本方案描述了三种不同方法在乳腺癌细胞系增殖分析中的应用，包括传统细胞计数法、基于化学发光的细胞活力检测法以及利用细胞成像仪进行细胞计数的方法。每种方法均可实现细胞增殖的可重复性测量，并具有各自的优势。
需要JoVE订阅才能观看此内容。 请登录或开始免费试用
本文内容
摘要
摘要
测量细胞增殖可通过多种不同方法进行，每种方法在灵敏度、可重复性以及与高通量操作格式的兼容性方面各不相同。本实验方案描述了三种用于体外（in vitro）测量细胞增殖的方法：传统的血细胞计数板计数法、基于发光检测的分析法（该方法通过检测活细胞代谢活性的变化来反映相对细胞数量），以及采用计数算法的多功能细胞成像仪法。每种方法在测量细胞增殖时均有其各自的优缺点，涉及时间消耗、成本以及与高通量操作的兼容性。本方案表明，这三种方法均可准确地随时间测量细胞增殖，并能灵敏地检测不同细胞密度下的生长情况。此外，使用细胞成像仪测量细胞增殖还可提供额外信息，如细胞形态、汇合度，并可实现对细胞增殖过程的连续动态监测。综上所述，这三种方法均能够有效测量细胞增殖，但具体方法的选择取决于用户需求。
引言
肿瘤抑制基因 p53 是多种细胞过程的关键调控因子，包括细胞周期阻滞、凋亡和细胞衰老1。它负责维持基因组稳定性，因此对于调控细胞死亡与细胞生长之间的平衡至关重要。p53 的突变在癌症中十分常见，是导致 p53 失活并引发癌细胞不受控增殖的主要原因2。有趣的是，p53 突变仅占乳腺癌病例的约 25%3，这表明其他机制也参与了 p53 功能的丧失。最近发现的 p53 异构体在多种人类癌症中呈现过表达，并可调节 p53 的功能4,5。我们先前的研究表明，p53 异构体 Δ40p53 是乳腺癌中表达水平最高的异构体，与正常邻近组织相比，在乳腺癌细胞中显著上调6。在此基础上，我们利用 LeGO-iG2-puro+ 载体（GFP+）对人乳腺癌细胞系 MCF-7 进行稳定转导，使其过表达 Δ40p537。这些细胞被用于研究高表达 Δ40p53 是否会增加乳腺癌细胞的增殖速率。
体外培养细胞的增殖检测方法有多种直接和间接手段in vitro8,9。这些方法可进行随时间连续监测，也可作为终点检测10。传统方法仍然具有实用性，例如使用血细胞计数板进行细胞计数。该方法成本较低，可直接测定细胞数量，但需要进行大量细胞计数，并依赖操作者高度熟练的技术，以尽量减少计数误差和较大的标准偏差。为满足高通量实验格式的需....
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
方案
1. 增殖实验前的细胞准备
注意：以相同方式制备两种细胞系，并以相同格式接种，用于每种待分析方法。
- 培养 MCF-7-LeGO 和 MCF-7-Δ40p53 7 细胞在T75 cm²培养瓶中培养至75-80%汇合度2 使用不含酚红的杜氏改良伊格尔培养基（DMEM），添加10%胎牛血清（FBS）、200 mM L-谷氨酰胺、2 µg/ml 胰岛素和1 µg/ml 嘌呤霉素，在37 °C、5% CO₂条件下培养于组织培养瓶中2在II级生物安全柜中无菌操作细胞。
注意：细胞生长至汇合所需的时间因接种稀释度的不同而有所差异。为准备进行增殖检测，将细胞以1:3的比例接种于添加补剂的DMEM培养基中，并在正常培养条件下培养3天，直至细胞达到75–80%汇合度。 - 为从培养瓶中去除细胞，将培养基倒入废液容器中。立即用 2 ml 预热的 2x 胰蛋白酶洗涤细胞层，吸除胰蛋白酶。再向细胞层加入 2 ml 预热的胰蛋白酶，于 37 °C、5% CO₂ 条件下放入培养箱孵育 5 分钟。2.
- 待细胞脱落之后，用10 ml预热的新鲜完全DMEM培养基洗涤细胞。将细胞悬液转移至无菌15 ml离心管中，在室温下以491 × g离心5分钟。小心吸除并弃去上清液。
- 将细胞沉淀重悬于5 ml新鲜的完....
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
结果
为了研究测量培养细胞增殖的不同方法，将转导了MCF-7-Δ40p53的细胞与未转导的MCF-7-LeGO乳腺癌细胞系的细胞增殖情况进行比较。所比较的三种方法——传统的血细胞计数板法、细胞活力发光检测法以及细胞成像分析法——已在示意图（图1）中概述。每种方法在随时间准确测定细胞数量方面均有其优缺点，最有效的方法取决于实验的终点需求以及可获取的细胞群体信息。
在接种后24小时至4天内，测量MCF-7-LeGO和MCF-7-Δ40p53细胞的生长情况。如图1所示，将两种细胞系以三种不同的细胞密度（1.5 × 103；3 × 103；5 × 103 个细胞/孔）接种，并在接种后24、48、72和96小时进行细胞计数。通过血细胞计数板、基于发光的检测法以及细胞成像仪（分别为图2a、b和
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
讨论
本方案中考察了三种不同的方法来测量培养细胞的细胞增殖。每种方法均可在96小时内对细胞增殖进行可重复且准确的测量，且各方法之间的结果具有可比性（图2和图3）。基于发光的检测方法和细胞成像方法均获得了最稳健的结果，在96小时后显示出细胞增殖的线性增长（图2b、c）。此外，随时间推移的细胞成像显示，转导细胞系与非转导细胞系之间的生长速率无显著差异（图4）。
本方案中所考察的每种方法均有其优缺点，详见表5。使用血细胞计数板进行传统细胞计数的方法成本较低，所需额外试剂少，制备和操作过程简便。此外，该方法可提供以细胞数/毫升为单位的绝对细胞数量14。然而，该方法也存在严重缺点，包括细胞计数过程耗时、误差率高导致计数间标准差较大，以及准确计数需要较宽范围的细胞数量。这一点在图2a中可见，使用血细胞计数板在低细胞密度下表现出结果波动较大，且在后期时间点标准差显著增加。这些缺点.......
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
披露
作者声明不存在任何竞争性经济利益。
致谢
我们感谢 Hamish Campbell 博士和 Antony Braithwaite 教授在构建转导的 MCF-7-LeGO 细胞系过程中提供的帮助。我们感谢布卢姆菲尔德集团基金会通过亨特医学研究所在资金方面给予的支持。B.C.M. 获得了纽卡斯尔大学提供的澳大利亚研究生奖学金（APA）以及亨特医学研究所提供的 MM Sawyer 奖学金资助。
....访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 不含酚红的杜尔贝科改良伊格尔培养基 | ThermoFisher Scientific | 21063-045 | 添加 10% 胎牛血清、200 mM L-谷氨酰胺、1 µg/ml 胰岛素和 1 µg/ml 嘌呤霉素 |
| L-谷氨酰胺溶液（100倍浓缩） | ThermoFisher Scientific | 25030-081 | |
| 人胰岛素溶液 | Sigma-Aldrich | I9278-5ML | |
| 胎牛血清（FBS） | Bovogen Biologicals | SFBS-F-500ml | |
| 盐酸嘌呤霉素二水合物 | Sigma-Aldrich | P9620-10ML | |
| 0.5% 胰蛋白酶-EDTA 溶液（10倍浓缩） | ThermoFisher Scientific | 15400-054 | 用 DPBS 稀释至 2 倍浓度 |
| 杜尔贝科磷酸盐缓冲液（DPBS）（1倍浓度） | ThermoFisher Scientific | 30028-02 | |
| 组织培养瓶，75 cm2 生长面积 | Greiner Bio-One | 658175 | |
| Scepter 2.0 细胞计数仪 | Merck Millipore | 自动细胞计数仪 | |
| 96 孔多孔板，平底 | Nunc | 167008 | |
| 改进型纽鲍尔血细胞计数板 | BOECO Germany | BOE 01 | |
| Olympus IX51 倒置显微镜 | Olympus | IX51 | |
| CellTiter-Glo 2.0 检测试剂盒 | Promega | G9242 | 基于化学发光的检测方法 |
| Cytation 3 细胞成像多功能微孔板检测仪 | BioTek | 用于化学发光、荧光和明场细胞成像的微孔板检测仪 | |
| Gen5 数据分析软件 | BioTek | GEN5 |
参考文献
- Lane, D. P. Cancer. p53, guardian of the genome. Nature. 358 (6381), 15-16 (1992).
- Olivier, M., Hollstein, M., Hainaut, P. TP53 mutations in human cancers: origins, consequences, and clinical use. Cold Spring Harb Perspect Biol. 2 (1), a001008(2010).
- ....
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
重印与许可
