本方案提供了建立竞争性小鼠骨髓移植实验的逐步指南，用于研究造血干细胞/祖细胞功能，而无需通过细胞分选对干细胞进行预先纯化。
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本文内容
摘要
摘要
造血干细胞（HSC）的金标准定义是指：当移植到经辐照处理的受体中时，能够重建受体终生血液细胞生成能力的细胞。本实验方案详细说明了如何建立一种功能性检测方法，用于比较两种不同细胞群体（例如两种不同基因型小鼠的骨髓细胞）的造血干细胞能力，以及如何通过流式细胞术分析受体小鼠。该方案采用HSC等效单位而非细胞分选进行标准化，并讨论了这两种方法各自的优缺点。我们还进一步探讨了该基本方案的多种变体，包括连续移植、极限稀释实验、归巢实验以及非竞争性移植实验，并分析了这些不同方法的优势和适用场景。这些检测方法在造血干细胞功能研究中具有核心地位，不仅可用于探索造血干细胞内在生物学特性的基础研究，也可用于骨髓移植和体外扩增造血干细胞的临床前实验开发。
引言
造血作用是一种再生过程，可补充因损伤、辐射和细胞死亡而丢失的血细胞。该过程主要由定居于成年个体骨髓中的造血干细胞（HSC）来维持。此外，造血干细胞还可用于治疗自身免疫性疾病、血液系统恶性肿瘤以及免疫缺陷病。1因此，有必要更深入地了解调控造血干细胞（HSC）功能的机制，包括其增殖扩增能力以及移植后归巢并植入受体骨髓的能力。尽管近期研究已报道了若干细胞表面标志物，包括SLAM家族成员CD150和CD48，可将成体HSC和胎儿HSC前瞻性富集至约50%的纯度2-4，功能性造血干细胞的金标准检测方法仍然是一个 体内 重建造血功能检测，用于评估其在经辐照的宿主体内重建血细胞生成的能力5.
的 体内 克隆性重群体形成实验最初由 Till 和 McCulloch 建立6 并在此基础上不断优化和拓展。根据最初的定义，造血干细胞（HSCs）通过自我更新和分化潜能维持终身的血细胞生成。将HSCs移植至经辐照处理的受体中，可使我们评估其分化能力——通过分析各类血细胞谱系（T淋巴细胞、B淋巴细胞、粒细胞、单核细胞）的重建情况，以及其自我更新能力——通过连续移植实验。该检测通常涉及对两群HSCs的功能性及/或数量进行比较， 例如，来自两种不同基因型小鼠的细胞，或经不同因素处理与未处理的细胞，这些因素可能影响造血干细胞（HSC）在培养中的维持或扩增。随后可通过流式....
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方案
本方案中描述的所有操作均已获得机构动物伦理委员会的批准，并遵循加拿大动物护理委员会的指导原则。
注意：为维持无菌/特定病原体阴性饲养条件，所有涉及直接操作活体小鼠的步骤均须在生物安全柜或层流罩内进行。应对笼具、固定装置、饲养材料、饲料和饮水等进行适当清洁或灭菌处理。注射和采血时仅使用无菌的一次性针头。在移植物制备过程中，无菌操作技术至关重要。
1. 受体小鼠的准备
- 通过耳缘缺口（或当地动物伦理委员会批准的其他方法8）识别受体小鼠，以便随时间对每只小鼠的外周血和骨髓重建情况进行个体化追踪。称量小鼠体重，用于移植后的随访。使用年龄在7至12周之间（体重小于25 g）的受体小鼠。
注意：在本示例中，CD45.1+ CD45.2+ 受体小鼠是通过将C57Bl/6小鼠与同源B6.SJL小鼠杂交在本实验室培育获得。 - 以两次450 rad剂量照射受体小鼠，以消除其造血活性。第一次照射在移植前一天进行，第二次照射在移植前1–2小时进行。
注意：可根据可用设施选择使用X射线或γ射线。
2. 供体与竞争骨髓细胞的制备
- 处死供体（实验组和对照组；CD45.2）+）和竞争细胞（CD45.1
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结果
竞争性移植实验设置的总体描述（包括下文将进一步讨论的二次移植）见图1。移植前骨髓造血干细胞的代表性分析见图2。有关排除双联体细胞和死细胞的更详细信息可参见其他文献9。
图3和图4分别为外周血和骨髓流式细胞术分析模板的示例。检测到一定数量的宿主T淋巴细胞（最多占所有T细胞的20%；图3B）属于正常现象，因为T细胞对辐射更具抗性。竞争细胞应在所有三个谱系中均存在。检测下限在很大程度上取决于分析时获取的总细胞数量，但根据我们的经验，在单个白细胞门控内总共获取20,000个细胞通常已足够。若设定任意阈值为1%或0.5%，当供体细胞在任一特定谱系（如B淋巴系、T淋巴系或髓系，见图3）中的比例低于该阈值时，则认为该小鼠未实现多谱系重建。当竞争.......
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讨论
本文所述方案旨在通过与已知的竞争性造血干细胞（HSC）进行比较，评估供体（测试）HSC的相对适合度。竞争环境可提高该检测的相对敏感性（更有可能检测到干细胞适合度的中等程度下降），并为辐照和注射操作的有效性提供内部技术对照。然而，该方法不应作为HSC适合度的绝对衡量标准；竞争性重建能力的下降并不自动意味着HSC在无竞争条件下表现不佳。尽管可以认为竞争性环境是更合理的起始条件，因为竞争细胞能够弥补缺陷性HSC功能，从而确保所有受体小鼠存活，但在结果解读时仍需谨慎。在非竞争性条件下验证结果将有助于巩固研究结论。
本实验设计采用相当于造血干细胞（HSC）数量的总骨髓细胞，而非通过流式细胞术分选获得的纯化HSC群体。在所有待研究群体（不同供体、竞争细胞）中，必须使HSC数量保持一致，以消除不同供体之间的差异性，并确保表型上HSC频率的变化不会被误读为HSC功能的改变14与纯化的造血干细胞相比，此处所述方法的优势在于：由于处理时间缩短且分选过程中无外加压力，细胞活力更佳；同时，细胞向受体骨髓的归巢能力更强（分选后细胞表面残留的抗体可能干扰其在骨髓中的植入）15<.......
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披露
作者声明不存在任何竞争性经济利益。
致谢
我们感谢Roxann Hétu-Arbour在图示设计和实验操作演示方面提供的帮助。本实验室的研究工作得到了加拿大科尔基金会（Cole Foundation）过渡奖、加拿大自然科学与工程研究委员会（NSERC）发现基金（项目编号：419226-2012）以及加拿大创新基金会（CFI领导者基金，项目编号：31377）的资助。KMH为魁北克健康研究基金会（Fonds de recherche du Québec - Santé，FRQS）青年学者获得者。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 含K的Microtainer管2EDTA | BD 生物科学 | 365974 | |
| 20 G 针头 | BD 注射器 | 从下颌静脉采血 | |
| LabQuake 摇床旋转器 | 赛默飞世尔科技 科学的 | C415110 | |
| 纯化的抗小鼠 CD16/CD32（克隆 2.4G2，Fc 封闭） | BD 生物科学 | 553142 | 2.50 μg/ml |
| Pe-Cy7标记的抗小鼠CD3e抗体（克隆145-2C11） | eBioscience | 25-0031 | 0.25 μg/ml |
| PE标记的抗小鼠CD19抗体（克隆1D3） | eBioscience | 12-0193 | 0.25 μg/ml |
| APC-eFluor780（等同于 APC-Cy7）标记的抗小鼠 GR1 抗体（克隆株 RB6-8C5） | eBioscience | 47-5931 | 0.25 μg/ml |
| FITC标记的抗小鼠CD45.1（克隆A20） | eBioscience | 11-0453 | 2.50 μg/ml |
| eFluor450 标记的抗小鼠 CD45.2 抗体（克隆号 104） | eBioscience | 48-0454 | 1.00 μg/ml |
| 生物素标记的抗人/小鼠 CD45R (B220)（克隆 RA3-6B2） | eBioscience | 13-0452 | 1.25 μg/ml |
| 生物素标记的抗小鼠 CD3e 抗体（克隆 145-2C11） | eBioscience | 13-0031 | 1.25 μg/ml |
| 生物素标记的抗小鼠 CD11b 抗体（克隆 M1/70） | eBioscience | 13-0112 | 1.25 μg/ml |
| 生物素标记的抗小鼠 GR1 抗体（克隆株 RB6-8C5） | eBioscience | 13-5931 | 1.25 μg/ml |
| 生物素标记的抗小鼠 TER119 抗体（克隆株 TER119） | eBioscience | 13-5921 | 0.625 μg/ml |
| V500 链霉亲和素 | BD 生物科学 | 56149 | 0.5 μg/ml |
| PE标记的抗小鼠CD117抗体（克隆株2B8） | BD 生物科学 | 553355 | 0.25 μg/ml |
| PE-Cy7标记的抗小鼠Ly6A/E（Sca1）（克隆D7） | BD 生物科学 | 558162 | 0.25 μg/ml |
| PerCP-eFluor710 标记的抗小鼠 CD135 抗体（克隆株 A2F10） | eBioscience | 46-1351 | 0.5 μg/ml |
| Alexa Fluor 647 标记的抗小鼠 CD150 抗体（克隆号 TC15-12F12.2） | Biolegend | 115918 | 0.625 μg/ml BD Biosciences 和 eBioscience 不提供相同的克隆 |
| 1 ml 结核菌素注射器配 27 G 针头 | BD 注射器 | 309623 | |
| 1 ml 结核菌素注射器配25 G针头 | BD 注射器 | 309626 | |
| 70 μm细胞滤筛 | BD Falcon | 352350 |
参考文献
- Li, H. W., Sykes, M. Emerging concepts in haematopoietic cell transplantation. Nat Rev Immunol. 12 (6), 403-416 (2012).
- Kiel, M. J., Yilmaz, O. H., Iwashita, T., Terhorst, C., Morrison, S. J. SLAM family receptors distinguish hematopoietic stem and....
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