本方案提供了建立竞争性小鼠骨髓移植实验的逐步指南，用于研究造血干细胞/祖细胞功能，而无需通过细胞分选对干细胞进行预先纯化。
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本文内容
摘要
摘要
造血干细胞（HSC）的金标准定义是指：当移植到经辐照处理的受体中时，能够重建受体终生血液细胞生成能力的细胞。本实验方案详细说明了如何建立一种功能性检测方法，用于比较两种不同细胞群体（例如两种不同基因型小鼠的骨髓细胞）的造血干细胞能力，以及如何通过流式细胞术分析受体小鼠。该方案采用HSC等效单位而非细胞分选进行标准化，并讨论了这两种方法各自的优缺点。我们还进一步探讨了该基本方案的多种变体，包括连续移植、极限稀释实验、归巢实验以及非竞争性移植实验，并分析了这些不同方法的优势和适用场景。这些检测方法在造血干细胞功能研究中具有核心地位，不仅可用于探索造血干细胞内在生物学特性的基础研究，也可用于骨髓移植和体外扩增造血干细胞的临床前实验开发。
引言
造血作用是一种再生过程，可补充因损伤、辐射和细胞死亡而丢失的血细胞。该过程主要由定居于成年个体骨髓中的造血干细胞（HSC）来维持。此外，造血干细胞还可用于治疗自身免疫性疾病、血液系统恶性肿瘤以及免疫缺陷病。1因此，有必要更深入地了解调控造血干细胞（HSC）功能的机制，包括其增殖扩增能力以及移植后归巢并植入受体骨髓的能力。尽管近期研究已报道了若干细胞表面标志物，包括SLAM家族成员CD150和CD48，可将成体HSC和胎儿HSC前瞻性富集至约50%的纯度2-4，功能性造血干细胞的金标准检测方法仍然是一个 体内 重建造血功能检测，用于评估其在经辐照的宿主体内重建血细胞生成的能力5.
的 体内 克隆性重群体形成实验最初由 Till 和 McCulloch 建立6 并在此基础上不断优化和拓展。根据最初的定义，造血干细胞（HSCs）通过自我更新和分化潜能维持终身的血细胞生成。将HSCs移植至经辐照处理的受体中，可使我们评估其分化能力——通过分析各类血细胞谱系（T淋巴细胞、B淋巴细胞、粒细胞、单核细胞）的重建情况，以及其自我更新能力——通过连续移植实验。该检测通常涉及对两群HSCs的功能性及/或数量进行比较， 例如，来自两种不同基因型小鼠的细胞，或经不同因素处理与未处理的细胞，这些因素可能影响造血干细胞（HSC）在培养中的维持或扩增。随后可通过流式细胞术分析外周血和骨髓中的细胞表面标志物或其他可区分供体细胞与受体（宿主）细胞的方法，确定供体嵌合情况，即移植的供体HSC对血细胞生成的贡献程度。目前应用最广泛的标志物无疑是基因的两个等位基因 Ptprc 或 CD45 白细胞抗原7 我们为下文示例所选用的。
克隆性重建实验可分为竞争性与非竞争性两种。在非竞争性实验中，对照组和待测的造血干细胞（HSC）被分别移植到不同的受体小鼠体内，每种细胞类型的实验结果相互独立。而在竞争性实验中，待测组和对照组HSC的功能均通过与一组竞争性HSC群体的比较来评估。本文所述方案采用竞争性设置，但也可根据需要调整为非竞争性实验。两种方法各有优势与局限性，我们将在讨论部分对其进行详细比较。此外，我们还介绍了多种确保移植HSC数量均等的策略，解释了如何通过极限稀释分析法（LDA）对HSC进行定量，并提供了成功与失败移植的实例，以帮助结果的解读。
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方案
本方案中描述的所有操作均已获得机构动物伦理委员会的批准，并遵循加拿大动物护理委员会的指导原则。
注意：为维持无菌/特定病原体阴性饲养条件，所有涉及直接操作活体小鼠的步骤均须在生物安全柜或层流罩内进行。应对笼具、固定装置、饲养材料、饲料和饮水等进行适当清洁或灭菌处理。注射和采血时仅使用无菌的一次性针头。在移植物制备过程中，无菌操作技术至关重要。
1. 受体小鼠的准备
- 通过耳缘缺口（或当地动物伦理委员会批准的其他方法8）识别受体小鼠，以便随时间对每只小鼠的外周血和骨髓重建情况进行个体化追踪。称量小鼠体重，用于移植后的随访。使用年龄在7至12周之间（体重小于25 g）的受体小鼠。
注意：在本示例中，CD45.1+ CD45.2+ 受体小鼠是通过将C57Bl/6小鼠与同源B6.SJL小鼠杂交在本实验室培育获得。 - 以两次450 rad剂量照射受体小鼠，以消除其造血活性。第一次照射在移植前一天进行，第二次照射在移植前1–2小时进行。
注意：可根据可用设施选择使用X射线或γ射线。
2. 供体与竞争骨髓细胞的制备
- 处死供体（实验组和对照组；CD45.2）+）和竞争细胞（CD45.1+；B6.SJL）小鼠通过CO2 窒息后行颈椎脱位，或采用经当地动物伦理委员会批准的方法。
- 将小鼠仰卧放置，四肢充分展开，置于生物安全柜内的空培养皿中或无菌纱布上（以保持工作台面清洁）。用70%乙醇/30% H₂O湿润皮肤和毛发2O (v/v)
- 用手术刀或锋利的剪刀切除足部。沿腿部切开皮肤，使用锯齿状镊子剥离皮肤。去除多余的肌肉组织。
- 通过牵拉腿骨，并以剪刀刀片抵住骨盆作为反作用力，使股骨脱位。将胫骨和股骨与膝盖骨分离，并清除残留的肌肉和肌腱组织。将骨骼置于6孔组织培养板中，加入2–3 ml无菌磷酸盐缓冲液（PBS）。
- 用5 ml无菌PBS冲洗骨骼以收集骨髓细胞。
- 用镊子轻轻夹住骨骼，将连接1 ml注射器（已装满）的25 G针头插入骨的一端。推动针栓，将细胞收集至15 ml锥形管中。根据需要重复操作，直至骨中心呈白色。
- 通过反复用针头吹打使细胞解离，获得单细胞悬液。避免产生气泡和施加过度力量。注意：在此步骤中使用稍大一些的针头（22 G）可提高细胞活力。
- 通过70 µm尼龙滤网过滤细胞，以确保细胞悬液均匀，并去除碎片和细胞团块。
- 使用血细胞计数板取一份细胞悬液进行细胞计数。将剩余细胞悬液于4 °C、200 × g离心5分钟。根据需要在无菌PBS中调整细胞密度（108 细胞/毫升）。将细胞置于冰上。
3. 建立供体细胞造血干细胞等效物
- 转移相当于 3 x 106 将细胞（30 µl）加入至5 ml圆底聚苯乙烯管中，用于流式细胞术染色。加入等体积未标记的抗CD16/CD32抗体以阻断非特异性染色（用染色缓冲液（含0.1%牛血清白蛋白（BSA）和1 mM EDTA的PBS）稀释，终浓度为2.5 µg/ml）。室温孵育5分钟。
- 加入90 µl用染色缓冲液配制的荧光染料标记抗体主混合液：生物素标记谱系抗体混合物（B220、CD3e、CD11b、GR1、Ter119）、Sca1、CD117、CD135、CD150。冰上避光孵育30分钟。
注意：每批抗体均应确定适当的稀释比例。本研究中所用稀释比例详见材料表。 - 加入2 ml染色缓冲液至细胞中，涡旋混匀，于4 °C以200 × g离心5 min，以去除未结合的抗体。倾去上清液，通过轻弹管底重悬沉淀。
- 加入10 µl用染色缓冲液稀释的荧光素标记链霉亲和素（见 材料表）。冰上孵育20分钟，避光。按照步骤3.3进行洗涤，以去除未结合的链霉亲和素。
- 使用至少配备六个检测器的流式细胞仪获取细胞样本9. 确定 Lin 的频率- Sca1+ CD117+ CD135- CD150+ 使用所示分析模板对每份样本中的细胞（估计的造血干细胞）进行分析 图2 如先前报道所述10,11.
注意：该细胞群中功能性造血干细胞的频率估计为1/3至1/5之间2,12. - 为所有样本建立估算的造血干细胞等效值11，使用一个样本（通常为竞争者，B6.SJL CD45.1）+ 在此示例中）作为基线，具体如下所述及 图2.
- 使用以下公式计算所需的细胞数量：
#移植的HSCs / 受体 = 5 x 105 细胞数 × 估计的HSC频率（根据基线样本确定；该数值在野生型C57Bl/6小鼠中通常介于75至125之间）10-12.
注意：在 图2对于样本A，结果为139个HSCs。
移植细胞总数（适用于其他样本）； 例如 样本 B 在 图2= 移植的造血干细胞数量 / 造血干细胞频率
注意：在 图2，对于样品B，结果为197,826（或约2 × 105) 总骨髓细胞。
- 使用以下公式计算所需的细胞数量：
- 根据上述结果，计算每个样本每只移植受体所需的细胞总数。
注意：此数值应为 5 x 105 用于基线样本（竞争者）。- 将步骤 3.7 中得到的数值乘以受体小鼠的数量，并额外增加至少两只小鼠所需的细胞数，以补偿注射器中的死体积。
- 混合竞争物（例如CD45.1+）和待测细胞（CD45.2+按步骤3.6计算的1:1 HSC等效比例混合，并用无菌PBS调节终体积至每注射200 µl。
注意：对于五只受体小鼠，建议体积至少为 1.4 ml，含有 3.5 x 106 竞争性骨髓细胞（或样本A中估计的973个HSCs） 图2）以及等量的检测细胞（在 图2，样品B的等效值为197,826 × 7 = 1,384,782个骨髓细胞。
4. 骨髓移植
- 使用红色加热灯对在步骤1.2中接受照射的受体小鼠进行加温，以促进血管扩张，使尾部侧静脉更清晰可见。
- 准备一支配有27 G（或更小）针头的1 ml结核菌素注射器。吸取约750 µl已制备的细胞悬液（供3只受体小鼠使用）。确保注射器内无气泡。
- 将小鼠放入固定装置中。检查尾巴，观察两侧清晰可见的尾部侧静脉。用乙醇擦拭注射部位。针头斜面朝上，与皮肤平行刺入，并轻柔推动活塞。注射应顺畅无阻。若需用力，则说明针头未进入静脉。
注意：老年小鼠皮肤较厚，可能使静脉定位更加困难。若针头未进入静脉，应在初始注射位点近端重新穿刺。 - 拔出针头后，用无菌纱布按压注射部位数秒钟以止血。将小鼠转移至清洁的笼具中。
注意：同一注射器和针头可用于三次注射，之后针头可能变得过钝。 - 移植后随访期间，在前五天每天皮下注射1 ml无菌PBS以补充水分。可在饮水中添加抗生素以预防感染（如需要，可选）。在前三个星期每两至三天称重一次小鼠，对体重较移植前下降超过15–20%的小鼠实施安乐死（或根据当地动物伦理委员会规定执行）。
5. 外周血分析
- 将一滴血液（约 50–100 µl）收集至 EDTA 管中。
- 采集下颌静脉血液时，使用采血针或 22 G 针头刺破下颌骨下方无毛区域附近的面部皮肤，并将收集管置于该处以接收血滴13。在移植后第 4、8、12 和 16 周采集血液，以监测多谱系重建情况。
- 向第 5.1.1 步收集的血滴中加入 1 ml 新鲜配制的室温红细胞裂解缓冲液（9 份 0.16 M NH4Cl + 1 份 0.17 M Tris-HCl，pH 7.65）。混匀后转移至适合流式细胞术检测的 5 ml 圆底聚苯乙烯管中，室温静置 4 分钟。
- 加入 4 倍体积的预冷 PBS（置于冰上）。通过翻转混匀，立即置于冰上，随后在 4 °C 下以 200 × g 离心 10 分钟。
- 倾去上清液，轻弹管底重悬沉淀。上清液应澄清且呈红色。加入 2 ml 染色缓冲液，短暂涡旋振荡，然后在 4 °C 下以 200 × g 离心 5 分钟。
- 倾去上清液，轻弹管底重悬沉淀。
- 按照第 3.1 至 3.3 步所述的一般流程进行流式细胞术染色，主混合液中使用以下抗体：CD45.1、CD45.2、CD3e、CD19、GR1。
- 使用至少配备六个检测器的流式细胞仪获取细胞样本数据9。根据所提供的 图 3 中的分析模板以及已发表的方法10,11，确定各样本中供体来源细胞在各谱系中的比例（CD19+ B 淋巴细胞、CD3e+ T 淋巴细胞、GR1bright 粒细胞）。
6. 骨髓重建的分析
- 按照第2节所述方法收集骨髓细胞。使用3.1至3.3步骤中详述的通用方案，以及以下抗体混合物对细胞进行染色以进行流式细胞术分析：谱系抗体混合物（Lineage cocktail）、Sca1、CD117、CD135、CD150、CD45.1、CD45.2。按照步骤3.4所述，使用荧光染料偶联的链霉亲和素检测谱系抗体混合物中的抗体。
- 使用具有至少八个检测器的流式细胞仪获取细胞样本9。若仅有六个检测器，可将CD135与谱系抗体组合并使用同一通道，因为CD135+细胞将被排除。使用图4中提供的分析模板及已发表的方法10，确定各样本中供体来源的Lin- Sca1+ CD117+ CD135- CD150+造血干细胞（HSCs）的频率。
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结果
竞争性移植实验设置的总体描述（包括下文将进一步讨论的二次移植）见图1。移植前骨髓造血干细胞的代表性分析见图2。有关排除双联体细胞和死细胞的更详细信息可参见其他文献9。
图3和图4分别为外周血和骨髓流式细胞术分析模板的示例。检测到一定数量的宿主T淋巴细胞（最多占所有T细胞的20%；图3B）属于正常现象，因为T细胞对辐射更具抗性。竞争细胞应在所有三个谱系中均存在。检测下限在很大程度上取决于分析时获取的总细胞数量，但根据我们的经验，在单个白细胞门控内总共获取20,000个细胞通常已足够。若设定任意阈值为1%或0.5%，当供体细胞在任一特定谱系（如B淋巴系、T淋巴系或髓系，见图3）中的比例低于该阈值时，则认为该小鼠未实现多谱系重建。当竞争...
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讨论
本文所述方案旨在通过与已知的竞争性造血干细胞（HSC）进行比较，评估供体（测试）HSC的相对适合度。竞争环境可提高该检测的相对敏感性（更有可能检测到干细胞适合度的中等程度下降），并为辐照和注射操作的有效性提供内部技术对照。然而，该方法不应作为HSC适合度的绝对衡量标准；竞争性重建能力的下降并不自动意味着HSC在无竞争条件下表现不佳。尽管可以认为竞争性环境是更合理的起始条件，因为竞争细胞能够弥补缺陷性HSC功能，从而确保所有受体小鼠存活，但在结果解读时仍需谨慎。在非竞争性条件下验证结果将有助于巩固研究结论。
本实验设计采用相当于造血干细胞（HSC）数量的总骨髓细胞，而非通过流式细胞术分选获得的纯化HSC群体。在所有待研究群体（不同供体、竞争细胞）中，必须使HSC数量保持一致，以消除不同供体之间的差异性，并确保表型上HSC频率的变化不会被误读为HSC功能的改变14与纯化的造血干细胞相比，此处所述方法的优势在于：由于处理时间缩短且分选过程中无外加压力，细胞活力更佳；同时，细胞向受体骨髓的归巢能力更强（分选后细胞表面残留的抗体可能干扰其在骨髓中的植入）15<...
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披露
作者声明不存在任何竞争性经济利益。
致谢
我们感谢Roxann Hétu-Arbour在图示设计和实验操作演示方面提供的帮助。本实验室的研究工作得到了加拿大科尔基金会（Cole Foundation）过渡奖、加拿大自然科学与工程研究委员会（NSERC）发现基金（项目编号：419226-2012）以及加拿大创新基金会（CFI领导者基金，项目编号：31377）的资助。KMH为魁北克健康研究基金会（Fonds de recherche du Québec - Santé，FRQS）青年学者获得者。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 含K的Microtainer管2EDTA | BD 生物科学 | 365974 | |
| 20 G 针头 | BD 注射器 | 从下颌静脉采血 | |
| LabQuake 摇床旋转器 | 赛默飞世尔科技 科学的 | C415110 | |
| 纯化的抗小鼠 CD16/CD32（克隆 2.4G2，Fc 封闭） | BD 生物科学 | 553142 | 2.50 μg/ml |
| Pe-Cy7标记的抗小鼠CD3e抗体（克隆145-2C11） | eBioscience | 25-0031 | 0.25 μg/ml |
| PE标记的抗小鼠CD19抗体（克隆1D3） | eBioscience | 12-0193 | 0.25 μg/ml |
| APC-eFluor780（等同于 APC-Cy7）标记的抗小鼠 GR1 抗体（克隆株 RB6-8C5） | eBioscience | 47-5931 | 0.25 μg/ml |
| FITC标记的抗小鼠CD45.1（克隆A20） | eBioscience | 11-0453 | 2.50 μg/ml |
| eFluor450 标记的抗小鼠 CD45.2 抗体（克隆号 104） | eBioscience | 48-0454 | 1.00 μg/ml |
| 生物素标记的抗人/小鼠 CD45R (B220)（克隆 RA3-6B2） | eBioscience | 13-0452 | 1.25 μg/ml |
| 生物素标记的抗小鼠 CD3e 抗体（克隆 145-2C11） | eBioscience | 13-0031 | 1.25 μg/ml |
| 生物素标记的抗小鼠 CD11b 抗体（克隆 M1/70） | eBioscience | 13-0112 | 1.25 μg/ml |
| 生物素标记的抗小鼠 GR1 抗体（克隆株 RB6-8C5） | eBioscience | 13-5931 | 1.25 μg/ml |
| 生物素标记的抗小鼠 TER119 抗体（克隆株 TER119） | eBioscience | 13-5921 | 0.625 μg/ml |
| V500 链霉亲和素 | BD 生物科学 | 56149 | 0.5 μg/ml |
| PE标记的抗小鼠CD117抗体（克隆株2B8） | BD 生物科学 | 553355 | 0.25 μg/ml |
| PE-Cy7标记的抗小鼠Ly6A/E（Sca1）（克隆D7） | BD 生物科学 | 558162 | 0.25 μg/ml |
| PerCP-eFluor710 标记的抗小鼠 CD135 抗体（克隆株 A2F10） | eBioscience | 46-1351 | 0.5 μg/ml |
| Alexa Fluor 647 标记的抗小鼠 CD150 抗体（克隆号 TC15-12F12.2） | Biolegend | 115918 | 0.625 μg/ml BD Biosciences 和 eBioscience 不提供相同的克隆 |
| 1 ml 结核菌素注射器配 27 G 针头 | BD 注射器 | 309623 | |
| 1 ml 结核菌素注射器配25 G针头 | BD 注射器 | 309626 | |
| 70 μm细胞滤筛 | BD Falcon | 352350 |
参考文献
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