本文介绍了一种利用偏振全内反射荧光显微镜（TIRFM），在微流控通道中以单分子灵敏度和约15毫秒时间分辨率检测脂质体与支撑双层膜之间由SNARE介导的单个融合事件的实验方案。该方法可同时检测脂质和可溶性货物的释放，并可测量脂质体尺寸、脂质扩散系数以及融合孔的特性。
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摘要
摘要
在普遍存在的膜融合过程中，融合孔的打开建立了两个原先相互分离的区室之间的首次连接。在通过胞吐作用释放神经递质或激素的过程中，融合孔可短暂地反复开放与关闭，从而调控 cargo 分子的释放动力学。孔道动力学还决定了囊泡回收的方式；不可逆的重新闭合导致瞬时性 "吻-运行" 融合，而扩张则导致完全融合。为了更好地理解调控孔道动态的因素，我们开发了一种检测膜融合的实验方法，该方法采用偏振全内反射荧光（TIRF）显微镜，具有单分子灵敏度和约15毫秒的时间分辨率，并在生化条件明确的体系中进行 体外 系统。通过监测含有v-SNARE蛋白的荧光标记小单层囊泡（v-SUVs）与承载t-SNARE蛋白并支撑于软性聚合物垫上的平面双层膜（t-SBL，t-支撑双层膜）之间的融合过程，实现对膜融合事件的观察。该检测利用微流控流动通道，可在持续供给恒定密度SUVs的同时最大限度减少样品消耗。当SUV中的脂质标记物在融合过程中转移至SBL时，荧光信号迅速增强，借此可监测脂质染料转移的动力学过程。全内反射荧光（TIRF）显微镜的高灵敏度可实现对单个荧光脂质标记物的追踪，从而在每次融合事件中推导出脂质扩散系数和SUV尺寸。脂质染料释放时间可能远长于通过永久开放孔道时预期的无阻碍通过时间。采用假设脂质释放延迟源于孔道闪烁（pore flickering）的模型，可分析孔道 "开放性"，融合过程中孔道保持开放的时间比例，可以被估算。可通过在SUV中包封可溶性标记物，以同时监测脂质和可溶性货物的释放。此类测量表明，某些孔道在释放部分可溶性货物后可能重新闭合。
引言
膜融合是一种普遍存在的生物学过程，对于脂质和蛋白质的细胞内运输、分泌、受精、发育以及包膜病毒进入宿主生物体至关重要1-3。对于大多数细胞内融合反应（包括通过胞吐作用释放激素和神经递质），融合两个脂双层所需的能量来源于定位于囊泡（v-SNARE）和靶膜（t-SNARE）上的同源可溶性N-乙基马来酰亚胺敏感因子附着蛋白受体（SNARE）蛋白之间形成的四螺旋束4。突触囊泡胞吐是调控最为严密的融合反应，在动作电位到达后一毫秒内即发生1,4,5。融合孔是两个融合区室之间的初始连接结构，可在最终重新闭合或不可逆地扩张之前多次瞬时开放和关闭5-7。前者导致短暂的“亲吻与逃逸”式融合，而后者则导致完全融合。目前对调控这两种融合模式之间平衡的因素以及调节融合孔闪烁行为的机制尚不完全清楚5,8。
SNARE 蛋白是胞吐作用所必需的；当神经毒素切割 SNARE 蛋白后，突触囊泡的融合即被阻断9。利用小单层脂质体（SUV）进行的群体融合实验表明，SNARE 蛋白不仅为膜融合所必需，而且足以驱动膜融合过程10。在此群体实验中，将含有 v-SNARE 的脂质体（v-SUV）掺入荧光磷脂标记物（N-(7-硝基-2-1,3-苯并噁二唑-4-基)-磷脂酰乙醇胺（NBD-PE）和 N-(罗丹明 B 磺酰基)....
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方案
1. 制备用于形成微流控通道的PDMS块
图1. 流动池模板的微加工及PDMS块的制备。 （A）适用于24 × 60 mm玻璃盖玻片（底部）的四通道流动池设计。顶部为六个相同设计在10 cm硅片上的排布方式。（B）使用打孔器切下一块厚度约为5–8 mm的PDMS。（C）使用镊子将管路插入打孔形成的孔洞中。请点击此处查看该图的放大版本。
- 获取一个流动池模板，如图1A所示。典型的通道宽度为0.3–1 mm，高度为70–100 µm，长度为1–2 cm。可在洁净室设施中使用标准光刻技术制备模板25，若无洁净室条件，也可直接订购。或者....
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结果
SBL 质量
在融合实验之前，必须验证SBL的质量和流动性。微流控通道底部玻璃侧的荧光应均匀，无任何明显缺陷。如果气泡通过通道，通常会在SBL上留下可见的痕迹。若存在此类大范围的痕迹或缺陷，则不应使用该通道。有时SUV可能附着在基底上，但未能破裂并形成连续的SBL。在这种情况下，荧光可能仍然显得非常均匀，但在对小区域进行漂白后不会恢复。引入10 mM Mg2+通常有助于解决此问题。也可添加其他试剂以促进SUV破裂，例如其他二价阳离子51、聚合物溶液52或渗透冲击25。
即使荧光基本均匀且在漂白后能够恢复，仍可能有部分未融合的小单层囊泡（SUV）保持完整地存在于表面。如果这些脂质体足够大，会呈现为明亮的斑点。当对包.......
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讨论
成功实施本文所述的SUV-SBL融合实验在很大程度上依赖于若干关键步骤，例如将蛋白质功能性地重组至脂质体中、获得高质量的SBLs，以及选择合适的成像参数以检测单个分子。尽管该实验的成功可能需要一定的时间和努力，但一旦建立，便可提供其他方法无法获得的关于融合过程的丰富信息 体外 引言中讨论的融合实验。可确定小单层囊泡（SUV）与支撑双层膜（SBL）结合和融合的速率、结合至融合时间的分布、脂质扩散系数、每个融合脂质体的尺寸，以及特定融合事件中的脂质释放是受扩散控制还是孔道控制。如果释放速度远慢于扩散预期，则采用假设孔道闪烁导致脂质释放减缓的模型可解释该现象。 P0 融合过程中孔道开放时间所占的比例27.
先前针对单个 SUV-SUV 融合的研究18-20,28 或脂质体和病毒颗粒与SBLs的融合15-17,21,22,33,44 依赖于染料分子之间的FRET和自猝灭效应。相比之下，我们主要避免使用染料去猝灭来研究脂质标记物向SBL转移的动力学，原因有二。首先，FR.......
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披露
作者声明不存在任何竞争性经济利益。
致谢
我们感谢弗拉基米尔·波列亚耶夫（Vladimir Polejaev，耶鲁大学西校区成像中心）在偏振全内反射荧光显微镜的设计与构建方面所做的工作，感谢戴维·巴德利（David Baddeley，耶鲁大学）在双色检测仪器方面的协助，感谢詹姆斯·E·罗斯曼（James E. Rothman，耶鲁大学）、本·奥沙利文（Ben O'Shaughnessy，哥伦比亚大学）及其研究团队成员富有启发性的讨论。EK 获得了卡夫里基金会卡夫里神经科学学者奖以及美国国立卫生研究院（NIH）资助项目 1R01GM108954 的支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 试剂 | |||
| Milli-Q (MQ) 水 | 默克密理博 | ||
| KOH | J.T. Baker | 3040-05 | |
| 乙醇 190 Proof | 去卷积 | ||
| 异丙醇 | Fisher Chemical | A416P4 | |
| HEPES | AmericanBio | AB00892 | |
| 氯化钠 (KCl) | AmericanBio | AB01915 | |
| 二硫苏糖醇 | AmericanBio | AB00490 | |
| N-[2-羟乙基]哌嗪-N'-[2-乙磺酸] (HEPES) | AmericanBio | AB00892 | |
| EGTA | Acros Organics | 409911000 | |
| 缓冲液 | |||
| HEPES-KOH 缓冲液（pH 7.4） | 25 mM HEPES-KOH, 140 毫摩尔 KCl，100 μM EGTA, 1 mM DTT | ||
| 溶剂 | |||
| 氯仿 | J.T. Baker | 9180-01 | 置于玻璃瓶中，注意：穿戴个人防护装备 |
| 甲醇 | J.T. Baker | 9070-03 | 置于玻璃瓶中，注意：穿戴个人防护装备 |
| 脂质体的制备 | |||
| 耐压 Hamilton 注射器 | Hamilton | 不同尺寸 | 仅使用玻璃注射器与溶剂（氯仿/甲醇，2:1，v/v） |
| Pyrex Vista 11 ml 玻璃管，16x100 mm 螺口培养管 | 派热克斯 | 70825-16 | 彻底清洁，用氯仿冲洗 |
| 1-棕榈酰-2-油酰-sn-甘油-3-磷胆碱，16:0-18:1 PC（POPC） | Avanti Polar Lipids | 850457 | 脂质以氯仿（CHCl₃）溶解形式提供3 或以密封小瓶中的冻干粉末形式保存。开启后分装。额外部分以干燥脂质膜形式保存于-20℃惰性气体环境中 °C. 将储备液保存在 CHCl 中3/MeOH（2:1，v/v）在 -20 °C. 在打开前让其恢复至室温 |
| 1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸-L-丝氨酸（钠盐），18:1 PS（DOPS） | Avanti Polar Lipids | 840035 | 在普遍存在的膜融合过程中，融合孔的开放建立了两个原先分离的区室之间的首次连接。在通过胞吐作用释放神经递质或激素的过程中，融合孔可短暂地反复开放与关闭，从而调控货物分子的释放动力学。孔道动力学还决定了囊泡回收的模式：不可逆的重新闭合导致瞬时性的“接触—释放”（kiss-and-run）融合，而孔道扩张则导致完全融合。为了更好地理解调控孔道动力学的因素，我们开发了一种检测膜融合的实验方法，该方法在生化定义明确的体外系统中，利用偏振全内反射荧光（TIRF）显微镜实现单分子灵敏度和约15毫秒的时间分辨率。实验中监测含有v-SNARE蛋白的荧光标记小单层囊泡（v-SUVs）与承载t-SNARE的平面双层膜（t-SBL，t-支撑双层膜）之间的融合，后者被支撑在柔软的聚合物垫上。该检测利用微流控流动通道，确保样品消耗极小，同时提供恒定密度的SUVs。通过利用融合过程中脂质标记物从SUV转移到SBL时产生的快速信号增强，监测脂质染料转移的动力学。TIRF显微镜的灵敏度允许追踪单个荧光脂质标记物，从而在每次融合事件中推导出脂质扩散系数和SUV大小。脂质染料释放时间可能远长于永久开放孔道中无阻碍通过所预期的时间。利用假设脂质释放减缓源于孔道闪烁（flickering）的模型，可估算孔道“开放度”，即融合过程中孔道保持开放状态的时间比例。可在SUVs中包封可溶性标记物，以同时监测脂质和可溶性货物的释放。此类测量表明，某些孔道在丢失部分可溶性货物后可能重新闭合。 |
| 1-十八烷酰-2-花生四烯酰-sn-甘油-3-磷脂酰乙醇胺，18:0-20:4 PE（SAPE） | Avanti Polar Lipids | 850804 | 在普遍存在的膜融合过程中，融合孔的打开建立了两个原先分离的区室之间的首次连接。在通过胞吐作用释放神经递质或激素的过程中，融合孔可短暂地反复开放与关闭，从而调控货物分子的释放动力学。孔道动力学还决定了囊泡回收的模式：不可逆的重新闭合导致瞬时性的“接触—释放”（kiss-and-run）融合，而孔道扩张则导致完全融合。为了更好地理解调控孔道动力学的因素，我们开发了一种检测膜融合的实验方法，该方法在生化定义明确的体外系统中，利用偏振全内反射荧光（TIRF）显微镜实现单分子灵敏度和约15毫秒的时间分辨率。实验中监测含有v-SNARE蛋白的荧光标记小单层囊泡（v-SUVs）与承载t-SNARE的平面双层膜（t-SBL，t-支撑双层膜）之间的融合，后者支撑于柔软的聚合物垫上。该检测利用微流控流动通道，确保样品消耗极小，同时提供恒定密度的SUVs。通过利用融合过程中脂质标记物从SUV转移到SBL时产生的快速信号增强，监测脂质染料转移的动力学。TIRF显微镜的灵敏度允许追踪单个荧光脂质标记物，从而在每次融合事件中推导出脂质扩散系数和SUV大小。脂质染料释放时间可能远长于永久开放孔道中无阻碍通过所预期的时间。使用一种假设脂质释放受阻源于孔道闪烁（flickering）的模型，可估算出孔道“开放度”（openness），即融合过程中孔道保持开放状态的时间比例。可在SUVs中包封可溶性标记物，以同时监测脂质和可溶性货物的释放。此类测量表明，某些孔道在丢失部分可溶性货物后可能重新闭合。 |
| L-α磷脂酰肌醇-4,5-二磷酸（脑组织，猪）（铵盐），脑组织 PI(4,5)P₂2 | Avanti Polar Lipids | 840046 | 在普遍存在的膜融合过程中，融合孔的打开建立了两个原先分离的区室之间的首次连接。在通过胞吐作用释放神经递质或激素的过程中，融合孔可短暂地反复开放与关闭，从而调控货物分子的释放动力学。孔道动力学还决定了囊泡回收的模式：不可逆的重新闭合导致瞬时性的“接触—释放”（kiss-and-run）融合，而孔道扩张则导致完全融合。为了更好地理解调控孔道动力学的因素，我们开发了一种检测膜融合的实验方法，该方法在生化定义明确的体外系统中，利用偏振全内反射荧光（TIRF）显微镜实现单分子灵敏度和约15毫秒的时间分辨率。实验中监测含有v-SNARE蛋白的荧光标记小单层囊泡（v-SUVs）与承载t-SNARE的平面双层膜（t-SBL，t-支撑双层膜）之间的融合，后者被支撑在柔软的聚合物垫上。该检测利用微流控流动通道，确保样品消耗极小，同时提供恒定密度的SUVs。通过利用融合过程中脂质标记物从SUV转移到SBL时产生的快速信号增强，监测脂质染料转移的动力学。TIRF显微镜的高灵敏度可追踪单个荧光脂质标记物，从而在每次融合事件中推导出脂质扩散系数和SUV大小。脂质染料释放时间可能远长于永久开放孔道中无阻碍通过所预期的时间。通过假设脂质释放减缓源于孔道的闪烁（flickering），可建立模型估算孔道“开放度”——即融合过程中孔道保持开放状态的时间比例。此外，可在SUV内包封可溶性标记物，以同时监测脂质与可溶性货物的释放。此类测量表明，部分孔道在释放部分可溶性货物后可能发生重新闭合。 |
| 1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酰乙醇胺-N-(7-硝基-2-1,3-苯并噁二唑-4-基)（铵盐），18:1 NBD PE | Avanti Polar Lipids | 810145 | 在普遍存在的膜融合过程中，融合孔的打开建立了两个原先分离的区室之间的首次连接。在通过胞吐作用释放神经递质或激素的过程中，融合孔可短暂地反复开放与关闭，从而调控货物分子的释放动力学。孔道动力学还决定了囊泡回收的模式：不可逆的重新闭合导致瞬时性的“接触—释放”（kiss-and-run）融合，而孔道扩张则导致完全融合。为了更好地理解调控孔道动力学的因素，我们开发了一种检测膜融合的实验方法，该方法在生化定义明确的体外系统中，利用偏振全内反射荧光（TIRF）显微镜实现单分子灵敏度和约15毫秒的时间分辨率。实验中监测含有v-SNARE蛋白的荧光标记小单层囊泡（v-SUVs）与承载t-SNARE的平面双层膜（t-SBL，t-支撑双层膜）之间的融合，后者支撑于柔软的聚合物缓冲层上。该检测利用微流控流动通道，确保样品消耗极小，同时提供恒定密度的SUVs。通过利用融合过程中脂质标记物从SUV转移到SBL时产生的快速信号增强，监测脂质染料转移的动力学。TIRF显微镜的灵敏度允许追踪单个荧光脂质标记物，从而在每次融合事件中推导出脂质扩散系数和SUV大小。脂质染料释放时间可能远长于永久开放孔道中无阻碍通过所预期的时间。使用一种假设脂质释放受阻源于孔道闪烁（flickering）的模型，可估算孔道“开放度”（openness），即融合过程中孔道保持开放状态的时间比例。可在SUVs中包封可溶性标记物，以同时监测脂质和可溶性货物的释放。此类测量表明，某些孔道在丢失部分可溶性货物后可能重新闭合。 |
| 1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酰乙醇胺-N-[甲氧基(聚乙二醇)-2000]（铵盐），18:1 PEG2000 PE | Avanti Polar Lipids | 880130 | 在普遍存在的膜融合过程中，融合孔的打开建立了两个原先分离的区室之间的首次连接。在通过胞吐作用释放神经递质或激素的过程中，融合孔可短暂地反复开放与关闭，从而调控货物分子的释放动力学。孔道动力学还决定了囊泡回收的模式：不可逆的重新闭合导致瞬时性的“接触—释放”（kiss-and-run）融合，而孔道扩张则导致完全融合。为了更好地理解调控孔道动力学的因素，我们开发了一种检测膜融合的实验方法，该方法在生化体系明确的体外系统中，利用偏振全内反射荧光（TIRF）显微镜实现单分子灵敏度和约15毫秒的时间分辨率。实验中监测含有v-SNARE蛋白的荧光标记小单层囊泡（v-SUVs）与承载t-SNARE蛋白并支撑于软性聚合物垫上的平面双层膜（t-SBL，t-支撑双层膜）之间的融合过程。该检测方法采用微流控流动通道，可在持续提供恒定密度SUVs的同时最大限度减少样品消耗。利用融合过程中脂质标记物从SUV转移到SBL时产生的快速信号增强，监测脂质染料转移的动力学。TIRF显微镜的高灵敏度可追踪单个荧光脂质标记物，从而在每次融合事件中推导出脂质扩散系数和SUV的尺寸。脂质染料的释放时间可能远长于永久开放孔道中无阻碍通过所预期的时间。通过假设脂质释放减缓源于孔道的闪烁行为（pore flickering）的模型，可估算出孔道“开放度”（openness），即融合过程中孔道保持开放状态的时间比例。此外，可在SUVs中包封可溶性标记物，以同时监测脂质与可溶性货物的释放。此类测量结果表明，部分融合孔可能在释放部分可溶性货物后重新闭合。 |
| 胆固醇（绵羊毛， >98%) | Avanti Polar Lipids | 700000 | 在普遍存在的膜融合过程中，融合孔的打开建立了两个原先相互分离的区室之间的首次连接。在通过胞吐作用释放神经递质或激素的过程中，融合孔可发生瞬时的反复开放与关闭，从而调控货物分子的释放动力学。孔道动力学还决定了囊泡回收的模式：不可逆的重新闭合导致短暂的“接触—释放”（kiss-and-run）式融合，而孔道扩张则导致完全融合。为了更好地理解调控孔道动力学的因素，我们开发了一种检测膜融合的实验方法，该方法在生化体系明确的体外系统中，利用偏振全内反射荧光（TIRF）显微镜实现单分子灵敏度和约15毫秒的时间分辨率。实验中监测含有v-SNARE蛋白的荧光标记小单层囊泡（v-SUVs）与承载t-SNARE蛋白并支撑于软性聚合物垫上的平面双层膜（t-SBL，t-支撑双层膜）之间的融合过程。该检测方法采用微流控流动通道，确保样品消耗极小，同时提供恒定密度的SUVs。通过利用融合过程中脂质标记物从SUV转移到SBL时产生的快速信号增强，监测脂质染料转移的动力学。TIRF显微镜的高灵敏度可追踪单个荧光脂质标记物，从而在每次融合事件中推导出脂质扩散系数和SUV的尺寸。脂质染料释放时间可能远长于永久开放孔道中无阻碍通过所预期的时间。通过假设脂质释放减缓源于孔道的闪烁（flickering），可建立模型估算孔道“开放度”（openness），即融合过程中孔道保持开放状态的时间比例。此外，可将可溶性标记物包封于SUVs中，以同时监测脂质与可溶性货物的释放。此类测量结果表明，部分融合孔可能在释放部分可溶性货物后重新闭合。 |
| DiD' 油；DiIC18(5) 油（1,1'-二辛基-3,3,3',3'-四甲基吲哚二碳菁高氯酸盐） | 分子探针 | D-307 | |
| Rotavapor R-210 | 布希 | R-210 | 高于所用脂质相变温度（Tm）的恒温环境 |
| OG 正辛基-β-D-葡萄糖吡喃糖苷 | Affymetrix | 0311 | -20 保存 °C，让其在打开前恢复至室温 |
| Shaker - Eppendorf Thermomixer R | Eppendorf | ||
| Slide-A-Lyze 透析盒，20k MWCO，3 个 毫升 | Life Technologies | 66003 | |
| Bio-Beads SM-2 吸附剂 | Bio-Rad | 1523920 | |
| OptiPrep 密度梯度介质 | Sigma-Aldrich | D1556 | |
| 超速离心管，薄壁，Ultra-Clear，13.2 毫升，14 × 89 毫米 | Beckman Coulter | 41121703 | |
| Beckman SW41 Ti 转子 | |||
| 磺酰罗丹明B | 分子探针 | S-1307 | |
| Econo-Column 色谱柱，2.5 × 10 cm | 伯乐（Bio-Rad） | 7372512 | |
| Sepharose CL-4B | GE Healthcare | 17-0150-01 | |
| SYPRO Orange 蛋白凝胶染色剂 | 分子探针 | S-6650 | DMSO 中的 5,000 倍浓缩液 |
| PDMS 块 | |||
| Sylgard 184 硅弹性体试剂盒，PDMS | 道康宁 | 3097358-1004 | |
| Pyrex 玻璃培养皿，150 × 20 mm，带盖 | 康宁 | 3160-152 | |
| 打孔器 - 可重复使用活检打孔针，0.75 毫米 | World Precision Instruments | 504529 | |
| 手动打孔机 | SYNEO | MHPM-UNV | |
| 钻头，直径0.035 × 0.026 × 长度1.5，304不锈钢，TiN涂层，圆形冲头 | SYNEO | CR0350265N20R4 | 钻头直径：0.9 mm，冲孔孔径：0.74 mm |
| Tygon Microbore 软管，内径 0.25 mm，外径 0.76 mm | Cole-Parmer | 06419-00 | 0.010" ID，0.030" 光密度 |
| 硅胶管（内径 0.51 mm，外径 2.1 mm） | Cole-Parmer | 95802-00 | 0.020" 0.083" 光密度 |
| 盖玻片 - 洁净室清洗 | |||
| Schott Nexterion 盖玻片玻璃 D | Schott | 1472305 | |
| 等离子清洗机 | Harrick | PDC-32G | |
| pTIRF装置与配件 | |||
| IX81 显微镜机身 | Olympus | IX81 | |
| EM CCD相机 | Andor | ixon-ultra-897 | |
| Thermo Plate，加热显微镜载物台 | 东海日立 | MATS-U52RA26 | |
| 1 ml 汉密尔顿玻璃注射器（4 个） | Hamilton | 81365 | |
| 注射泵 | kd Scientific | KDS-230 |
参考文献
- Sudhof, T. C., Rothman, J. E. Membrane fusion: grappling with SNARE and SM proteins. Science. 323, 474-477 (2009).
- Wickner, W., Schekman, R. Membrane fusion. Nat Struct Mol Biol. 15, 658-664 (2008).
- Harrison, S. C.
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