制备载有亲脂性阿霉素前药的胶束的实验方案。首先，描述了阿霉素亲脂性前药的合成步骤；随后，介绍了采用薄膜分散法制备胶束的方案。该方法已在我们先前的研究中成功应用。5 选择DSPE-PEG作为制备胶束的载体材料，是因为其已成功应用于胶束药物递送系统。15,16 最后，我们描述了几种 体外 用于表征胶束制剂及评估其抗癌活性的检测方法。

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方案

1. DOX-PA 的合成

  1. 称取 390 mg 阿霉素和 243 mg 棕榈酸肼，转移至圆底烧瓶中。
  2. 用玻璃注射器向烧瓶中加入 150 ml 无水甲醇。用移液器加入 39 µl 三氟乙酸（TFA）。使用磁力搅拌器，在室温避光条件下搅拌反应混合物 18 小时。
    注意：可根据需要按比例放大或缩小反应物料的用量，以获得不同量的 DOX-PA。反应物的比例应保持不变。使用 78 mg 至 1,170 mg 范围内阿霉素的反应可在普通化学实验室中进行。
  3. 使用硅胶柱纯化 DOX-PA。17
    1. 用旋转蒸发仪除去反应混合物中的溶剂。当混合物体积浓缩至约 20 ml 时，加入 3 g 硅胶。继续旋转蒸发，得到干燥粉末，并使产物吸附于硅胶上。干燥粉末形成后，再将样品在真空下保持 30 分钟。
    2. 使用二氯甲烷作为溶剂，将 50 g 硅胶装填入层析柱中。小心地将含有吸附产物的硅胶样品加至柱顶。
    3. 用二氯甲烷与甲醇的混合溶剂进行洗脱，并逐步增加甲醇的比例，从而提高溶剂极性（表 1）。
    4. 将洗脱液按每管 25 ml 收集于试管中，并通过薄层色谱法（TLC）监测分离进程。
    5. 合并所有含有纯 DOX-PA 的组分，用旋转蒸发仪除去溶剂至形成干燥粉末。产物再于真空下干燥过夜。
  4. 通过薄层色谱法（TLC）分析 DOX-PA。
    1. 裁取一块 4 cm × 8 cm 的 TLC 板。使用甲醇作为溶剂，用 TLC 点样毛细管在距板底端 0.5 cm 处点样。
    2. 将 TLC 板放入含有二氯甲烷与甲醇混合液（3:1, v/v）的展开槽中。溶剂深度应略低于 0.5 cm。
    3. 当溶剂前沿迁移至板顶端时，取出 TLC 板，用铅笔标记溶剂前沿位置，并让板自然干燥。将 TLC 板放入含有饱和碘蒸气的显色槽中，以显色观察样品。
  5. 使用 1H-核磁共振波谱法（1H-NMR）分析 DOX-PA。18
    1. 将 15 mg DOX-PA 溶解于 1 ml 二甲基亚砜-d6（DMSO）中，并将样品转移至 NMR 样品管。
    2. 将 NMR 样品管插入核磁共振仪的磁体中。选择 DMSO 为溶剂测定质子谱图。测量完成后将样品管从磁体中取出。分析 NMR 结果18。

2. 采用薄膜分散法制备DOX-PA胶束

  1. 在10 ml玻璃小瓶中，将DSPE-PEG（40 mg）和DOX-PA（4 mg）溶于2 ml甲醇中。
  2. 使用旋转蒸发仪在减压条件下除去有机溶剂，直至小瓶内形成一层薄膜。
    注意：或者，在惰性气体条件下蒸发有机溶剂例如，氩气或氮气）成膜，并将小瓶置于真空干燥器中以进一步除去残留溶剂。
  3. 将2 ml杜氏磷酸盐缓冲液（pH 7.4，DPBS）转移至玻璃小瓶中。
  4. 将小瓶置于室温超声水浴中3分钟以形成胶束。
    注意：不同型号的超声波清洗仪输出功率存在差异。应选择能够产生足够超声功率以分散聚合物/药物薄膜的设备。本实验方案中所用超声波清洗仪的输出功率为110 W。
  5. 将胶束短期保存于4 °C，长期保存于-20 °C。
    注意：或者，胶束也可在使用前进行冷冻干燥，并用水重新溶解。通常，该制剂无需添加冷冻保护剂或冻干保护剂。

3. DOX-PA 胶束的表征

  1. 胶束中DOX-PA浓度的测定及药物包封率的确定
    1. 将前几步合成的DOX-PA溶于DMSO，配制五种不同浓度的DOX-PA溶液：1 µg/ml、5 µg/ml、20 µg/ml、50 µg/ml和100 µg/ml。使用紫外-可见分光光度计在490 nm波长下测定DOX-PA溶液的吸光度。根据DOX-PA药物浓度及其在490 nm处对应的吸光度绘制标准曲线。
    2. 将25 µl载药胶束用500 µl DMSO稀释。使用紫外-可见分光光度计在490 nm处测定吸光度。根据步骤3.1.1中绘制的标准曲线计算药物浓度。
    3. 使用以下公式计算包封率：
      药物包封率 (%) = （胶束中所含药物量 / 加入的药物总量）× 100%
  2. 采用动态光散射（DLS）表征粒径
    1. 用DPBS（pH 7.4）稀释胶束，使终浓度为1 mg/ml的DSPE-PEG。取2 ml样品，使用粒径分析仪测定Z均粒径和多分散系数（PDI）。
  3. 评估 体外 抗癌活性
    注意：采用适当的无菌技术，并在生物安全柜内操作。
    1. 从细胞培养瓶中移除细胞培养基例如， T25 培养瓶中培养 DU-145 人前列腺癌细胞，并用 2 ml DPBS（pH 7.4）洗涤细胞。
    2. 吸弃DPBS，加入1 ml 0.25%胰蛋白酶溶液，于37 °C孵育2 min以使细胞脱落。
    3. 当大部分细胞从培养瓶脱落时，加入10 ml细胞培养基（RPMI 1640 + 10% 胎牛血清 + 1% 抗生素-抗真菌素），将细胞转移至15 ml离心管中，在1,000 × g下离心5分钟。
    4. 用5 ml细胞培养基重悬细胞沉淀，并取样用于血细胞计数板进行细胞计数。用细胞培养基将细胞稀释至密度为50,000个细胞/ml。将稀释后的细胞悬液加入96孔细胞培养板中（每孔100 µl）。将细胞置于细胞培养箱中孵育（37 °C，5% CO₂）2孵育18小时以使细胞贴壁。
    5. 将阿霉素（DOX）二甲基亚砜（DMSO）溶液和DOX-PA DMSO溶液用细胞培养基稀释，分别配制终浓度为0.1 µM、0.5 µM、2 µM、5 µM和10 µM的药物溶液。所有样品中DMSO的终浓度保持为0.5%。将DOX-PA胶束用细胞培养基稀释，分别配制终浓度为0.1 µM、0.5 µM、2 µM、5 µM和10 µM的药物溶液。以空白细胞培养基作为对照。
    6. 从培养箱中取出96孔细胞培养板，弃去原培养基，每孔加入100 µl 含步骤3.3.5中配制的不同处理剂的培养基（每组n = 4）。将细胞放回细胞培养箱中继续培养（37 °C，5% CO₂）。2再继续培养 72 小时。
    7. 吸弃培养基，加入100 µl含有0.5 mg/ml 3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基四氮唑溴盐（MTT）的培养基。
    8. 将细胞在细胞培养箱中继续孵育2小时。小心吸除培养基，加入100 µl DMSO以溶解甲臜结晶。
    9. 使用微孔板分光光度计在570 nm波长下测定吸光度，以670 nm为参考波长。
    10. 使用以下公式计算细胞活力：
      细胞活力 (%) = (A测试  ⁄  A对照) × 100%
      注意：使用单因素方差分析（ANOVA）统计检验方法比较不同组之间的细胞活力。计算IC50 基于细胞活力 与 药物浓度数据。

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结果

图1展示了DOX-PA的合成路线。DOX-PA通过棕榈酸与阿霉素经由pH敏感的腙键连接而成。反应中使用了略微过量的棕榈酸肼，以促进反应完全。该反应方法效率很高，反应18小时后仅残留少量阿霉素（图2），产率约为88%。反应结束后，采用硅胶柱层析纯化DOX-PA，并干燥得到纯净的红色固体产物。通过薄层色谱（TLC）对DOX-PA进行分析，结果显示纯化后的DOX-PA呈现单一斑点（图2）。图3展示了DOX-PA的1H-NMR谱图，可观察到阿霉素和棕榈酸各自的特征性核磁共振峰，进一步证实了偶联反应的成功。

本方案制备的胶束外观如图4所示。不含药物的空白DSPE-PEG胶束呈透明液体状；DOX-PA载药的DSPE-PEG胶束则呈红色液体，其红色来源于胶束中所载的DOX-PA...

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讨论

在本研究中，我们描述了一种简单且快速的薄膜分散法制备胶束。该方法利用两亲性聚合物（例如，DSPE-PEG）在水环境中通过自组装形成具有核-壳结构的胶束。该胶束制备方法具有多项优势：1. 制备工艺简单，避免了脂质体、纳米颗粒及纳米乳剂制备中常用的复杂粒径减小步骤（如挤出或均质化）19；2. 具有良好的可重复性，一旦配方经过优化并确立，即可实现优异的批间一致性。该方案对制备过程中的工艺参数变化（如超声强度和时间）具有较高的耐受性。尽管存在其他胶束制备方法（如透析法或乳化-溶剂蒸发法），但薄膜分散法更为便捷高效，因此在制药工业中大规模生产胶束方面具有广阔的应用前景。该方法的局限性在于其依赖于载体材料的自组装特性，因而仅适用于具备此类性质的材料。若聚合物材料选择不当，可能导致无法获得理想的胶束制剂。此外，该制备方法依赖超声处理来分散聚合物/药物薄膜并促进胶束形成。大多数市售超声水浴设备均适用，因为形成胶束仅需较低的超声功率。然而，若使用超声功率过弱的设备，则可能存在问题。

药物负载率低和药物过早释放是胶束药物递送系统面临的主要问题。本实验方案中，我们...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

本工作得到以下资助：NIH-SC3 项目资助、NSF-PREM 项目资助、汉普顿大学教师研究资助。我们感谢弗吉尼亚海洋科学研究所（VIMS）的 Michele A. Cochran 女士提供粒径分析仪的使用支持。我们还要感谢 Corinne R. Ramaley 女士对稿件的审阅。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
DSPE-PEG2KCordenpharmLP-R4-039>95%
阿霉素LC LaboratoriesD-4000>99%
棕榈酸酰肼TCI AMERICA  P000425G>98.0%
甲醇ACROS Organics610981000无水
二氯甲烷 FISHER D151-499.90%
二甲基亚砜-d6ACROS OrganicsAC320760075NMR溶剂
三氟乙酸 ACROS OrganicsAC29381100099.50%
硅胶FISHER L-7446230-400目
Baker Flex TLC板FISHER NC9990129
DPBSSigma-AldrichD8537
DU 145  前列腺癌细胞ATCCHTB-81
MTTACROS Organics15899005098%
RPMI 1640培养基MEDIATECH INC 10041CV
抗生素-抗真菌剂 LIFE TECHNOLOGIES 15240062100倍储存液
胎牛血清LIFE TECHNOLOGIES 10437077
核磁共振波谱仪Varian, Inc300 NMR 
Büchi R-3旋转蒸发仪Buchi1103022V1 旋转蒸发仪
超声波清洗槽BRANSON ULTRASONICS CORPORATION CPX952318R
UV-VIS分光光度计Biomate 3Thermo Spectronic
Zetasizer Nano ZS90 Malvern Instruments粒径分析仪
微孔板分光光度计 Rio-RadBenchmark Plus 
细胞培养孵育箱NapcoCO2 6000
生物安全柜Nuaire
SigmaPlot Systat Software, Inc.分析软件
96孔细胞培养板Becton Dickinson353072
胰蛋白酶  0.25%Corning Cellgro25-053-CI

参考文献

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