需要JoVE订阅才能观看此内容。 请登录或开始免费试用

方法文章

微流控流动池中通过偏振全内反射荧光显微镜监测单个蛋白脂质体与锚定支撑双层膜的SNARE介导融合

10.8K 次观看

⸱

DOI：

10.3791/54349

⸱

2016年8月24日

 , 
1Department of Cellular and Molecular Physiology, Yale University School of Medicine, 2Nanobiology Institute, Yale University, 3Department of Molecular Biophysics and Biochemistry, Yale University, 4Laboratoire de Neurophotonique, Université Paris Descartes, Faculté des Sciences Fondamentales et Biomédicales, Centre National de la Recherche Scientifique (CNRS)

本文内容

摘要

本文介绍了一种利用偏振全内反射荧光显微镜（TIRFM），在微流控通道中以单分子灵敏度和约15毫秒时间分辨率检测脂质体与支撑双层膜之间由SNARE介导的单个融合事件的实验方案。该方法可同时检测脂质和可溶性货物的释放，并可测量脂质体尺寸、脂质扩散系数以及融合孔的特性。

摘要

在普遍存在的膜融合过程中，融合孔的打开建立了两个原先相互分离的区室之间的首次连接。在通过胞吐作用释放神经递质或激素的过程中，融合孔可短暂地反复开放与关闭，从而调控 cargo 分子的释放动力学。孔道动力学还决定了囊泡回收的方式；不可逆的重新闭合导致瞬时性 "吻-运行" 融合，而扩张则导致完全融合。为了更好地理解调控孔道动态的因素，我们开发了一种检测膜融合的实验方法，该方法采用偏振全内反射荧光（TIRF）显微镜，具有单分子灵敏度和约15毫秒的时间分辨率，并在生化条件明确的体系中进行 体外 系统。通过监测含有v-SNARE蛋白的荧光标记小单层囊泡（v-SUVs）与承载t-SNARE蛋白并支撑于软性聚合物垫上的平面双层膜（t-SBL，t-支撑双层膜）之间的融合过程，实现对膜融合事件的观察。该检测利用微流控流动通道，可在持续供给恒定密度SUVs的同时最大限度减少样品消耗。当SUV中的脂质标记物在融合过程中转移至SBL时，荧光信号迅速增强，借此可监测脂质染料转移的动力学过程。全内反射荧光（TIRF）显微镜的高灵敏度可实现对单个荧光脂质标记物的追踪，从而在每次融合事件中推导出脂质扩散系数和SUV尺寸。脂质染料释放时间可能远长于通过永久开放孔道时预期的无阻碍通过时间。采用假设脂质释放延迟源于孔道闪烁（pore flickering）的模型，可分析孔道 "开放性"，融合过程中孔道保持开放的时间比例，可以被估算。可通过在SUV中包封可溶性标记物，以同时监测脂质和可溶性货物的释放。此类测量表明，某些孔道在释放部分可溶性货物后可能重新闭合。

引言

膜融合是一种普遍存在的生物学过程，对于脂质和蛋白质的细胞内运输、分泌、受精、发育以及包膜病毒进入宿主生物体至关重要1-3。对于大多数细胞内融合反应（包括通过胞吐作用释放激素和神经递质），融合两个脂双层所需的能量来源于定位于囊泡（v-SNARE）和靶膜（t-SNARE）上的同源可溶性N-乙基马来酰亚胺敏感因子附着蛋白受体（SNARE）蛋白之间形成的四螺旋束4。突触囊泡胞吐是调控最为严密的融合反应，在动作电位到达后一毫秒内即发生1,4,5。融合孔是两个融合区室之间的初始连接结构，可在最终重新闭合或不可逆地扩张之前多次瞬时开放和关闭5-7。前者导致短暂的“亲吻与逃逸”式融合，而后者则导致完全融合。目前对调控这两种融合模式之间平衡的因素以及调节融合孔闪烁行为的机制尚不完全清楚5,8。

SNARE 蛋白是胞吐作用所必需的；当神经毒素切割 SNARE 蛋白后，突触囊泡的融合即被阻断9。利用小单层脂质体（SUV）进行的群体融合实验表明，SNARE 蛋白不仅为膜融合所必需，而且足以驱动膜融合过程10。在此群体实验中，将含有 v-SNARE 的脂质体（v-SUV）掺入荧光磷脂标记物（N-(7-硝基-2-1,3-苯并噁二唑-4-基)-磷脂酰乙醇胺（NBD-PE）和 N-(罗丹明 B 磺酰基)-磷脂酰乙醇胺（LR-PE）），并与不含标记、但含有 t-SNARE 的脂质体（t-SUV）混合。最初，v-SUV 中 NBD-PE 的荧光因与 LR-PE 发生荧光共振能量转移（FRET）而被淬灭。当标记的 v-SUV 与未标记的 t-SUV 发生融合后，合并膜中荧光探针的表面密度降低，导致 NBD-PE 荧光增强，从而反映脂质混合的程度10。由于该群体实验易于建立和分析，已被广泛用于研究 SNARE 介导的融合机制10–14。然而，该方法存在若干局限性，例如灵敏度较低、时间分辨率差。最重要的是，作为一种整体性测量手段，它对所有事件进行平均处理，因而难以区分囊泡停靠与融合过程，也难以检测半融合中间态。

在过去十年中，包括我们团队在内的多个研究小组开发了新的检测方法，用于在单个囊泡水平上监测融合事件15-27。Ha 及其同事使用固定在表面的v-SUVs，并监测其与游离的t-SUVs之间的融合过程18,19。通过全内反射荧光（TIRF）显微镜技术，利用分别嵌入v-SUVs和t-SUVs中的脂质结合荧光探针对之间的荧光共振能量转移（FRET）来监测脂质混合18。随后，Brunger 实验室采用一种单脂质标记物结合内容物标记物的方法，实现对脂质混合和内容物混合的同步检测20,28。脂质标记物和内容物标记物均以高浓度（自淬灭浓度）加入；当与未标记的SUVs发生融合时，荧光信号去淬灭20,28。

其他研究者已将v-SUV与重构有t-SNARE的平面双层膜进行融合15-17,21-27,29。含有t-SNARE的靶标（t-SNARE）双层膜的平面几何结构更接近于小而高度弯曲的囊泡与平坦的质膜之间生理融合过程的真实情况。Steinem研究组采用跨越孔隙的膜结构，其上重构了t-SNARE，并将该膜悬置于多孔氮化硅基底之上，利用共聚焦激光扫描显微镜检测单个v-SUV的融合事件23。其他研究则将v-SUV与负载在玻璃基底上的、重构有t-SNARE的平面双层膜进行融合15-17,21,22,24-27,29。使用支撑双层膜（SBLs）的最大优势在于，可利用全内反射荧光显微镜（TIRF）以优异的信噪比检测到停靠和融合事件，且不受游离v-SUV的干扰；尽管如此，使用微流控技术结合标准的远场落射荧光显微镜也可实现单事件分辨24。

一个主要问题是底物与双层膜之间的相互作用是否以及如何影响支撑双层膜的质量和融合过程。早期研究使用直接支撑在玻璃或石英基底上的平面支撑双层膜（SBL）15-17。这些SBL通过t-SUV膜在基底上的吸附、破裂、铺展和融合形成。然而，人们很快发现，以这种方式制备的SBL若缺少关键的t-SNARE组分SNAP25，其v-SUV的停靠与融合动力学与使用完整t-SNARE时所获得的结果并无差异17。由于SNAP25在体内融合过程中是绝对必需的in vivo30,31，这些早期实验的生理相关性因而受到质疑。Tamm课题组通过更精确控制的支撑双层膜形成方法克服了这一挑战21。该方法首先采用Langmuir-Blodgett沉积法制备不含蛋白质的SBL第一单层，随后通过该单层与t-SUV的融合完成双层构建21。该策略实现了SNAP25依赖性的膜融合。

为避免使用Langmuir-Blodgett方法，防止玻璃基底上直接支撑的双层膜产生潜在的人工假象，Karatekin 等 在双层膜与基底之间引入了一层柔软的水合聚乙二醇（PEG）缓冲层24该修饰还导致了SNAP25依赖性的融合24. 软聚合物层支撑的双层膜已被证实能更有效地维持跨膜蛋白的流动性与功能32，且已用于与病毒的融合研究33此外，聚乙二醇化的双分子层似乎仍保留一定的自愈能力，并且非常稳定。34,35首先，将一部分市售的脂质连接的PEG链掺入t-SUV膜中。当这些t-SUV破裂并在玻璃基底上形成平面双层膜时，PEG刷会覆盖平面双层膜的两个脂质单层。由于平面双层膜的形成依赖于t-SUV周围PEG链与亲水性玻璃表面的黏附作用，因此脂质体的破裂和平面双层膜的形成对所用脂质组成相对不敏感。然而，当含有大量胆固醇时，SUV的内聚性增强，可能导致SUV无法自发破裂。若出现这种情况，可采用渗透冲击或二价离子促进平面双层膜的形成。25.

如上所述，在该方法中，聚乙二醇（PEG）刷层覆盖了平面支撑双层膜的两侧。面向微流控流动通道的刷层有助于防止入射v-SUV（通常也覆盖有PEG层）的非特异性粘附。v-和t-SNARE复合物的形成始于远离膜的N末端，并逐步向靠近膜的结构域发展36。为了使v-SUV与t-SBL发生相互作用，v-和t-SNARE的N末端必须突出于PEG刷层之上，而在本实验条件下，这一情况似乎确实存在。通过调节PEG化脂质的密度和PEG链的长度，可调整刷层高度，从而适用于研究SNARE以外的其他蛋白质37,38。覆盖在融合双层膜近端表面的PEG刷层另一优势在于，其可模拟生物膜的拥挤环境——每平方微米生物膜上密集排列着30,000至40,000个内在膜蛋白39。正如本实验中的PEG链一样，覆盖在生物膜上的排斥性蛋白层也必须被推开，才能使两个磷脂双层膜接触，进而实现膜融合。

本实验采用微流控流动通道，因其具有独特优势。首先，微流控流动可实现t-SUV更均匀地沉积、铺展并融合形成t-SBL。其次，微小的通道体积（< 1 µl）可显著减少样品消耗。第三，所需样品体积小，使得整个实验可在持续流动条件下进行。流动可去除弱结合（可能为非特异性结合）的v-SUV，从而清洁SBL16；同时维持t-SBL上方v-SUV的恒定密度，简化动力学分析17。此外，流动条件下可清晰区分已锚定的囊泡与随流移动的游离囊泡25。第四，可在同一盖玻片上设置多个微流控通道，分别用于检测不同实验条件，从而实现在同一次实验运行中对不同条件进行直接比较。van Oijen研究组曾采用类似方法研究流感病毒与缓冲型SBL之间的融合过程33。

在全内反射荧光显微镜（TIRF）中，倏逝波场呈指数衰减（衰减常数约为100 nm），可将荧光激发限制在紧邻玻璃-缓冲液界面的分子范围内。这最大限度地减少了远处荧光分子的信号干扰，提高了信噪比，并可在10–40毫秒的帧曝光时间内实现单分子检测灵敏度。倏逝波场还会在膜融合时导致信号增强：当标记的脂质从小单层囊泡（SUV）转移至固相支持双层膜（SBL）时，平均而言，它们处于更强的激发光场中。这种荧光增强效应在较大的脂质体中更为显著。

如果使用偏振光产生倏逝场，则当标记物从SUV转移到SBL时，额外的效应会进一步影响荧光的变化。一些脂质染料的跃迁偶极矩相对于其嵌入的双分子层具有特定的平均取向角。这导致荧光团在SUV中时所发射的荧光量与在其他环境中不同。 与 SBL，因为偏振光束对两种膜中的染料激发效果不同。对于前者，激发光束将与沿球形SUV分布的跃迁偶极子相互作用；而对于后者，偶极子取向则受限于平面SBL的几何结构。例如，当使用s偏振入射光（偏振方向垂直于入射面）时，若脂质染料的跃迁偶极子方向平行于膜，则染料在SBL中的激发效率高于在SUV中29,40 （如DiI或DiD）41-43。掺入此类荧光团的SUV在结合到SBL上时会显得较暗图7，代表性结果）。当融合孔打开并连接SUV与SBL膜时，荧光探针扩散进入SBL，更易被s偏振的衰逝场激发25,27,29因此，在染料从SUV转移到SBL的过程中，融合位点周围的荧光信号显著增强27 (图3 和 图7）。导致融合伴随信号变化的另一个因素是荧光标记在转移至SBL后因稀释而发生的去淬灭。在本实验所述的检测中，去淬灭的贡献通常远小于衰逝场衰减和偏振效应，因为仅有小部分（约等于符号及数学表示法中小于1%的百分比脂质的标记比例。

融合后信号的增加可用于推断融合孔的特性，方法是将脂质通过一个对脂质自由通透的孔逃逸所需的时间 Static equilibrium equation, ΣFx=0, formula symbol for force balance analysis in mechanics. 与实际释放时间 τ<sub>release</sub> symbol, kinetics concept, equation, chemical reaction analysis. 进行比较。如果这两个时间尺度相近，则可推断该孔对脂质流动的阻力很小。然而，如果实际释放时间显著长于扩散限制下的释放时间，则表明存在某种阻碍脂质释放的过程，例如孔道闪烁（pore flickering）。扩散限制下的释放时间 Static equilibrium equation, ΣFx=0, formula symbol for force balance analysis in mechanics. 取决于融合脂质体的尺寸和脂质的扩散系数；对其估算需要量化这两个参数。该检测方法具备单分子灵敏度，可在每次融合事件中，通过追踪脂质释放到SBL后的多个单分子脂质荧光探针来测量脂质扩散系数26。每个融合囊泡的尺寸均可被估算27，方法结合以下四个因素：(i) 单个脂质染料的强度，(ii) 融合后所有荧光探针转移至SBL时，停靠位点周围总荧光的变化，(iii) SUV脂质的已知标记密度，以及 (iv) 每个脂质所占面积。在大量融合事件中发现，实际脂质释放时间远慢于扩散控制释放所预期的时间27，这一点在先前假设SUV尺寸均一的研究中已有报道44。若假设脂质释放的延迟是由孔道闪烁所致，则可通过定量模型估算“孔道开放度”（pore openness），即融合过程中孔道保持开放状态的时间比例27。

在实际可行的情况下，使用脂质和可溶性内容物标记物来检测融合机制非常重要。例如，脂质释放可能受到除孔道闪烁之外其他过程的延迟，例如由围绕孔道的SNARE蛋白限制脂质扩散所致。如果情况如此，那么只要孔道足够大以允许可溶性探针通过，内容物的释放就会先于脂质标记物的释放。该方法中一个更根本的缺陷可能在于这样一种假设：标记脂质转移到SBL是通过一个狭窄的融合孔进行的，该孔连接着SBL和一个基本保持其融合前形态的囊泡。脂质向SBL的转移也可能源于融合孔的快速扩张，伴随着小单层囊泡（SUV）极快地塌陷进入SBL膜，这在此前仅基于脂质释放数据的研究中已有提示29。通过同时监测脂质和内容物的释放，研究发现许多孔道在释放全部脂质标记物后会重新闭合，但仍保留部分可溶性内含物27。这表明至少部分脂质体在融合后并未塌陷进入SBL，且脂质染料向SBL的转移是通过融合孔进行的。此外，脂质和内容物的释放是同时发生的27，因此脂质释放的延迟不太可能是由于孔道周围SNARE蛋白阻碍了脂质扩散所致45。

此前，Karatekin 和 Rothman 发表了一种未监测可溶性内容物释放的 SUV-SBL 融合方案25此处包含了近期的一些进展，即对脂质和内容物释放的同步监测，以及对SUV、脂质和融合孔特性的估算27该方案首先介绍微流控细胞的制备方法，即通过将含有沟槽的聚二甲基硅氧烷（PDMS）弹性体块与玻璃盖玻片键合而成25接下来，介绍同时含有脂质和内容物标记物的v-SUV的制备方法。第4和第5节提供了微流控芯片的组装以及SBLs形成的详细操作步骤。 原位 并检查缺陷和流动性，将v-SUV引入流动池以及检测融合事件。第6节提供数据分析的指导步骤。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

方案

1. 制备用于形成微流控通道的PDMS块

微加工过程示意图；纤维组装装置；光学显微镜；精密工具使用。
图1. 流动池模板的微加工及PDMS块的制备。 （A）适用于24 × 60 mm玻璃盖玻片（底部）的四通道流动池设计。顶部为六个相同设计在10 cm硅片上的排布方式。（B）使用打孔器切下一块厚度约为5–8 mm的PDMS。（C）使用镊子将管路插入打孔形成的孔洞中。请点击此处查看该图的放大版本。

  1. 获取一个流动池模板，如图1A所示。典型的通道宽度为0.3–1 mm，高度为70–100 µm，长度为1–2 cm。可在洁净室设施中使用标准光刻技术制备模板25，若无洁净室条件，也可直接订购。或者，可使用合适材料加工一个尺寸更大的模板。
    注意：洁净室工作人员可对无经验的使用者进行培训和指导（洁净室的使用权限仅限于经过适当培训的人员），内容包括掩模的设计与订购、晶圆清洗以及光刻工艺。一旦获得模板，只要将其保存在密闭培养皿中并注意防尘，即可在洁净室外重复使用。
  2. 在一次性塑料杯中配制约100 ml PDMS（硅弹性体基质）和约10 ml 交联剂（固化剂）的混合物。剪掉一次性移液管的尖端，以便更轻松地操作黏稠的PDMS。由于移液操作不准确，应使用天平称量PDMS加入塑料杯中。
  3. 充分搅拌混合物。将混合物置于真空干燥器中脱气约20分钟以去除大量气泡。当杯子处于真空状态时，气泡最初会膨胀，导致混合物体积显著增加。应控制施加的真空度，并确保杯子足够深，以避免溢出。
  4. 将脱气后的PDMS混合物滴加一大滴至玻璃培养皿（150 mm × 20 mm）中，然后将晶圆模板面朝上压入PDMS中。这样可避免晶圆下方困住气泡。若存在被困气泡，在放入烘箱加热时气泡会膨胀，可能导致晶圆倾斜。随后，在晶圆上方的模板上继续倒入脱气PDMS，直至覆盖约5–8 mm厚的PDMS层。若出现气泡，可用移液管尖端轻轻移除。
  5. 将PDMS在60 °C烘箱中烘烤3小时。确保培养皿处于水平状态。
  6. 使用新的手术刀刀片切下包含成型通道结构的PDMS块。切下的PDMS块需能适配盖玻片（见步骤4.1.9）。
  7. 将切下的PDMS块从培养皿中剥离，并放置在一块洁净的铝箔上。
    注意：交联后的PDMS块可保存数月。单个晶圆上包含6组流动通道（图1A），因此一次PDMS成型可制备6个PDMS块。切割出全部6个PDMS块后，清除松散的PDMS碎片，但在浇注和交联下一批PDMS时，无需移除剩余的PDMS，下一批所需PDMS量约为第一批的一半。良好的模板可使用数年。
  8. 使用打孔器以单一直线动作穿透PDMS块（图1B）。从通道凹槽一侧开始打孔。务必移除被打下的PDMS小圆柱。对四通道设计中的全部八个孔重复此操作。
  9. 将PDMS块的通道面朝下放置在一块新的无皱褶铝箔上。将该PDMS块存放在干燥箱中，最好置于干燥器内，可保存数月。
  10. 使用镊子将管路（内径0.25 mm，外径0.76 mm）插入打好的孔中约三分之一深度（图1C）。将管路斜切以便于插入。留出足够长度的管路，使其分别能够连接到SUV储液池和注射泵。在将组装好的芯片放置于显微镜上后，如管路过长，可再次剪短。
  11. 为连接泵的注射器，剪取一段较短的大口径硅胶管（内径0.51 mm，外径2.1 mm），并将较细的管子插入其中一端。此已组装完毕的PDMS模块可保存数月以备使用。

2. 盖玻片清洗

  1. 根据Karatekin和Rothman25所述方案，使用浓硫酸（H2SO4）与过氧化氢（H2O2）组成的强氧化性混合液清洗盖玻片。该操作应在洁净室中进行，并严格遵守安全操作规范。或者，可使用 commercially available 的洁净室清洗盖玻片（见材料列表）。

3. 含脂质和内容标记物的 v-SUVs 制备

使用碘克沙醇梯度离心装置进行病毒纯化的流程图。
图 2. SUV 制备示意图。 将脂质在玻璃试管中混合（1），通过在水浴中旋转试管蒸发溶剂以形成脂质膜（2）。在高真空条件下除去残留的微量溶剂（3）。在含有去垢剂和蛋白的重建缓冲液中，通过涡旋使脂质膜水合（4）。如果需要包封内容物染料，则在此步骤以及后续稀释步骤中加入染料（5）。将去垢剂浓度稀释至其临界胶束浓度以下，从而形成脂质体。去垢剂通过透析过夜去除（6）。对于用于 SBL 形成且包含 NBD-PE（绿色）的 t-SUV，将囊泡在密度梯度中上浮，并在两层之间的界面处收集（7a）。为了将包封了内容物标记物的 v-SUV 与游离染料分离，将样品通过尺寸排阻柱层析，并以 0.5 ml 的馏分收集（7b）。请点击此处查看该图的放大版本。

  1. 配制4 L重悬缓冲液，含25 mM HEPES-KOH、140 mM KCl 100 µM EGTA 和 1 mM DTT，pH 7.4。大部分缓冲液用于透析，另取 100 ml 用于其他步骤。
    注意： 可使用其他缓冲液，但重要的是在整个实验过程中保持缓冲液的渗透压一致，并选择能使蛋白质保持功能活性的条件。对于仅含脂质标记的v-SUVs以及t-SUVs的制备，请参照Karatekin和Rothman的方法。25.
  2. 由于脂质储存物保存在 -20 °C 在氯仿或氯仿:甲醇（2:1，v/v）中，打开前让离心管恢复至室温，以避免冷凝。
  3. 用氯仿冲洗玻璃管以去除微量去污剂，然后按所需比例混合脂质，最终体积为 1 µmol 在氯仿和甲醇（2:1，v/v）混合液中。处理有机溶剂或溶解的脂质时，仅使用玻璃注射器/试管。
    注意： 此处使用的脂质成分为 POPC:SAPE:DOPS:胆固醇:PEG2000-DOPE:DiD，摩尔比为 57.4:15:12:10:4.6:1，用于含 v-SNARE 的囊泡；以及 POPC:SAPE:DOPS:胆固醇:脑源性 PI(4,5)P₂2：PEG2000-DOPE:NBD-PE（54.9:15:12:10:3:4.6:0.5）用于t-SNARE SUV的制备。具体材料信息见材料部分。也可使用其他脂质组成。
  4. 在氮气流下或旋转蒸发仪中蒸发溶剂。将试管尖端浸入水浴中（37 °C加热至高于脂质最高熔点的温度，以形成均匀的脂质膜，并在蒸发溶剂过程中避免温度大幅变化。开始时将真空度设为约300 mbar，直至脂质膜形成，然后在旋转蒸发仪所能达到的最高真空度下继续抽真空约2分钟。
  5. 取下玻璃管，用铝箔包裹以避免光照，并将玻璃管置于高真空干燥器中至少2小时以除去残留溶剂。此步骤也可过夜进行。
  6. 为了水合干燥的脂质膜，需在重组缓冲液中配制去垢剂（正辛基-β-D-吡喃葡萄糖苷，OG）、蛋白质（v-SNAREs）和SRB的混合物500 µl 最终体积）。保持最终去垢剂浓度约为临界胶束浓度的2倍（OG的临界胶束浓度为20–25 mM），并调整最终体积，使去垢剂与脂质的比例为 >10. 轻轻振荡溶液，将磺酰罗丹明B（SRB）粉末溶解于蛋白-去垢剂溶液中，使SRB终浓度达到10–50 mM。当添加高浓度SRB时，需相应降低氯化钾浓度，以调节重建缓冲液的渗透压。
    注意： t-SNAREs 的脂质与蛋白质比例（LP）较高（LP ~20,000，每平方微米约含 70 个 t-SNAREs）25SBL中显著较高的t-SNARE密度可能导致形成失活的蛋白质聚集体，从而显著降低融合速率17,24. v-SNARE的脂质体比例要低得多（LP ~200，每个脂质体约含7,000个v-SNARE） µm2），接近突触小泡上v-SNARE的密度46,47为确保v-和t-SNARE在重组表达与纯化后的蛋白质功能，可进行简单的体相融合实验。48 在进行单个囊泡融合实验的各个步骤之前。
  7. 轻轻振荡含有干燥脂质膜的预热玻璃试管，同时加入步骤3.6中的蛋白-去污剂-SRB溶液。注意避免产生气泡。继续振荡15分钟，于 37 °C.
  8. 将去垢剂加入含SRB的重建缓冲液中（加入2 ml，终体积2.5 ml），快速涡旋振荡使其稀释五倍，以避免浓度梯度产生。随后继续振荡15分钟至1小时 37 °C.
    注意： 延长孵育时间可提高蛋白质重构效率。快速稀释使去垢剂浓度降至临界胶束浓度（CMC）以下，从而形成小型脂质体。
  9. 将囊泡悬液先在约1 L重构成缓冲液中于室温透析1-2小时，随后在3 L重构成缓冲液中过夜透析 4 °C 使用4 g聚苯乙烯吸附剂，通过20,000 MWCO透析管或透析盒进行透析。为防止交叉污染，应使用不同的烧杯分别对含有SRB和不含SRB的囊泡进行透析。
  10. 用重构缓冲液平衡凝胶过滤柱。将囊泡悬液上样至柱中，以分离游离的SRB与包封SRB的v-SUVs。待样品完全进入柱内后，使用不含SRB的重构缓冲液作为洗脱液。以0.5 ml馏分收集v-SUVs。
  11. 通过向囊泡等分试样中加入去垢剂前后测量SRB荧光，验证SRB在自猝灭浓度下的成功包封16使用荧光分光光度计，在550 nm处激发样品，并扫描570 nm至630 nm范围内的SRB发射光。加入去垢剂后，由于膜结构被溶解并释放出SRB使其稀释，SRB荧光信号预计将增加4至8倍，具体增幅取决于所包封的SRB含量。
  12. 使用荧光光谱法表征脂质和蛋白质的回收率24 以及SDS-PAGE凝胶电泳。请使用高灵敏度的染色方法，尤其是针对高脂蛋白含量的t-SUV样品（参见材料列表）。通常在制备过程中约有50%的脂质和蛋白质输入量损失，导致最终脂蛋白含量接近标称值。
  13. 使用动态光散射表征SUV的尺寸24 或电子显微镜技术48将含有SRB的v-SUVs储存于 4 °C 最长可保存约3-4天。切勿冷冻，因为冻融过程会破坏膜结构，导致包封的SRB释放。

4. 仅监测脂质释放的 SUV-SBL 融合实验

  1. 微流控流动通道内系留支撑双层膜的形成
    1. 将PDMS块（步骤1.11）在实验前置于高真空环境中至少20分钟，以去除溶解的气体。这可显著降低在融合实验过程中微流控通道内产生气泡的风险。
    2. 打开显微镜系统，加热载物台和样品 holder图3 和 4)至所需温度。
    3. 通过滤器过滤用于稀释囊泡的重构缓冲液 0.45 µm 或更小的孔径。
    4. 稀释 ~30 µl NBD-PE 标记的 t-SUVs 或无蛋白质（pf-SUVs）对照脂质体（储存液浓度 0.5–1 mM 脂质）与 ~60 µl 缓冲液的量。此处的终浓度并不关键。
    5. 使用3 ml注射器对混合物进行脱气。将注射器垂直放置，挤出样品上方大部分空气。用石蜡膜密封（无针头的）注射器尖端，通过向外拉动活塞创建真空。轻敲注射器筒以加速溶液脱气。重复此过程数次，直至施加真空时不再产生气泡。
    6. 使用直径略大于连接至PDMS块的管路的皮下注射针头，在微量离心管盖上打孔。确保被打下的塑料碎片不在管内，以免其后续堵塞连接微流控通道入口的管路。
    7. 将脱气的小单层囊泡（SUV）溶液注入带有孔洞的微量离心管中，盖上管盖，放入显微镜载物台上的样品架，使其平衡至设定温度。
    8. 将预先清洗过的盖玻片（第2节）放入等离子清洗仪中，通入空气等离子体处理约5分钟。将经等离子处理的盖玻片（处理面向上）置于几层无尘纸巾上，作为缓冲垫。
    9. 取下脱气后的PDMS块上的铝箔，将PDMS块放置在盖玻片上。重复使用PDMS块时，可在其通道面粘贴并撕下一片胶带以清洁表面。使用镊子轻轻按压PDMS块使其贴附于盖玻片，但切勿用力过猛，以免压碎玻璃。
    10. 将组装好的流动池放置在显微镜载物台上，并将管路分别连接至SUV储液池和注射泵。用胶带将盖玻片固定在载物台上图3B).
    11. 开始吸出SUVs 3 µl/min 直到溶液完全充满通道（约 2.25 mm/sec） 75 µm x 300 µm 通道横截面）。当所有通道的溶液开始从出口端的管路向上移动时，降低流速 0.5 µl/min 孵育30-45分钟。
      注意： 等离子体处理载玻片后，应尽快将小单层囊泡（SUVs）注入通道，间隔时间不应超过10–20分钟，因为等离子体处理效果是短暂的。
    12. 检查各通道是否有泄漏。使用10-20倍空气物镜观察含NBD-PE的t-SUVs或pf-SUVs中的NBD-PE荧光。采用488 nm激光激发NBD荧光基团。使用明场照明难以检测泄漏。
    13. 将装有脱气重悬缓冲液的试管放入支架中，并使温度达到平衡，因为温度的快速变化可能导致SBL出现缺陷。停止流动并等待约1分钟，确保流动完全停止，且在切换进样管至脱气缓冲液之前不会将气泡吸入管中。
    14. 用脱气缓冲液冲洗所有通道，以洗去未结合的SUVs。
    15. 切换至更高倍率的TIRF物镜（60倍，油镜，数值孔径1.45–1.49），并确认双层膜外观均匀，无明显的宏观缺陷，如暗斑或从SBL延伸出的脂质小管。
  2. 检测双层膜的流动性
    1. 如果无法获得专用的FRAP装置，或无法编程设置FRAP序列，则可按如下方法对膜流动性进行定性检测。
      1. 将视场光阑关闭至较小尺寸（~40 µm 直径）并通过软件调节488 nm激发光强度（20-80 µW，或 15-60 nW/µm2) 以显著但不完全地淬灭暴露区域内的NBD-PE荧光。对于流动性的双分子层，在稳态下，暴露区域中央的荧光强度应低于边缘，因为完整的NBD-PE分子进入暴露区域后，在被淬灭前会扩散一定距离。相反，如果表面附着的SUVs未能破裂，或由于其他原因导致支撑双分子层不具备流动性，则暴露区域内所有的荧光分子均应被完全淬灭。
        注意： 本步骤及后续步骤中的激光强度值仅作为粗略的起始参考，应根据具体实验条件进行优化。
      2. 停止光照，数分钟后重新开始，以验证稳态测量结果
    2. 如有可能，设置一个FRAP序列以进行更定量的测量。详见补充文件及其对应的图注。
      注意： 有时 SUV 会黏附在玻璃盖玻片上，但未能破裂并形成流动的双层膜。若发生此情况，用含有 10 mM Mg 的脱气重建缓冲液冲洗通道2+ 以促进支撑双层膜的形成。参照4.2步骤，利用荧光漂白评估双层膜流动性。一旦形成流动性的双层膜，用Mg冲洗2+无自由基的重建缓冲液
  3. 将v-SUVs引入微流控流动通道
    1. 使用 Degas 重悬缓冲液将 v-SUV 储存液稀释约 10 倍3 至 105 根据v-SUV储备液的浓度进行稀释，目标稀释度应使视野内每60秒发生约10-100个融合事件。
      注意： 融合事件过多会增加背景荧光（因为每次融合事件都会将LR-PE或DiD脂质标记物沉积到SBL中），从而导致融合事件的检测与分析困难。相反，若融合速率过低，则会导致统计结果不充分，或需要采集大量视频数据。当v-SUV的脂质浓度为0.1 mM时，可先进行稀释 5 µl SUV 储备库存 995 µl 重悬缓冲液，然后稀释5-50 µl 950 中的这一部分995 µl 重悬缓冲液
    2. 在停止流动并将进样管插入稀释的v-SUV溶液之前，需先让温度达到平衡。
    3. 调整TIRF角度和偏振如下。
      1. 通过旋转激发光束设定所需的偏振方向后，利用软件调节由步进电机控制的反射镜倾斜角度，从而改变光束的位置。缓慢将激光束从物镜后焦面的中心位置向一侧偏离中心移动。随着光束位置逐渐偏离中心，观察从物镜前侧出射的光线相对于物镜轴线的出射角度逐渐增大。
      2. 记录出射光束首次进入物镜时电机的位置， 即当首次实现全内反射时。
      3. 缓慢地继续将光束位置进一步偏离中心，同时监测表面的荧光信号。当光束偏离中心过远导致表面荧光消失时，记录此时的电机位置。
      4. 在上述确定的两个极限位置之间选择一个光束位置。为了获得最佳的信噪比以及融合时更明显的信号增强，应选择较浅的穿透深度（即光束位置更靠近物镜边缘），同时确保视场 illumination 均匀。
        注意： 在优化设置后，最好在所有实验中保持相同的全内反射光束位置（相同的穿透深度）。确保旋转偏振不会导致光束位置发生变化。
    4. 以设定流速将 v-SUVs 流入通道中 2 µl/min，对应于横截面约为1.5 mm/sec的平均线性流速 75 µm x 300 µm切换至激发/发射设置以监测脂质混合（仅限LR或DiD）。
  4. 观察单个v-SUV与SBL的融合

玻璃基底上的 v-SUV 与 t-SBL 示意图；单个 SUV-SBL 融合事件的伪彩 TIRFM 图像，显示脂质停靠（1）、脂质染料释放至 SBL（2），随后发生漂白及荧光强度下降（3）；5.3 µm x 5.3 µm 方框内像素值总和的总荧光强度信号图；显微镜装置示意图，包括注射泵、样品架。
图 3. 实验用 pTIRF 装置示意图。 （A）玻璃基底上 v-SUV 与 t-SBL 的示意图。单个 SUV-SBL 融合事件的伪彩 TIRFM 图像，显示脂质停靠（1）、脂质染料释放至 SBL（2），随后发生漂白及荧光强度下降（3）。图中显示总荧光强度信号（5.3 µm x 5.3 µm 方框内像素值之和）。（B）盖玻片与 PDMS 块键合后，用胶带固定在加热载物台上。微流控通道的进样管从金属样品架（右侧）中的试管吸取样品，由注射泵（左侧）驱动。泵下方为双通道发射装置。请点击此处查看该图的放大版本。

光学显微镜示意图；PDMS装置；EMCCD相机；激发、检测；光谱学。
图4. 实验装置示意图。 在微流控通道中的玻璃-缓冲液界面处产生衰逝波。SBL在玻璃表面形成，v-SUV从金属样品台（右上）经通道被吸入注射器（左上）。M，反射镜；DM，二向色镜；L，透镜；F，滤光片；P，偏振片。 请点击此处查看该图的放大版本。

  1. 使用561 nm（适用于LR-PE）或638 nm（适用于DiD）激光持续激发并监测v-SUV的荧光，具体波长选择取决于v-SUV中所掺入的荧光染料。当v-SUV进入流动通道并锚定至SBL，随后与SBL融合时，背景荧光信号开始累积。
  2. 通过软件调节激发激光强度，持续漂白背景荧光，使在稳态下能够清晰观察到新的锚定与融合事件。
    注意： 如果漂白速度过慢，背景荧光会过高；如果漂白速度过快，来自停靠的SUV以及释放到SBL中的荧光分子的信号将迅速衰减，从而缩短可检测停靠SUV融合或追踪荧光分子的时间窗口。对于在561 nm激发的LR-PE，使用2.5–7.5 mW功率照射一个 190 µm 直径圆（100-250 nW/µm2）是一个合理的起始值。对于DiD的638 nm激发，0.8–1.6 mW的功率较为适宜 190 µm 直径圆（30-60 nW/µm2可用于初步测试。
  3. 在给定通道的不同位置采集多段图像序列。通过检测NBD-PE荧光确认SBL在这些位置无缺陷。以最大帧率（约50帧/秒）采集整帧图像序列，或以更高帧率（最高约100 Hz）采集裁剪后的感兴趣区域图像序列，持续60秒。
  4. 转移到另一个微流控通道，并在其他条件下重复记录。设置阴性对照，如不含蛋白质的SBL或SUVs，加入可溶性v-SNARE VAMP2的胞质结构域（CDV）作为抑制剂，或用破伤风神经毒素处理v-SUV（30分钟，37°C）。 37 °C在同一盖玻片的一个或多个通道中。
  1. 清理与PDMS回收
    1. 为了重复使用PDMS模块，以5 µl/min的流速用约200 µl的70%乙醇冲洗微流控通道。最后通过管路和通道抽吸空气。
    2. 轻轻挤压PDMS模块，使其从盖玻片上脱离。将其放置在一张干净的铝箔上，并存放于真空干燥器中。该模块可重复使用多次。
    3. 如需更彻底的清洗，可在使用70%乙醇前，先用洗涤剂或氢氧化钠溶液冲洗通道。或者，在干燥并插入新的管路前，将所有管路从PDMS上移除，并将模块在异丙醇中进行超声处理30分钟。

5. 同时监测脂质和内容物释放的SUV-SBL融合实验

  1. 为同时监测脂质和可溶性内容物的双色释放，请遵循第4节中的相同步骤，但使用第3节所述的同时标记了脂质（DiD）和可溶性内容物（SRB）的脂质体。SRB的封装浓度为10 mM，初始状态下具有强烈的自猝灭效应。
  2. 采用图4所示的光路配置，分别使用561 nm和638 nm激光器同时激发SRB和DiD的荧光。通过一个640 nm的二向色镜将发射光分为两束，分别经过短波（595/50 nm）和长波（700/75 nm）滤光片，以分别检测SRB和DiD的发射信号。这两束发射光并排投射到EM-CCD芯片上。

6. 数据分析

  1. FRAP 数据分析
    1. 使用补充信息中提供的 MATLAB 程序估算脂质扩散系数， D该程序读取一份 OME-TIFF 文件列表49，检测漂白区域，绘制漂白区域内平均像素值随时间变化的曲线，并将所得的恢复曲线按Soumpasis模型进行拟合50 以提取恢复时间， 静态平衡方程 τ = w²/(4D)，扩散分析公式图表。，其中 w 是漂白圆圈的半径。
      注意： 之前已提供了一个 MATLAB 程序25 用于分析采用尼康 ND2 文件格式的 FRAP 成像数据。当前程序可读取 OME-TIFF 文件49，因为大多数文件格式都可以轻松转换为 OME-TIFF。当漂白是瞬时完成的、漂白区域为圆形且读取过程中的漂白可忽略不计时，FRAP 数据的定量分析最为简便且准确。尽管在本文所述的简单 FRAP 测量中这些条件并未被严格满足，但仍可获得对扩散系数的合理估计。若需更精确的估计，建议采用单个脂质染料的追踪方法（第 6.3 节）。
  2. 对接率、融合率及对接至融合延迟时间的分析
    1. 使用 ImageJ 打开待分析的视频，调节亮度和对比度，以清晰识别囊泡停靠与融合事件。启动 SpeckleTrackerJ26 插件。参见 Smith 等26 以及 SpeckleTrackerJ 的在线文档以获取使用说明。
    2. 在 SpeckleTrackerJ 中识别所有新停靠的 SUV。为区分紧密停靠在 SBL 上的 SUV 与在 SBL 上弹跳的 SUV，设定最小停靠时长为若干帧。保存轨迹，并对所有影片重复此操作。
      注意： 对于对接率，关键在于识别SUV何时发生对接，因此在这些轨迹中只需记录SUV首次对接的帧。其余的轨迹部分在分析中将不予考虑。然而，对每个SUV进行自动追踪直至其漂白或融合，有助于标记已被追踪过的SUV。
    3. 识别所有发生融合的囊泡。对于这些囊泡，轨迹应包含从单个小囊泡（SUV）停靠的首帧开始，直至被追踪斑点的荧光突然增强、显示出融合迹象的首帧为止的所有帧。这些轨迹的持续时间用于计算从停靠到融合的延迟。保存所有轨迹，并对所有视频重复此过程。
    4. 对于对接或融合数据的批量分析，从相关影片中汇编轨迹文件列表，并运行随 Karatekin 和 Rothman 提供的 MATLAB 程序25遵循随程序提供的说明进行操作。
      注意： 程序根据从轨迹文件中提取的信息，绘制出累积的停靠与融合事件随时间变化的曲线。停靠和融合速率通过这些曲线的斜率进行估算。对于融合数据，还计算从停靠到融合的延迟时间，并将其分布以生存曲线图表示。 即给定停靠时间延迟后融合尚未发生的概率。
  3. 脂质扩散系数
    1. 对于每一次融合事件，当单个荧光脂质扩散至远离融合位点并可被分辨时，对其进行追踪图6）。使用 SpeckleTrackerJ 进行追踪，并将轨迹保存以供后续使用 MATLAB 分析。根据融合囊泡的大小，通常可追踪 3–30 个单个荧光分子。由于更长的轨迹更有利于计算  静力平衡概念，ΣFx=0 公式，力学中的方程，教育关键词尽可能长时间地追踪单个分子，必要时可手动校正轨迹。
    2. 计算持续时间较长的单个脂质标记轨迹的均方位移（MSD） > 40-50 帧（约 ~1.5 秒）。使用 MSD 计算脂质扩散系数， 静力平衡概念，ΣFx=0 公式，力学中的方程，教育关键词。参见 Smith 等26 斯特拉顿 等27 详情请见。
  4. 单个脂质染料强度、SUV-SBL 强度降低因子和囊泡尺寸
    1. 测量脂质标记物在 3 x 3 像素（0.8 µm x 0.8 µm在标记物单步漂白前后各约15帧范围内，测量标记物周围区域的荧光强度。将漂白后帧的平均背景强度从漂白前帧的平均强度中减去，以获得被追踪脂质标记物的强度。对每段视频中尽可能多的标记物重复该测量。
    2. 绘制单个脂质标记强度的分布图， 静态平衡公式 \(I_{\text{lip}}\)，表示化学方程式中的亲脂性指数。，拟合高斯分布以估计均值。
    3. 计算膜融合发生与该事件中释放的单个脂质标记物的轨迹在单步漂白结束之间的时间延迟。获取荧光团在单分子漂白实验（SBL）中的漂白时间。 用于光漂白研究和显微镜结果数据分析中的 τ_bleach 方程符号。，通过绘制延迟的生存函数并拟合指数曲线。
      注意： 由于偏振激发场与小单层囊泡（SUV）上的荧光分子耦合作用较弱，SUV 的漂白时间通常要慢得多27.
    4. 估算 全内反射荧光（\( \lambda_{TIRF} \)）的方程表示，光学分析，根据Stratton所述，脂质染料在SUV中相对于在SBL中的强度衰减因子27 (全内反射荧光（\( \lambda_{TIRF} \)）的方程表示，光学分析静态平衡公式 \(I_{\text{lip}}\)，表示化学方程式中的亲脂性指数。 是 SUV 中单个染料的强度。
      注意： 如果漂白可忽略不计，  全内反射荧光（\( \lambda_{TIRF} \)）的方程表示，光学分析 将等于对接强度 It = Idock 方程，化学符号，用于描述对接相互作用能。 （第(1)点） 图3A，右侧面板），除以所有荧光团在融合后沉积到SBL时达到的总强度（虚线标注） 静态平衡，ΣFx=0 方程，描述性分析；适用于物理概念。 在 图3）。然而，由于SBL中荧光淬灭迅速， 静态平衡，ΣFx=0 方程，描述性分析；适用于物理概念。 通常无法达到，因此无法准确估计 全内反射荧光（\( \lambda_{TIRF} \)）的方程表示，光学分析 需要将释放动力学拟合到一个表达式27 包括两者 光漂白研究中用于数据分析的 τ_bleach 方程符号，显微镜结果。 （参见 6.4.3）以及 全内反射荧光（\( \lambda_{TIRF} \)）的方程表示，光学分析. 在斯特拉顿中提供了不同的表达方式 等27 对于孔径限制和扩散限制释放动力学的情况，最佳拟合情形因具体实验而异（孔径限制动力学情形见6.5.1节）。
    5.  根据单个事件计算囊泡面积27 静力平衡方程，A_ves 与 I_dock、λ_TIRF、脂质相互作用符号；教学公式，其中 It = Idock 方程，化学符号，用于描述分子对接相互作用能。 是停靠的SUV强度， 静态平衡公式 \(I_{\text{lip}}\)，表示化学方程式中的亲脂性指数。 是SBL中单个脂质染料的平均强度， 全内反射荧光（\( \lambda_{TIRF} \)）的方程表示，光学分析 是脂质染料在SUV中的强度相对于其在SBL中的强度的降低因子，以及 ρ<sub>lip</sub> 表示脂质密度计算的符号，生化分析中的概念。 已知的脂质染料面密度。
  5. 融合孔特性 
    1. 假设释放过程受孔道限制，将脂质标记物的释放动力学拟合至 27  光漂白分析的指数衰减数学公式，方程示意图，其中 融合电流符号 \( I_{\text{fus}} \)，与科学研究中的电磁学方程相关。 是融合前停靠的SUV强度，其他参数定义同前。使用该值 用于光漂白研究和显微镜结果数据分析中的τ_bleach方程符号。 在6.4.3中作为固定参数获得，并提取最佳拟合估计值  全内反射荧光（\( \lambda_{TIRF} \)）的方程表示，光学分析 和 τ<sub>release</sub> 符号用于动态系统分析中的释放时间常数。.
    2. 估算孔道开放的时间比例， P0，假设脂质释放的延迟是由于孔道闪烁所致27: 静力平衡 ΣFx=0 方程示意图；关键词：力的平衡，力学原理 = 静力平衡方程；符号；教育；ΣFx=0；研究分析，其中 A囊泡 是囊泡面积（第 6.4.5 节），b 是孔道高度（通常取值约为 ~15 nm）， rp ≈ 3 nm 是扩散性脂质标记物所观测到的有效孔半径，其中包括约一半的双层膜厚度（~2 nm）。 静力平衡概念，ΣFx=0 公式，力学中的方程，教育关键词 是脂质扩散系数（在6.3中计算），以及 τ<sub>release</sub> 符号用于动态系统分析中的释放时间常数。是脂质从小型单层囊泡（SUV）释放到固相双层脂质膜（SBL）所需的时间（参见6.5.1）。
    3. 为验证某一名义上的 P0 > 1 表示完全开放的孔道， P0 = 1，将强度时间过程拟合到Stratton的方程4 等27，永久开放孔道的预测动力学。该拟合应优于使用6.5.1中永久开放孔道表达式的拟合结果。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

结果

SBL 质量

在融合实验之前，必须验证SBL的质量和流动性。微流控通道底部玻璃侧的荧光应均匀，无任何明显缺陷。如果气泡通过通道，通常会在SBL上留下可见的痕迹。若存在此类大范围的痕迹或缺陷，则不应使用该通道。有时SUV可能附着在基底上，但未能破裂并形成连续的SBL。在这种情况下，荧光可能仍然显得非常均匀，但在对小区域进行漂白后不会恢复。引入10 mM Mg2+通常有助于解决此问题。也可添加其他试剂以促进SUV破裂，例如其他二价阳离子51、聚合物溶液52或渗透冲击25。

即使荧光基本均匀且在漂白后能够恢复，仍可能有部分未融合的小单层囊泡（SUV）保持完整地存在于表面。如果这些脂质体足够大，会呈现为明亮的斑点。当对包...

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

讨论

成功实施本文所述的SUV-SBL融合实验在很大程度上依赖于若干关键步骤，例如将蛋白质功能性地重组至脂质体中、获得高质量的SBLs，以及选择合适的成像参数以检测单个分子。尽管该实验的成功可能需要一定的时间和努力，但一旦建立，便可提供其他方法无法获得的关于融合过程的丰富信息 体外 引言中讨论的融合实验。可确定小单层囊泡（SUV）与支撑双层膜（SBL）结合和融合的速率、结合至融合时间的分布、脂质扩散系数、每个融合脂质体的尺寸，以及特定融合事件中的脂质释放是受扩散控制还是孔道控制。如果释放速度远慢于扩散预期，则采用假设孔道闪烁导致脂质释放减缓的模型可解释该现象。 P0 融合过程中孔道开放时间所占的比例27.

先前针对单个 SUV-SUV 融合的研究18-20,28 或脂质体和病毒颗粒与SBLs的融合15-17,21,22,33,44 依赖于染料分子之间的FRET和自猝灭效应。相比之下，我们主要避免使用染料去猝灭来研究脂质标记物向SBL转移的动力学，原因有二。首先，FR...

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

披露

作者声明不存在任何竞争性经济利益。

致谢

我们感谢弗拉基米尔·波列亚耶夫（Vladimir Polejaev，耶鲁大学西校区成像中心）在偏振全内反射荧光显微镜的设计与构建方面所做的工作，感谢戴维·巴德利（David Baddeley，耶鲁大学）在双色检测仪器方面的协助，感谢詹姆斯·E·罗斯曼（James E. Rothman，耶鲁大学）、本·奥沙利文（Ben O'Shaughnessy，哥伦比亚大学）及其研究团队成员富有启发性的讨论。EK 获得了卡夫里基金会卡夫里神经科学学者奖以及美国国立卫生研究院（NIH）资助项目 1R01GM108954 的支持。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
试剂
Milli-Q (MQ) 水默克密理博
KOHJ.T. Baker3040-05
乙醇 190 Proof去卷积
异丙醇Fisher ChemicalA416P4
HEPESAmericanBioAB00892
氯化钠 (KCl)AmericanBioAB01915
二硫苏糖醇AmericanBioAB00490
N-[2-羟乙基]哌嗪-N'-[2-乙磺酸] (HEPES)AmericanBioAB00892
EGTAAcros Organics409911000
缓冲液
HEPES-KOH 缓冲液（pH 7.4）25 mM HEPES-KOH, 140 毫摩尔 KCl，100 μM EGTA, 1 mM DTT
溶剂
氯仿 J.T. Baker9180-01置于玻璃瓶中，注意：穿戴个人防护装备
甲醇J.T. Baker9070-03置于玻璃瓶中，注意：穿戴个人防护装备
脂质体的制备
耐压 Hamilton 注射器Hamilton不同尺寸仅使用玻璃注射器与溶剂（氯仿/甲醇，2:1，v/v）
Pyrex Vista 11 ml 玻璃管，16x100 mm 螺口培养管派热克斯 70825-16彻底清洁，用氯仿冲洗
1-棕榈酰-2-油酰-sn-甘油-3-磷胆碱，16:0-18:1 PC（POPC）Avanti Polar Lipids850457脂质以氯仿（CHCl₃）溶解形式提供3 或以密封小瓶中的冻干粉末形式保存。开启后分装。额外部分以干燥脂质膜形式保存于-20℃惰性气体环境中 °C. 将储备液保存在 CHCl 中3/MeOH（2:1，v/v）在 -20 °C. 在打开前让其恢复至室温
1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸-L-丝氨酸（钠盐），18:1 PS（DOPS）Avanti Polar Lipids840035在普遍存在的膜融合过程中，融合孔的开放建立了两个原先分离的区室之间的首次连接。在通过胞吐作用释放神经递质或激素的过程中，融合孔可短暂地反复开放与关闭，从而调控货物分子的释放动力学。孔道动力学还决定了囊泡回收的模式：不可逆的重新闭合导致瞬时性的“接触—释放”（kiss-and-run）融合，而孔道扩张则导致完全融合。为了更好地理解调控孔道动力学的因素，我们开发了一种检测膜融合的实验方法，该方法在生化定义明确的体外系统中，利用偏振全内反射荧光（TIRF）显微镜实现单分子灵敏度和约15毫秒的时间分辨率。实验中监测含有v-SNARE蛋白的荧光标记小单层囊泡（v-SUVs）与承载t-SNARE的平面双层膜（t-SBL，t-支撑双层膜）之间的融合，后者被支撑在柔软的聚合物垫上。该检测利用微流控流动通道，确保样品消耗极小，同时提供恒定密度的SUVs。通过利用融合过程中脂质标记物从SUV转移到SBL时产生的快速信号增强，监测脂质染料转移的动力学。TIRF显微镜的灵敏度允许追踪单个荧光脂质标记物，从而在每次融合事件中推导出脂质扩散系数和SUV大小。脂质染料释放时间可能远长于永久开放孔道中无阻碍通过所预期的时间。利用假设脂质释放减缓源于孔道闪烁（flickering）的模型，可估算孔道“开放度”，即融合过程中孔道保持开放状态的时间比例。可在SUVs中包封可溶性标记物，以同时监测脂质和可溶性货物的释放。此类测量表明，某些孔道在丢失部分可溶性货物后可能重新闭合。
1-十八烷酰-2-花生四烯酰-sn-甘油-3-磷脂酰乙醇胺，18:0-20:4 PE（SAPE）Avanti Polar Lipids850804在普遍存在的膜融合过程中，融合孔的打开建立了两个原先分离的区室之间的首次连接。在通过胞吐作用释放神经递质或激素的过程中，融合孔可短暂地反复开放与关闭，从而调控货物分子的释放动力学。孔道动力学还决定了囊泡回收的模式：不可逆的重新闭合导致瞬时性的“接触—释放”（kiss-and-run）融合，而孔道扩张则导致完全融合。为了更好地理解调控孔道动力学的因素，我们开发了一种检测膜融合的实验方法，该方法在生化定义明确的体外系统中，利用偏振全内反射荧光（TIRF）显微镜实现单分子灵敏度和约15毫秒的时间分辨率。实验中监测含有v-SNARE蛋白的荧光标记小单层囊泡（v-SUVs）与承载t-SNARE的平面双层膜（t-SBL，t-支撑双层膜）之间的融合，后者支撑于柔软的聚合物垫上。该检测利用微流控流动通道，确保样品消耗极小，同时提供恒定密度的SUVs。通过利用融合过程中脂质标记物从SUV转移到SBL时产生的快速信号增强，监测脂质染料转移的动力学。TIRF显微镜的灵敏度允许追踪单个荧光脂质标记物，从而在每次融合事件中推导出脂质扩散系数和SUV大小。脂质染料释放时间可能远长于永久开放孔道中无阻碍通过所预期的时间。使用一种假设脂质释放受阻源于孔道闪烁（flickering）的模型，可估算出孔道“开放度”（openness），即融合过程中孔道保持开放状态的时间比例。可在SUVs中包封可溶性标记物，以同时监测脂质和可溶性货物的释放。此类测量表明，某些孔道在丢失部分可溶性货物后可能重新闭合。
L-α磷脂酰肌醇-4,5-二磷酸（脑组织，猪）（铵盐），脑组织 PI(4,5)P₂2Avanti Polar Lipids840046在普遍存在的膜融合过程中，融合孔的打开建立了两个原先分离的区室之间的首次连接。在通过胞吐作用释放神经递质或激素的过程中，融合孔可短暂地反复开放与关闭，从而调控货物分子的释放动力学。孔道动力学还决定了囊泡回收的模式：不可逆的重新闭合导致瞬时性的“接触—释放”（kiss-and-run）融合，而孔道扩张则导致完全融合。为了更好地理解调控孔道动力学的因素，我们开发了一种检测膜融合的实验方法，该方法在生化定义明确的体外系统中，利用偏振全内反射荧光（TIRF）显微镜实现单分子灵敏度和约15毫秒的时间分辨率。实验中监测含有v-SNARE蛋白的荧光标记小单层囊泡（v-SUVs）与承载t-SNARE的平面双层膜（t-SBL，t-支撑双层膜）之间的融合，后者被支撑在柔软的聚合物垫上。该检测利用微流控流动通道，确保样品消耗极小，同时提供恒定密度的SUVs。通过利用融合过程中脂质标记物从SUV转移到SBL时产生的快速信号增强，监测脂质染料转移的动力学。TIRF显微镜的高灵敏度可追踪单个荧光脂质标记物，从而在每次融合事件中推导出脂质扩散系数和SUV大小。脂质染料释放时间可能远长于永久开放孔道中无阻碍通过所预期的时间。通过假设脂质释放减缓源于孔道的闪烁（flickering），可建立模型估算孔道“开放度”——即融合过程中孔道保持开放状态的时间比例。此外，可在SUV内包封可溶性标记物，以同时监测脂质与可溶性货物的释放。此类测量表明，部分孔道在释放部分可溶性货物后可能发生重新闭合。
1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酰乙醇胺-N-(7-硝基-2-1,3-苯并噁二唑-4-基)（铵盐），18:1 NBD PEAvanti Polar Lipids810145在普遍存在的膜融合过程中，融合孔的打开建立了两个原先分离的区室之间的首次连接。在通过胞吐作用释放神经递质或激素的过程中，融合孔可短暂地反复开放与关闭，从而调控货物分子的释放动力学。孔道动力学还决定了囊泡回收的模式：不可逆的重新闭合导致瞬时性的“接触—释放”（kiss-and-run）融合，而孔道扩张则导致完全融合。为了更好地理解调控孔道动力学的因素，我们开发了一种检测膜融合的实验方法，该方法在生化定义明确的体外系统中，利用偏振全内反射荧光（TIRF）显微镜实现单分子灵敏度和约15毫秒的时间分辨率。实验中监测含有v-SNARE蛋白的荧光标记小单层囊泡（v-SUVs）与承载t-SNARE的平面双层膜（t-SBL，t-支撑双层膜）之间的融合，后者支撑于柔软的聚合物缓冲层上。该检测利用微流控流动通道，确保样品消耗极小，同时提供恒定密度的SUVs。通过利用融合过程中脂质标记物从SUV转移到SBL时产生的快速信号增强，监测脂质染料转移的动力学。TIRF显微镜的灵敏度允许追踪单个荧光脂质标记物，从而在每次融合事件中推导出脂质扩散系数和SUV大小。脂质染料释放时间可能远长于永久开放孔道中无阻碍通过所预期的时间。使用一种假设脂质释放受阻源于孔道闪烁（flickering）的模型，可估算孔道“开放度”（openness），即融合过程中孔道保持开放状态的时间比例。可在SUVs中包封可溶性标记物，以同时监测脂质和可溶性货物的释放。此类测量表明，某些孔道在丢失部分可溶性货物后可能重新闭合。
1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酰乙醇胺-N-[甲氧基(聚乙二醇)-2000]（铵盐），18:1 PEG2000 PEAvanti Polar Lipids880130在普遍存在的膜融合过程中，融合孔的打开建立了两个原先分离的区室之间的首次连接。在通过胞吐作用释放神经递质或激素的过程中，融合孔可短暂地反复开放与关闭，从而调控货物分子的释放动力学。孔道动力学还决定了囊泡回收的模式：不可逆的重新闭合导致瞬时性的“接触—释放”（kiss-and-run）融合，而孔道扩张则导致完全融合。为了更好地理解调控孔道动力学的因素，我们开发了一种检测膜融合的实验方法，该方法在生化体系明确的体外系统中，利用偏振全内反射荧光（TIRF）显微镜实现单分子灵敏度和约15毫秒的时间分辨率。实验中监测含有v-SNARE蛋白的荧光标记小单层囊泡（v-SUVs）与承载t-SNARE蛋白并支撑于软性聚合物垫上的平面双层膜（t-SBL，t-支撑双层膜）之间的融合过程。该检测方法采用微流控流动通道，可在持续提供恒定密度SUVs的同时最大限度减少样品消耗。利用融合过程中脂质标记物从SUV转移到SBL时产生的快速信号增强，监测脂质染料转移的动力学。TIRF显微镜的高灵敏度可追踪单个荧光脂质标记物，从而在每次融合事件中推导出脂质扩散系数和SUV的尺寸。脂质染料的释放时间可能远长于永久开放孔道中无阻碍通过所预期的时间。通过假设脂质释放减缓源于孔道的闪烁行为（pore flickering）的模型，可估算出孔道“开放度”（openness），即融合过程中孔道保持开放状态的时间比例。此外，可在SUVs中包封可溶性标记物，以同时监测脂质与可溶性货物的释放。此类测量结果表明，部分融合孔可能在释放部分可溶性货物后重新闭合。
胆固醇（绵羊毛， >98%)Avanti Polar Lipids700000在普遍存在的膜融合过程中，融合孔的打开建立了两个原先相互分离的区室之间的首次连接。在通过胞吐作用释放神经递质或激素的过程中，融合孔可发生瞬时的反复开放与关闭，从而调控货物分子的释放动力学。孔道动力学还决定了囊泡回收的模式：不可逆的重新闭合导致短暂的“接触—释放”（kiss-and-run）式融合，而孔道扩张则导致完全融合。为了更好地理解调控孔道动力学的因素，我们开发了一种检测膜融合的实验方法，该方法在生化体系明确的体外系统中，利用偏振全内反射荧光（TIRF）显微镜实现单分子灵敏度和约15毫秒的时间分辨率。实验中监测含有v-SNARE蛋白的荧光标记小单层囊泡（v-SUVs）与承载t-SNARE蛋白并支撑于软性聚合物垫上的平面双层膜（t-SBL，t-支撑双层膜）之间的融合过程。该检测方法采用微流控流动通道，确保样品消耗极小，同时提供恒定密度的SUVs。通过利用融合过程中脂质标记物从SUV转移到SBL时产生的快速信号增强，监测脂质染料转移的动力学。TIRF显微镜的高灵敏度可追踪单个荧光脂质标记物，从而在每次融合事件中推导出脂质扩散系数和SUV的尺寸。脂质染料释放时间可能远长于永久开放孔道中无阻碍通过所预期的时间。通过假设脂质释放减缓源于孔道的闪烁（flickering），可建立模型估算孔道“开放度”（openness），即融合过程中孔道保持开放状态的时间比例。此外，可将可溶性标记物包封于SUVs中，以同时监测脂质与可溶性货物的释放。此类测量结果表明，部分融合孔可能在释放部分可溶性货物后重新闭合。
DiD' 油；DiIC18(5) 油（1,1'-二辛基-3,3,3',3'-四甲基吲哚二碳菁高氯酸盐）分子探针D-307
Rotavapor R-210布希R-210高于所用脂质相变温度（Tm）的恒温环境
OG 正辛基-β-D-葡萄糖吡喃糖苷Affymetrix0311-20 保存 °C，让其在打开前恢复至室温
Shaker - Eppendorf Thermomixer REppendorf
Slide-A-Lyze 透析盒，20k MWCO，3 个 毫升Life Technologies66003
Bio-Beads SM-2 吸附剂Bio-Rad1523920
OptiPrep 密度梯度介质Sigma-AldrichD1556
超速离心管，薄壁，Ultra-Clear，13.2 毫升，14 × 89 毫米Beckman Coulter41121703
Beckman SW41 Ti 转子
磺酰罗丹明B分子探针S-1307
Econo-Column 色谱柱，2.5 × 10 cm伯乐（Bio-Rad）7372512
Sepharose CL-4BGE Healthcare17-0150-01
SYPRO Orange 蛋白凝胶染色剂分子探针S-6650DMSO 中的 5,000 倍浓缩液
PDMS 块
Sylgard 184 硅弹性体试剂盒，PDMS道康宁3097358-1004
Pyrex 玻璃培养皿，150 × 20 mm，带盖康宁3160-152
打孔器 - 可重复使用活检打孔针，0.75 毫米World Precision Instruments504529
手动打孔机 SYNEOMHPM-UNV
钻头，直径0.035 × 0.026 × 长度1.5，304不锈钢，TiN涂层，圆形冲头SYNEOCR0350265N20R4钻头直径：0.9 mm，冲孔孔径：0.74 mm
Tygon Microbore 软管，内径 0.25 mm，外径 0.76 mmCole-Parmer06419-000.010" ID，0.030" 光密度
硅胶管（内径 0.51 mm，外径 2.1 mm）Cole-Parmer95802-000.020" 0.083" 光密度
盖玻片 - 洁净室清洗
Schott Nexterion 盖玻片玻璃 DSchott1472305
等离子清洗机HarrickPDC-32G
pTIRF装置与配件
IX81 显微镜机身OlympusIX81
EM CCD相机Andorixon-ultra-897
Thermo Plate，加热显微镜载物台东海日立MATS-U52RA26
1 ml 汉密尔顿玻璃注射器（4 个）Hamilton81365
注射泵kd ScientificKDS-230

参考文献

  1. Sudhof, T. C., Rothman, J. E. Membrane fusion: grappling with SNARE and SM proteins. Science. 323, 474-477 (2009).
  2. Wickner, W., Schekman, R. Membrane fusion. Nat Struct Mol Biol. 15, 658-664 (2008).
  3. Harrison, S. C. Viral membrane fusion. Nat Struct Mol Biol. 15, 690-698 (2008).
  4. Jahn, R., Scheller, R. H. SNAREs--engines for membrane fusion. Nat Rev Mol Cell Biol. 7, 631-643 (2006).
  5. Lindau, M., Alvarez de Toledo, G. The fusion pore. Biochim Biophys Acta. 1641, 167-173 (2003).
  6. Staal, R. G., Mosharov, E. V., Sulzer, D. Dopamine neurons release transmitter via a flickering fusion pore. Nat Neurosci. 7, 341-346 (2004).
  7. Wu, Z., et al. Nanodisc-cell fusion: Control of fusion pore nucleation and lifetimes by SNARE protein transmembrane domains. Sci. Rep. 6, 27287(2016).
  8. Alabi, A. A., Tsien, R. W. Perspectives on kiss-and-run: role in exocytosis, endocytosis, and neurotransmission. Ann Rev Physiol. 75, 393-422 (2013).
  9. Rossetto, O., Pirazzini, M., Montecucco, C. Botulinum neurotoxins: genetic, structural and mechanistic insights. Nature Rev Microbiol. 12, 535-549 (2014).
  10. Weber, T., et al. SNAREpins: minimal machinery for membrane fusion. Cell. 92, 759-772 (1998).
  11. Nickel, W., et al. Content mixing and membrane integrity during membrane fusion driven by pairing of isolated v-SNAREs and t-SNAREs. Proc Natl Acad Sci U S A. 96, 12571-12576 (1999).
  12. McNew, J. A., et al. Compartmental specificity of cellular membrane fusion encoded in SNARE proteins. Nature. 407, 153-159 (2000).
  13. Melia, T. J., You, D. Q., Tareste, D. C., Rothman, J. E. Lipidic antagonists to SNARE-mediated fusion. J Biol Chem. 281, 29597-29605 (2006).
  14. Hernandez, J. M., et al. Membrane fusion intermediates via directional and full assembly of the SNARE complex. Science. 336, 1581-1584 (2012).
  15. Fix, M., et al. Imaging single membrane fusion events mediated by SNARE proteins. Proc Natl Acad Sci U S A. 101, 7311-7316 (2004).
  16. Bowen, M. E., Weninger, K., Brunger, A. T., Chu, S. Single molecule observation of liposome-bilayer fusion thermally induced by soluble N-ethyl maleimide sensitive-factor attachment protein receptors (SNAREs). Biophys J. 87, 3569-3584 (2004).
  17. Liu, T., Tucker, W. C., Bhalla, A., Chapman, E. R., Weisshaar, J. C. SNARE-driven, 25-millisecond vesicle fusion in vitro. Biophys J. 89, 2458-2472 (2005).
  18. Yoon, T. Y., Okumus, B., Zhang, F., Shin, Y. K., Ha, T. Multiple intermediates in SNARE-induced membrane fusion. Proc Natl Acad Sci U S A. 103, 19731-19736 (2006).
  19. Diao, J., et al. A single-vesicle content mixing assay for SNARE-mediated membrane fusion. Nat Commun. 1, 1-6 (2010).
  20. Kyoung, M., et al. In vitro system capable of differentiating fast Ca2+-triggered content mixing from lipid exchange for mechanistic studies of neurotransmitter release. Proc Natl Acad Sci U S A. 108, E304-E313 (2011).
  21. Domanska, M. K., Kiessling, V., Stein, A., Fasshauer, D., Tamm, L. K. Single vesicle millisecond fusion kinetics reveals number of SNARE complexes optimal for fast SNARE-mediated membrane fusion. J Biol Chem. 284, 32158-32166 (2009).
  22. Kreutzberger, A. J., Kiessling, V., Tamm, L. K. High Cholesterol Obviates a Prolonged Hemifusion Intermediate in Fast SNARE-Mediated Membrane Fusion. Biophys J. 109, 319-329 (2015).
  23. Schwenen, L. L., et al. Resolving single membrane fusion events on planar pore-spanning membranes. Sci Rep. 5, 12006(2015).
  24. Karatekin, E., et al. A fast, single-vesicle fusion assay mimics physiological SNARE requirements. Proc Natl Acad Sci U S A. 107, 3517-3521 (2010).
  25. Karatekin, E., Rothman, J. E. Fusion of single proteoliposomes with planar, cushioned bilayers in microfluidic flow cells. Nat Protoc. 7, 903-920 (2012).
  26. Smith, M. B., et al. Interactive, computer-assisted tracking of speckle trajectories in fluorescence microscopy: application to actin polymerization and membrane fusion. Biophys J. 101, 1794-1804 (2011).
  27. Stratton, B. S., et al. Cholesterol Increases the Openness of SNARE-mediated Flickering Fusion Pores. Biophysical journal. 110, (2016).
  28. Diao, J., et al. Synaptic proteins promote calcium-triggered fast transition from point contact to full fusion. Elife. 1, e00109(2012).
  29. Kiessling, V., Domanska, M. K., Tamm, L. K. Single SNARE-mediated vesicle fusion observed in vitro by polarized TIRFM. Biophys J. 99, 4047-4055 (2010).
  30. Blasi, J., et al. Botulinum neurotoxin A selectively cleaves the synaptic protein SNAP-25. Nature. 365, 160-163 (1993).
  31. Washbourne, P., et al. Genetic ablation of the t-SNARE SNAP-25 distinguishes mechanisms of neuroexocytosis. Nat Neurosci. 5, 19-26 (2002).
  32. Diaz, A. J., Albertorio, F., Daniel, S., Cremer, P. S. Double cushions preserve transmembrane protein mobility in supported bilayer systems. Langmuir. 24, 6820-6826 (2008).
  33. Floyd, D. L., Ragains, J. R., Skehel, J. J., Harrison, S. C., van Oijen, A. M. Single-particle kinetics of influenza virus membrane fusion. Proc Natl Acad Sci U S A. 105, 15382-15387 (2008).
  34. Albertorio, F., et al. Fluid and air-stable lipopolymer membranes for biosensor applications. Langmuir. 21, 7476-7482 (2005).
  35. Daniel, S., Albertorio, F., Cremer, P. S. Making lipid membranes rough, tough, and ready to hit the road. Mrs Bulletin. 31, 536-540 (2006).
  36. Gao, Y., et al. Single reconstituted neuronal SNARE complexes zipper in three distinct stages. Science. 337, 1340-1343 (2012).
  37. Kenworthy, A. K., Hristova, K., Needham, D., Mcintosh, T. J. Range and Magnitude of the Steric Pressure between Bilayers Containing Phospholipids with Covalently Attached Poly(Ethylene Glycol). Biophys J. 68, 1921-1936 (1995).
  38. Knoll, W., et al. Solid supported lipid membranes: New concepts for the biomimetic functionalization of solid surfaces. Biointerphases. 3, Fa125-Fa135 (2008).
  39. Quinn, P., Griffiths, G., Warren, G. Density of newly synthesized plasma membrane proteins in intracellular membranes II. Biochemical studies. J Cell Biol. 98, 2142-2147 (1984).
  40. Sund, S. E., Swanson, J. A., Axelrod, D. Cell membrane orientation visualized by polarized total internal reflection fluorescence. Biophys J. 77, 2266-2283 (1999).
  41. Johnson, D. S., Toledo-Crow, R., Mattheyses, A. L., Simon, S. M. Polarization-controlled TIRFM with focal drift and spatial field intensity correction. Biophys J. 106, 1008-1019 (2014).
  42. Anantharam, A., Onoa, B., Edwards, R. H., Holz, R. W., Axelrod, D. Localized topological changes of the plasma membrane upon exocytosis visualized by polarized TIRFM. J Cell Biol. 188, 415-428 (2010).
  43. Axelrod, D. Carbocyanine dye orientation in red cell membrane studied by microscopic fluorescence polarization. Biophys J. 26, 557-573 (1979).
  44. Wang, T., Smith, E. A., Chapman, E. R., Weisshaar, J. C. Lipid mixing and content release in single-vesicle, SNARE-driven fusion assay with 1-5 msec resolution. Biophys J. 96, 4122-4131 (2009).
  45. Chernomordik, L. V., Frolov, V. A., Leikina, E., Bronk, P., Zimmerberg, J. The pathway of membrane fusion catalyzed by influenza hemagglutinin: restriction of lipids, hemifusion, and lipidic fusion pore formation. J Cell Biol. 140, 1369-1382 (1998).
  46. Takamori, S., et al. Molecular anatomy of a trafficking organelle. Cell. 127, 831-846 (2006).
  47. Wilhelm, B. G., et al. Composition of isolated synaptic boutons reveals the amounts of vesicle trafficking proteins. Science. 344, 1023-1028 (2014).
  48. Scott, B. L., et al. Liposome fusion assay to monitor intracellular membrane fusion machines. Methods Enzymol. 372, 274-300 (2003).
  49. Linkert, M., et al. Metadata matters: access to image data in the real world. J Cell Biol. 189, 777-782 (2010).
  50. Soumpasis, D. M. Theoretical analysis of fluorescence photobleaching recovery experiments. Biophys J. 41, 95-97 (1983).
  51. Ohki, S. A mechanism of divalent ion-induced phosphatidylserine membrane fusion. Biochim Biophys Acta. 689, 1-11 (1982).
  52. Berquand, A., et al. Two-step formation of streptavidin-supported lipid bilayers by PEG-triggered vesicle fusion. Fluorescence and atomic force microscopy characterization. Langmuir. 19, 1700-1707 (2003).
  53. Tamm, L. K., McConnell, H. M. Supported phospholipid bilayers. Biophys J. 47, 105-113 (1985).
  54. Rawle, R. J., van Lengerich, B., Chung, M., Bendix, P. M., Boxer, S. G. Vesicle fusion observed by content transfer across a tethered lipid bilayer. Biophys J. 101, L37-L39 (2011).
  55. Wagner, M. L., Tamm, L. K. Reconstituted syntaxin1a/SNAP25 interacts with negatively charged lipids as measured by lateral diffusion in planar supported bilayers. Biophys J. 81, 266-275 (2001).
  56. Kalb, E., Frey, S., Tamm, L. K. Formation of Supported Planar Bilayers by Fusion of Vesicles to Supported Phospholipid Monolayers. Biochimica Et Biophysica Acta. 1103, 307-316 (1992).

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

重印与许可

标签

支撑双层膜脂质染料转移囊泡融合事件荧光恢复偏振激发可溶性货物释放融合孔动态
微流控流动池中通过偏振全内反射荧光显微镜监测单个蛋白脂质体与锚定支撑双层膜的SNARE介导融合
联系我们
向图书馆推荐

隐私政策

使用条款

政策

版权所有 © 2026 MyJoVE Corporation。保留所有权利。