Method Article

的三种不同方法对乳腺癌细胞株确定细胞增殖的比较

DOI:

10.3791/54350

⸱

September 3rd, 2016

 ,  , 
1Medical Genetics, Hunter Medical Research Institute, 2Priority Research Centre for Cancer, School of Biomedical Sciences and Pharmacy, Faculty of Health and Medicine, University of Newcastle, 3Pathology North, John Hunter Hospital

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

该方案描述了使用三种不同的方法来分析乳腺癌细胞系中的细胞增殖。这包括使用常规细胞计数、基于发光的细胞活力以及通过使用细胞成像仪进行细胞计数。每种方法都为细胞增殖的可重复测量提供了优势。

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

可以通过多种不同的方法进行细胞增殖的测量，每种方法都有不同程度的灵敏度、可重复性和与高通量格式的兼容性。该方案描述了使用三种不同的方法在体外测量细胞增殖，包括传统的血细胞计数器计数室、一种基于发光的测定法，该测定利用活细胞代谢活性的变化作为细胞相对数量的量度，以及使用计数算法测量细胞数量的多模式细胞成像仪。每种方法在测量细胞增殖方面都有其自身的优点和缺点，包括时间、成本和高通量兼容性。该方案表明，每种方法都可以准确测量细胞随时间的增殖，并且对检测不同细胞密度下的生长很敏感。此外，使用细胞成像仪测量细胞增殖能够提供更多信息，例如形态、汇合度，并允许随着时间的推移持续监测细胞增殖。总之，每种方法都能够测量细胞增殖，但所选择的方法取决于用户。

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

肿瘤抑制基因，p53基因，是一个数字的细胞过程，包括细胞周期停滞，细胞凋亡和衰老1的一个重要调节器。它是负责维持基因组稳定性，因此对于维持细胞死亡和细胞生长的平衡是至关重要的。 p53基因的突变是在癌症常见并且是p53的失活的主要原因，导致不受控制的细 ​​胞增殖2。有趣的是，在p53基因突变只占乳腺癌3的大约25％，这表明其他机制负责p53功能的丧失。最近发现的p53同种型已被证明在许多人类癌症中过表达，并能调节p53功能4,5。我们以前曾表明，p53的同种型，Δ40p53，是在乳腺癌中最高度表达的同种型，并且在乳腺癌细胞中显著上调，相比正常相邻做卷烟时UE 6。在此之后，我们稳定转导的人乳腺癌细胞系MCF-7中使用LEGO-IG2-普罗+载体（GFP +）7以过表达Δ40p53。这些细胞被用来研究是否高Δ40p53表达增加乳腺癌细胞的细胞增殖率。

有体外测定8,9-培养细胞的细胞增殖的许多直接和间接的方法。这些都可以无论是作为连续测量随着时间的推移，或作为端点检测10进行。传统的方法仍然是有用的，诸如使用血球细胞计数。该测定法是一种成本低，细胞数的直接测量，但它确实依赖于大细胞计数和高技能训练，以尽量减少计数误差和大的标准偏差。以执行与高通量格式兼容的测量的需要已经导致多孔板测定法的发展。这些基于发光的测定measu再根据正比于电池11,12的代谢活性的发光信号的细胞数。最近，引进高含量的成像平台已经允许其监控细胞增殖，同时提供定量和定性的表型数据采集新的工具，包括各种系统13。所有的这些方法提供途径来测量细胞生长，或者通过连续测量或端点测定法，和每个具有与问候灵敏度，可以通过样品的数字，和小单元信息的范围内的优点和缺点，它们都可以相应地称量取决于所研究的问题。

这个协议描述了测量细胞增殖在体外 ，具有利用灵敏度，重复性和多井板格式的不同范围的每个方法三种不同的方法。该协议的目的是比较使用一个血球计数的茶MBER，一个基于发光的细胞生存力测定法，和细胞成像仪，在细胞增殖超过96小时时间过程的测定。要做到这一点，载体转导的细胞（MCF-7-LEGO）的生长相比转导至过表达Δ40p53（MCF-7-Δ40p53）细胞，使用三种不同的细胞密度。细胞增殖测定每24小时的多达96小时。发现每一种方法有它自己的优点和缺点，并且根据实验的目的，每一个仍然是对增殖的速率提供信息的有价值的方法。

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Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1.准备用于细胞增殖检测

注:准备以相同的方式和种子中的两种细胞系在相同的格式对于要分析的每个方法。

  1. 使用生长的MCF-7-LEGO和MCF-7-Δ40p537细胞至75-80％汇合T中75cm 2的组织培养瓶无酚红的Dulbecco改良Eagle培养基（DMEM）中补充有10％胎牛血清（FBS）的，200 2mM L-谷氨酰胺，2微克/毫升的胰岛素和1μg/ ml的嘌呤霉素，在37℃，5％的CO 2。处理细胞II无菌生物安全柜类。
    注意:需要的时间的细胞生长至汇合的量取决于播种稀释而变化。在用于电镀的细胞的增殖测定的准备，种子的细胞以1:3稀释在补充的DMEM，并在正常生长条件保持3天，直至75-80％汇合。
  2. 从烧瓶中除去细胞，媒体倒出成一个废物容器。立即用2ml预热2×胰蛋白酶的洗细胞层。吸胰蛋白酶。在37℃的培养箱中添加进一步2毫升预温热胰蛋白酶的细胞层和地点的5分钟，用5％ 的 CO 2。
    1. 一旦细胞脱离，洗涤细胞，用10ml温热新鲜补充的DMEM。在RT细胞悬液转移到无菌的15毫升管和离心491 xg离心5分钟。小心吸取上清液处置。
  3. 重悬细胞沉淀在5毫升新鲜的DMEM加味的。进行细胞计数，以确定正确的密度播种的细胞在96孔板中。
    1. 稀释100微升在900微升1×Dulbecco氏磷酸盐缓冲盐水（DPBS）中的细胞悬浮液。将新的60微米传感器到自动细胞计数。按住柱塞和淹没在稀释的细胞悬浮液中的传感器。慢慢地松开细胞计数柱塞。从细胞凑取出传感器当完成NTER。
      注:细胞计数，将显示在细胞/ ml的细胞计数器。
  4. 种子的细胞以在约20％汇合100微升（在DMEM）在一个96孔板的最终体积，以允许室超过3-5天（ 见表1）的增殖的细胞生长和测量。种子一式三份所有细胞系。
    注意:在这个实验中，三个不同的细胞密度进行了评估，以确定最佳的细胞密度。所需的细胞数以较低的密度概括于表1中 。种子细胞，如果需要更长期的增长的测量。
    1. 对于血球和基于发光的测定，每准备时间点的一个板块（ 即每次检测4板）。对细胞成像测定法中，在实验的持续时间仅准备一个板。
  5. 维持细胞在37℃，5％CO 2的24小时。

2.确定细胞计数我们ING血球

  1. 在细胞培养培养箱预暖既介质和胰蛋白酶至37℃，烘箱或水浴中。从细胞中吸出培养基到废物容器中，用2×胰蛋白酶的30微升洗一次，并吸出胰蛋白酶。
  2. 用2×胰蛋白酶的30微升再次洗涤细胞，并孵育在37℃下5分钟。轻轻敲击板的边缘与板打跑细胞。加入50μl补充的DMEM和直至细胞形成单细胞悬浮液，通过移液混合细胞。
  3. 通过清洁表面和玻璃盖，用70％的乙醇制备血球。
  4. 将玻璃盖玻片上计数室，并加盖直到"牛顿环折射"可以在盖玻片边缘和血球间可见。
    注意:这些表明，盖玻片已正确地坚持的血球。
  5. 轻轻吸取20微升细胞悬浮液的盖玻片下，通过毛细管运动填充计数室。将血球下放大10倍的显微镜和可视化的网格布局的计数室。
  6. 算上在网格布局的4外广场的细胞。为了提高精确度，如果需要的附加 ​​外正方形重复计数，或者直到计数已经达到70 - 100细胞14,15。
    1. （如果使用的话）每平方×稀释因子的平均细胞数×10 4:计算每毫升的细胞浓度如下
  7. 重复步骤2.1-2.8，每24小时96小时后播种。

3.确定细胞增殖使用基于发光的分析

注意:这是一个终点测量。一旦所述试剂加入到细胞中，板只能使用一次定量。

  1. 解冻发光试剂在22℃水浴中30分钟。
  2. 轻轻颠倒瓶子以获得均匀混合混合试剂。
  3. 平衡接种细胞的一个板（来自步骤1.5）在室温30分钟。
  4. 加入100μl发光试剂的每个孔中。混合内容上轨道摇床2分钟。允许板在室温下孵育10分钟。
  5. 使用多模式平板阅读器软件设置发光实验。
    1. 开启多模板读数器和打开软件。在"任务管理器"，选择"实验"和"创建new'.Select'文件'从侧面工具条，并根据"协议"选项卡中，选择"程序"。
    2. 选择"格尼尔96平底'板型，并选中"使用盖子"框。在选择"读法"盒子"读"的行动。选择"发光"的检测方法。点击"确定"。
    3. 在阅读的步骤中，选择"全板"选项卡下要扫描的井，并选择井作为空白孔。
    4. 设置过滤器设置为空过滤器（ 例如 ，插头，EM:孔镜:无）。将增益设置为135，每孔0.5秒的积分时间和6.5毫米的读高度。点击"确定"保存设置发光读。
  6. 执行发光读
    1. 通过选择"仪器控制"选项卡弹出板夹，然后点击"板块out'.Place 96孔板上板架，确保盖子上。通过点击'板'下'的仪器控制"选项卡中关闭板固定器。点击'现在读"从工具栏进行发光读。
    2. 导出的每个的相对发光单位（RLU）测量很好地用于进一步分析电子表格。
  7. 重复步骤3.1-3.6种子细胞后，细胞增殖记录每24小时最多96个小时。

4.确定细胞计数使用细胞成像仪

  1. 使用多模式信元成像软件建立细胞成像实验
    1. 打开多模式电池成像仪和开放日E软件。
    2. 在"任务管理器"，选择"实验"标签和"创建new'.On的"文件"工具栏上，单击"协议"选项卡，打开"程序"tab.Select"设定温度"的行动。孵化器设置为"开"和设定温度为37℃，请与接下来"框，然后再继续"预热"。点击"确定"保存设置。
    3. 选择"读"的行动。点击"图像"检测方法，选择"端点/动力学"读类型和"过滤器"光学类型。上盘点击满盘'标签'的OK'.Click'，选择井成像。点击"确定"保存设置。
    4. 从下拉"目标"选项中选择2.5X目标。在"频道"选项卡，选择两个渠道:GFP 469，525和明视野。检查两个通道"自动"曝光，并选择自动曝光好。
    5. 要确定AUTØ聚焦设置，选择"自动对焦"，然后单击"选项"。对于自动对焦选项，选择"扫描，然后自动对焦"的方法。点击"确定"保存设置。
    6. 设置的水平和垂直距离的井（微米）中心偏移到0.Select扫描每孔的多个图像在一个3×2的蒙太奇，以水平间距（微米）= 2881和垂直间距（微米）= 2127。点击"确定"保存设置程序。
      注:请参见表2读取参数。
  2. 在板块选择执行读取实验
    1. 点击"仪器控制"选项卡，选择"积垢"function.Place在板架96孔板，确保盖子上。根据"仪器控制"选项卡，选择功能"中板"。从板选项卡中选择"立即阅读。重复阅读每24小时最多96小时后播种。
  3. 细胞计数分析使用细胞成像软件。
    1. 为了分析图像，单击"数据"选项卡上的成像板，选择"图片[GFP 469，525 +明场]'。双击一个很好成像。
    2. 点击加载图像。选择"分析"，然后选择要分析蒙太奇的单一形象。点击"OK'.Check了"绿色荧光蛋白"的唯一通道，并设置参数表3所列。点击"开始"，以参数适用于成像单元。
    3. 观察细胞计数掩模放置在成像单元，它被用来确定每幅图像的细胞计数。点击整个实验成像每块板"应用更改"和维护这些设置。
    4. 一旦回到成像板，单击"数据"下拉菜单，选择"细胞计数"。这将产生每孔的总细胞计数。
    5. 通过点击进行​​进一步的分析Ø"导出"选项卡上导出所有的数据到电子表格˚F每孔的细胞计数。

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Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

研究测定培养细胞的增殖，-Δ40p53MCF-7转导的细胞的细胞增殖的不同的方法进行比较的非转导的MCF-7-LEGO乳腺癌细胞系。进行了比较，三种方法-分析-在本示意图中概括的常规血球方法，细胞活力发光测定和细胞成像（ 图1）。每种方法都有优点和缺点，以精确地测量随着时间的推移细胞计数，而最有效的方法取决于实验的终点的要求和可以为一个细胞群获取的信息。

MCF-7-LEGO和MCF-7-Δ40p53细胞的生长进行后4天24小时进行测定。正如图1所示，两种细胞系在三种不同的细胞密度（1.5×10 3细胞接种3; 5×10 3细胞/孔）和细胞计数被播种后进行24，48，72和96小时。每个方法证实增加的细胞增殖，使用血细胞计数器，一个基于发光的测定法和细胞成像器（ 图2a，b和c，

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Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

在这个协议中进行了检查三个不同测量在培养细胞的细胞增殖的方法。每一种方法是有能力的细胞增殖的可再现和精确的测量的超过96小时，并且结果是每个测试的方法之间比较的（ 图2和3）。同时基于发光的测定法和细胞成像方法所产生的最强大的结果，是表示之后96小时在细胞增殖的线性增加（ 图2b，c） 所示 。此外，随着时间的推移细胞成像描绘在转导的和非转导的细胞系（ 图4）之间的生长速率无显著差异。

有许多的优点和缺点对该协议检查的每个方法， 见表5为摘要。使用血球常规细胞计数法是一种低成本的方法，需要非常少的附加的试剂或effoRT准备和运行。此外，这种方法进行定量在细胞/ ml 14的绝对细胞数。但是，也有严重的缺点，其中包括消耗细胞计数，高错误率，其导致计数之间大的标准偏差的性质的时间，和一个事实，即高范围细胞数目的所必需的准确的细胞计数。这可以在图2...

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Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

作者宣称，他们没有竞争的经济利益。

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

我们要感谢 Hamish Campbell 博士和 Antony Braithwaite 教授在开发转导的 MCF-7-LeGO 细胞系方面提供的帮助。我们要感谢 Bloomfield Group 基金会通过 Hunter Medical Research Institute 提供的资金支持。BCM 由纽卡斯尔大学的 APA 奖学金和亨特医学研究所的 MM Sawyer 奖学金支持。

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Dulbecco 改良 Eagle 培养基，不含酚红ThermoFisher Scientific21063-045补充有 10% FBS、200 mM L-谷氨酰胺、2 和微量;g/ml 胰岛素和 1 µg/ml 嘌呤霉素
L-谷氨酰胺溶液 （100x）ThermoFisher Scientific25030-081
胰岛素溶液 人Sigma-AldrichI9278-5ML
胎牛血清 （FBS）Bovogen BiologicalsSFBS-F-500ml
嘌呤霉素二盐酸盐Sigma-AldrichP9620-10ML
0.5% 胰蛋白酶-EDTA 溶液 （10x）ThermoFisher Scientific15400-054在 DPBS
Dulbecco 磷酸盐缓冲盐水 （DPBS） 中稀释至 2 倍 （1x）ThermoFisherScientific30028-02
组织培养瓶，75 cm2 生长区域Greiner Bio-One658175
Scepter 2.0 细胞计数仪Merck Millipore自动细胞计数仪
96 孔多孔板，平底Nunc167008
改进的 Neubauer 血球计数器BOECO 德国 BOE01
奥林巴斯 IX51 倒置显微镜奥林巴斯IX51
CellTiter-Glo 2.0 检测PromegaG9242基于发光的检测
Cytation 3 细胞成像 多功能微孔板检测仪BioTek用于发光、荧光的微孔板检测仪和明场细胞成像
Gen5 数据分析软件BioTekGEN5
，

References

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