我们描述一种 体外 利用人肠道芯片微生理系统长期共培养肠道微生物组与肠绒毛的实验方案
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摘要
摘要
在此，我们描述了一种在人源肠芯片微生理系统装置中，将多物种人肠道微生物组与微工程化肠绒毛进行长期共培养的实验方案。我们于微流控装置中重建了肠腔-毛细血管组织界面，并持续施加生理性的机械形变和流体剪切力，以模拟肠道蠕动。在腔侧微通道中，培养人源肠上皮Caco-2细胞，形成“无菌”绒毛样上皮结构，并重建小肠绒毛。将预先培养的微生物细胞接种至腔侧，以建立宿主-微生物生态系统。当微生物细胞黏附于绒毛顶端表面后，恢复液体流动和机械形变，从而形成稳态微环境，其中持续供给新鲜培养基，并不断清除未结合的细菌及细菌代谢废物。经过数天至数周的持续共培养后，可在绒毛间随机观察到多个微菌落，且微生物与上皮细胞在培养中至少一周内均保持活性与功能。本共培养方案可进一步拓展，为研究存在于人体多种器官中的其他宿主-微生物组生态系统提供一个多功能平台，有望促进 体外 研究人类微生物组在调控健康与疾病中的作用。
引言
人类肠道中栖息着种类极为多样的微生物物种（<1,000 个物种）以及数量巨大的微生物细胞（是人体宿主细胞数量的 10 倍）和基因（是人类基因组基因数量的 100 倍）1这些人类微生物组在营养物质和异源物质的代谢、免疫应答的调节以及肠道稳态的维持中发挥着关键作用2鉴于这些多种功能，共生肠道微生物组对健康和疾病具有广泛的调节作用3因此，了解肠道微生物组及其与宿主相互作用的作用对于促进胃肠道健康以及探索肠道疾病的新疗法具有重要意义4。然而，现有的 体外 肠道模型（例如， 静态培养）将宿主-微生物组共培养限制在较短的时间内（<1天）因为微生物细胞过度生长，会破坏肠道屏障功能5. 替代动物模型（例如， 无菌6 或基因工程小鼠7也通常不用于研究宿主-肠道微生物组相互作用，因为人类肠道微生物组的定植和稳定维持较为困难。
为了克服这些挑战，我们近期开发了一种仿生的人源"Gut-on-a-Chip"微生理系统（图1A，左），用于模拟活体人肠道中宿主与肠道微生物组之间的相互作用5,8。该肠道芯片微装置包含两个平行的微流控通道，由一层柔性的、多孔的、涂有细胞外基质（ECM）的膜隔开，膜上排列着人肠上皮Cac....
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方案
1. 肠芯片装置的微加工
注意：肠芯片是一种由透明、透气的硅基聚合物（聚二甲基硅氧烷，PDMS）制成的微流控装置，包含两个平行的微通道（1 mm 宽 × 150 µm 高 × 1 cm 长），通道之间由一层柔性的多孔 PDMS 膜隔开（孔径 10 µm，孔间距 25 µm）5,9。请按照提供的步骤制备肠芯片（图 1A，左图）。
- 肠道芯片的微加工制备流程5,9。
- 将PDMS预聚物与固化剂按15:1（质量比）混合，制备未固化的脱气PDMS，并置于真空干燥器中处理30分钟。
- 分别将30 g和3 g未固化且已脱气的PDMS倾倒至两个硅模具上，这两个模具分别具有基于SU-8的肠道芯片上、下微通道的微结构图案；随后在干燥烘箱中60 °C条件下固化至少4小时。
- 使用外科手术刀沿边缘切割，从各自的硅模具上脱模得到上层和下层PDMS层；使用活检打孔器（孔径2.0 mm）打出6个孔（两个入口、两个出口以及两个真空腔）。
- 通过在含有圆柱阵列（直径10 µm，高度25 µm）的硅片上倾倒10 g未固化且已脱气的PDMS来制备多孔膜，该硅片已进行硅烷化处理，并覆盖有一层平整的硅烷化PDMS支撑层（15:1，w/w；厚度1 cm）；在装置上放置3 kg重物压紧，在60 °C下固化12小时或更长时间。 ....
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结果
模拟人类肠道宿主-微生物组生态系统 体外，它是 有必要建立一种实验方案，以在生理条件下（如类似蠕动的力学环境和流体流动）重建肠道细菌与人肠上皮细胞的稳定长期共培养体系。本文中，我们采用一种仿生的“肠芯片”微装置 (图1A将活的微生物细胞与活的人类绒毛直接接触共培养，持续一周或更长时间 体外肠上皮细胞在存在生理相关流体流动和周期性机械形变的条件下，于双通道微流控装置的一个通道内，在多孔ECM包被膜的一侧培养时，可自发形成高度分化的绒毛结构。5微工程化的绒毛可模拟人体小肠绒毛的结构与功能，包括形成由顶端刷状缘覆盖的柱状上皮细胞、具有子代细胞从隐窝向绒毛顶端迁移并分化特征的基底增殖型隐窝、高水平的黏液分泌、增强的药物代谢活性以及升高的葡萄糖重吸收能力8活的内皮细胞可在同一膜的对侧进行培养，以重建肠壁的组织-组织界面，同时可在该系统中培养免疫细胞10为验证肠上皮细胞的保护功能，通过测量跨上皮电阻（TEER），间.......
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讨论
理解宿主与微生物组之间的相互作用对于推动医学发展至关重要；然而，传统的细胞培养模型在塑料培养皿或静态孔板中进行时，通常无法支持人类肠道细胞与活体肠道微生物稳定共培养超过1-2天，因为微生物细胞往往会过度生长并覆盖哺乳动物细胞 体外过度生长的微生物群落会迅速消耗氧气和营养物质，进而产生大量代谢废物（例如， 有机酸），严重损害肠道屏障功能，并导致肠道上皮细胞死亡。因此，在共培养微环境中，防止因微生物过度生长所引发的营养物质耗竭和微生物代谢废物积累，对于维持宿主与微生物群长期（从数天至数周）稳定共存至关重要。
为克服这些挑战，一种微生理肠道芯片装置5,8 已开发出可形成完全分化的类人肠绒毛并维持肠腔稳态微环境的技术 体外设计与功能单元（例如， 肠道芯片微流控装置中的微流控流体腔室、由真空驱动的周期性形变等条件经过改进，可精确模拟微生物共培养所需的生理、物理和化学微环境5,10肠道芯片微流控培养中施加的剪切应力由人肠道管腔内流动的生理范围决定5,13
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披露
Donald E. Ingber 是 Emulate 公司的创始人，持有该公司股权，并担任其科学咨询委员会主席。其他作者没有财务披露事项。
致谢
感谢哈佛大学怀斯研究所（Wyss Institute at Harvard University）的 Sri Kosuri 提供表达 GFP 标记的 E. coli 菌株。本研究由美国国防高级研究计划局（Defense Advanced Research Projects Agency）合作协定编号 W911NF-12-2-0036、美国食品药品监督管理局（Food and Drug Administration）合同编号 HHSF223201310079C，以及哈佛大学生物启发工程怀斯研究所（Wyss Institute for Biologically Inspired Engineering at Harvard University）资助支持。本文所表达的观点和结论均为作者意见，不应被视为代表美国陆军研究办公室、陆军研究实验室、食品药品监督管理局或美国政府的官方政策，无论明示或暗示。尽管本文标注了版权信息，美国政府仍被授权为政府用途复制和分发重印本。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 含25 mM葡萄糖和25 mM HEPES的杜尔贝科改良伊格尔培养基（DMEM） | Gibco | 10564-011 | 在37 °C水浴中预热。 |
| Difco乳酸杆菌MRS肉汤 | BD | 288120 | 在121 °C下高压灭菌15分钟。 |
| 聚二甲基硅氧烷（PDMS） | Dow Corning | 3097358-1004 | 15:1（w/w），PDMS : 固化剂 |
| Caco-2BBE人结肠直肠癌细胞系 | 哈佛消化疾病中心 | 人结肠直肠腺癌 | |
| 热灭活胎牛血清（FBS） | Gibco | 10082-147 | 在DMEM中占20%（v/v） |
| 青霉素-链霉素-谷氨酰胺混合液 | Gibco | 10378-1016 | 在DMEM中1:100稀释 |
| 4′,6-二脒基-2-苯基吲哚二盐酸盐 | Molecular Probes | D1306 | 细胞核染色 |
| 鬼笔环肽-CF647偶联物（25单位/ml） | Biotium | 00041 | F-肌动蛋白染色 |
| Flexcell FX-5000张力系统 | Flexcell国际公司 | FX5K | 类蠕动拉伸运动（10%细胞应变，0.15 Hz频率） |
| 倒置落射荧光显微镜 | Zeiss | Axio Observer Z1 | 成像，微分干涉对比（DIC） |
| 扫描共聚焦显微镜 | Leica | DMI6000 | 成像，荧光 |
| UVO清洗仪 | Jelight公司 | 342 | 肠道芯片表面活化 |
| I型胶原蛋白 | Gibco | A10483-01 | 用于芯片内细胞培养的细胞外基质组分 |
| Matrigel | BD | 354234 | 用于芯片内细胞培养的细胞外基质组分 |
| 1 ml一次性注射器 | BD | 309628 | 细胞和培养基注射用具 |
| 25 G 5/8针头 | BD | 329651 | 细胞和培养基注射用具 |
| 注射泵 | Braintree Scientific公司 | BS-8000 | 向芯片内注射的设备 |
| VSL#3 | Sigma-Tau Pharmaceuticals | 7-45749-01782-6 | 由8种不同共生肠道微生物组成的制剂 |
| 强化梭菌培养基 | BD | 218081 | 厌氧细菌培养基 |
| 含指示剂的GasPak EZ厌氧容器系统 | BD | 260001 | 厌氧气体发生袋 |
| 4%多聚甲醛 | 电子显微镜科学公司 | 157-4-100 | 用于染色前细胞固定 |
| 曲拉通X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | 细胞通透处理 |
| 牛血清白蛋白 | Sigma-Aldrich | A7030 | 细胞染色用封闭剂 |
| 电晕处理仪 | Electro-Technic产品公司 | BD-20AC | 用于芯片制备的等离子体发生器 |
| Steriflip | Millipore | SE1M003M00 | 完全培养基脱气 |
| 一次性血细胞计数板 | iNCYTO | DHC-N01 | 用于手动细胞计数 |
参考文献
- Turnbaugh, P. J., et al. An obesity-associated gut microbiome with increased capacity for energy harvest. Nature. 444, 1027-1031 (2006).
- Tremaroli, V., Backhed, F. Functional interactions between the gut microbiota and host metabolism. Nature. 489
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