本方案描述了三种不同方法在乳腺癌细胞系增殖分析中的应用，包括传统细胞计数法、基于化学发光的细胞活力检测法以及利用细胞成像仪进行细胞计数的方法。每种方法均可实现细胞增殖的可重复性测量，并具有各自的优势。
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摘要
摘要
测量细胞增殖可通过多种不同方法进行，每种方法在灵敏度、可重复性以及与高通量操作格式的兼容性方面各不相同。本实验方案描述了三种用于体外（in vitro）测量细胞增殖的方法：传统的血细胞计数板计数法、基于发光检测的分析法（该方法通过检测活细胞代谢活性的变化来反映相对细胞数量），以及采用计数算法的多功能细胞成像仪法。每种方法在测量细胞增殖时均有其各自的优缺点，涉及时间消耗、成本以及与高通量操作的兼容性。本方案表明，这三种方法均可准确地随时间测量细胞增殖，并能灵敏地检测不同细胞密度下的生长情况。此外，使用细胞成像仪测量细胞增殖还可提供额外信息，如细胞形态、汇合度，并可实现对细胞增殖过程的连续动态监测。综上所述，这三种方法均能够有效测量细胞增殖，但具体方法的选择取决于用户需求。
引言
肿瘤抑制基因 p53 是多种细胞过程的关键调控因子，包括细胞周期阻滞、凋亡和细胞衰老1。它负责维持基因组稳定性，因此对于调控细胞死亡与细胞生长之间的平衡至关重要。p53 的突变在癌症中十分常见，是导致 p53 失活并引发癌细胞不受控增殖的主要原因2。有趣的是，p53 突变仅占乳腺癌病例的约 25%3，这表明其他机制也参与了 p53 功能的丧失。最近发现的 p53 异构体在多种人类癌症中呈现过表达，并可调节 p53 的功能4,5。我们先前的研究表明，p53 异构体 Δ40p53 是乳腺癌中表达水平最高的异构体，与正常邻近组织相比，在乳腺癌细胞中显著上调6。在此基础上，我们利用 LeGO-iG2-puro+ 载体（GFP+）对人乳腺癌细胞系 MCF-7 进行稳定转导，使其过表达 Δ40p537。这些细胞被用于研究高表达 Δ40p53 是否会增加乳腺癌细胞的增殖速率。
体外培养细胞的增殖检测方法有多种直接和间接手段in vitro8,9。这些方法可进行随时间连续监测，也可作为终点检测10。传统方法仍然具有实用性，例如使用血细胞计数板进行细胞计数。该方法成本较低，可直接测定细胞数量，但需要进行大量细胞计数，并依赖操作者高度熟练的技术，以尽量减少计数误差和较大的标准偏差。为满足高通量实验格式的需求，已发展出多孔板检测方法。这类基于发光信号的检测技术通过与细胞代谢活性成正比的发光信号来测定细胞数量11,12。近年来，高内涵成像平台的引入提供了新的工具，可在监测细胞增殖的同时，实现定量和定性表型数据的采集，涵盖多种系统13。所有这些方法均可用于测定细胞生长，无论是通过连续监测还是终点检测，各自在灵敏度、样本通量以及细胞信息获取方面均具有不同的优势与局限性，研究者可根据具体科学问题权衡选择。
本实验方案描述了三种不同的细胞增殖测定方法 体外，每种方法在灵敏度、重复性和多孔板格式方面各有不同。本方案旨在比较使用血细胞计数板、基于发光的细胞活力检测以及细胞成像仪，在96小时时间过程中对细胞增殖进行测量的效果。为此，采用三种不同的细胞密度，比较了转导空载体的细胞（MCF-7-LeGO）与过表达Δ40p53的转导细胞（MCF-7-Δ40p53）的生长情况。细胞增殖每24小时测定一次，持续至96小时。结果表明，每种方法均具有各自的优缺点，但根据实验目的的不同，每种方法仍可为细胞增殖速率提供有价值的信息。
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方案
1. 增殖实验前的细胞准备
注意：以相同方式制备两种细胞系，并以相同格式接种，用于每种待分析方法。
- 培养 MCF-7-LeGO 和 MCF-7-Δ40p53 7 细胞在T75 cm²培养瓶中培养至75-80%汇合度2 使用不含酚红的杜氏改良伊格尔培养基（DMEM），添加10%胎牛血清（FBS）、200 mM L-谷氨酰胺、2 µg/ml 胰岛素和1 µg/ml 嘌呤霉素，在37 °C、5% CO₂条件下培养于组织培养瓶中2在II级生物安全柜中无菌操作细胞。
注意：细胞生长至汇合所需的时间因接种稀释度的不同而有所差异。为准备进行增殖检测，将细胞以1:3的比例接种于添加补剂的DMEM培养基中，并在正常培养条件下培养3天，直至细胞达到75–80%汇合度。 - 为从培养瓶中去除细胞，将培养基倒入废液容器中。立即用 2 ml 预热的 2x 胰蛋白酶洗涤细胞层，吸除胰蛋白酶。再向细胞层加入 2 ml 预热的胰蛋白酶，于 37 °C、5% CO₂ 条件下放入培养箱孵育 5 分钟。2.
- 待细胞脱落之后，用10 ml预热的新鲜完全DMEM培养基洗涤细胞。将细胞悬液转移至无菌15 ml离心管中，在室温下以491 × g离心5分钟。小心吸除并弃去上清液。
- 将细胞沉淀重悬于5 ml新鲜的完全DMEM培养基中。进行细胞计数，以确定在96孔板中接种细胞的合适密度。
- 将100 µl细胞悬液加入900 µl 1x Dulbecco's磷酸盐缓冲液（DPBS）中稀释。将一个新的60 µm传感器安装至自动细胞计数仪上。按住活塞并将传感器浸入稀释后的细胞悬液中。缓慢释放细胞计数仪上的活塞。计数完成后，将传感器从细胞计数仪上取下。
注意：细胞计数器上显示的细胞数量单位为个/毫升。
- 将100 µl细胞悬液加入900 µl 1x Dulbecco's磷酸盐缓冲液（DPBS）中稀释。将一个新的60 µm传感器安装至自动细胞计数仪上。按住活塞并将传感器浸入稀释后的细胞悬液中。缓慢释放细胞计数仪上的活塞。计数完成后，将传感器从细胞计数仪上取下。
- 以约20%汇合度将细胞接种于96孔板中，终体积为100 µl（含DMEM），以预留细胞生长空间，并便于在3-5天内检测细胞增殖（参见 表1）。将所有细胞系以每组三个重复进行接种。
注意：本实验评估了三种不同的细胞密度，以确定最佳细胞密度。所需细胞数量总结如下 表1若需测量较长期的细胞生长，应以较低密度接种细胞。- 对于血细胞计数板和基于发光的检测，每个时间点准备一块培养板（即 每次检测使用4块板。对于细胞成像检测，在整个实验过程中仅准备一块板。
- 在37 °C、5% CO₂条件下培养细胞2 24 小时。
2. 使用血细胞计数板确定细胞数量
- 在细胞培养箱、烘箱或水浴中将培养基和胰蛋白酶预热至 37 °C。用废液收集容器吸除细胞中的培养基，加入 30 µl 的 2x 胰蛋白酶洗涤一次，然后吸除胰蛋白酶。
- 再次用 30 µl 的 2x 胰蛋白酶洗涤细胞，并在 37 °C 下孵育 5 分钟。轻轻敲击培养板边缘，使细胞从板底脱落。加入 50 µl 添加了补剂的 DMEM，通过移液混匀细胞，直至形成单细胞悬液。
- 用 70% 乙醇清洁血细胞计数板表面和盖玻片，以准备计数。
- 将盖玻片覆盖在计数室上方，并轻轻压紧，直至在盖玻片边缘与血细胞计数板之间可见“牛顿折射环”。
注意：这些环表明盖玻片已正确贴附于血细胞计数板上。 - 用移液器小心将 20 µl 细胞悬液从盖玻片边缘注入，依靠毛细作用充满计数室。将血细胞计数板置于显微镜下，使用 10x 物镜观察网格布局中的计数区域。
- 计数网格布局中四个角上的外侧大方格内的细胞。为提高准确性，可根据需要重复计数其他外侧大方格，或直至累计计数达到 70 - 100 个细胞14,15。
- 按下式计算每毫升细胞浓度：每方格平均细胞数 × 稀释倍数（如使用）× 104
- 接种后每 24 小时重复步骤 2.1–2.8，持续 96 小时。
3. 使用基于发光的检测法测定细胞增殖
注意：此为终点检测。一旦将试剂加入细胞后，该培养板仅能进行一次定量检测。
- 将发光试剂在 22 °C 水浴中解冻 30 分钟。
- 轻轻倒置试剂瓶，混匀以获得均一溶液。
- 将一块已接种细胞的培养板（来自步骤 1.5）在室温下平衡 30 分钟。
- 向每孔中加入 100 µl 发光试剂。在轨道摇床上混匀 2 分钟。将培养板在室温下孵育 10 分钟。
- 使用多功能酶标仪软件设置发光检测实验。
- 打开多功能酶标仪并启动软件。在“任务管理器”中选择“实验”和“新建”。从侧边工具栏选择“文件”，在“方案”选项卡下选择“程序”。
- 选择“Grenier 96 平底”板类型，并勾选“使用盖板”选项。在“读取方法”框中选择“读取”操作。选择“发光”检测模式。点击“确定”。
- 在读取步骤框中，于“全板”选项卡下选择需要扫描的孔，并指定作为空白对照的孔。
- 将滤光片设置为无滤光片（例如，插头，发射：孔，反射镜：无）。增益设为 135，每孔积分时间为 0.5 秒，读取高度为 6.5 mm。点击“确定”以保存发光读数的设置。
- 执行发光检测
- 选择“仪器控制”选项卡，点击“出板”以弹出板架。将 96 孔板放置在板架上，确保盖上盖板。在“仪器控制”选项卡下点击“进板”关闭板架。从工具栏点击“立即读取”以执行发光检测。
- 将各孔的相对发光单位（RLU）数值导出至电子表格，用于进一步分析。
- 重复步骤 3.1–3.6，每隔 24 小时记录一次细胞增殖情况，直至接种细胞后 96 小时。
4. 使用细胞成像仪测定细胞数量
- 使用多功能细胞成像仪软件设置细胞成像实验
- 打开多功能细胞成像仪并启动软件。
- 在“任务管理器”中，选择“实验”选项卡并点击“新建”。在“文件”工具栏中，点击“协议”选项卡，打开“步骤”选项卡。选择“设置温度”操作，将培养箱设为“开启”，温度设为 37 °C，并勾选“在继续下一步之前预热”复选框。点击“确定”以保存设置。
- 选择“读取”操作。点击“成像”检测方法，选择“终点/动力学”读取类型和“滤光片”光学类型。点击“确定”。点击“整板”选项卡，并选择需要成像的孔位。点击“确定”以保存设置。
- 从下拉的“物镜”选项中选择 2.5X 物镜。在“通道”选项卡下，选择两个通道：GFP 469, 525 和明场。为两个通道均勾选“自动曝光”，并选择用于自动曝光的孔。
- 为确定自动对焦设置，选择“自动对焦”并点击“选项”。在自动对焦选项中，选择“扫描后自动对焦”方法。点击“确定”以保存设置。
- 将孔中心的水平和垂直偏移（µm）设为 0。设置每孔采集多幅图像，采用 3 × 2 拼接模式，水平间距（µm）= 2,881，垂直间距（µm）= 2,127。点击“确定”以保存步骤设置。
注：读取参数详见 表 2。
- 对选定的培养板执行读取实验
- 点击“仪器控制”选项卡，选择“取出培养板”功能。将 96 孔板放入板架中，确保盖子已盖好。在“仪器控制”选项卡中，选择“放入培养板”功能。从板选项卡中选择“立即读取”。自接种后每 24 小时重复读取一次，直至 96 小时。
- 使用细胞成像仪软件分析细胞计数
- 要分析图像，请点击已成像板的“数据”选项卡，选择“图片 [GFP 469, 525 + 明场]”。双击一个已成像的孔。
- 点击加载的图像。选择“分析”，并选择拼接图像中的单幅图像进行分析。点击“确定”。仅勾选“GFP”通道，并按照 表 3 中列出的参数进行设置。点击“开始”以将参数应用于成像的细胞。
- 观察叠加在成像细胞上的细胞计数掩模，该掩模用于确定每幅图像的细胞数量。点击“应用更改”，并在整个实验过程中对所有成像板保持这些设置不变。
- 返回到已成像的板后，点击“数据”下拉菜单，选择“细胞计数”。这将生成每个孔的总细胞数。
- 通过点击“导出”选项卡，将所有数据导出至电子表格，以便进一步分析每个孔的细胞计数。
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结果
为了研究测量培养细胞增殖的不同方法，将转导了MCF-7-Δ40p53的细胞与未转导的MCF-7-LeGO乳腺癌细胞系的细胞增殖情况进行比较。所比较的三种方法——传统的血细胞计数板法、细胞活力发光检测法以及细胞成像分析法——已在示意图（图1）中概述。每种方法在随时间准确测定细胞数量方面均有其优缺点，最有效的方法取决于实验的终点需求以及可获取的细胞群体信息。
在接种后24小时至4天内，测量MCF-7-LeGO和MCF-7-Δ40p53细胞的生长情况。如图1所示，将两种细胞系以三种不同的细胞密度（1.5 × 103；3 × 103；5 × 103 个细胞/孔）接种，并在接种后24、48、72和96小时进行细胞计数。通过血细胞计数板、基于发光的检测法以及细胞成像仪（分别为图2a、b和
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讨论
本方案中考察了三种不同的方法来测量培养细胞的细胞增殖。每种方法均可在96小时内对细胞增殖进行可重复且准确的测量，且各方法之间的结果具有可比性（图2和图3）。基于发光的检测方法和细胞成像方法均获得了最稳健的结果，在96小时后显示出细胞增殖的线性增长（图2b、c）。此外，随时间推移的细胞成像显示，转导细胞系与非转导细胞系之间的生长速率无显著差异（图4）。
本方案中所考察的每种方法均有其优缺点，详见表5。使用血细胞计数板进行传统细胞计数的方法成本较低，所需额外试剂少，制备和操作过程简便。此外，该方法可提供以细胞数/毫升为单位的绝对细胞数量14。然而，该方法也存在严重缺点，包括细胞计数过程耗时、误差率高导致计数间标准差较大，以及准确计数需要较宽范围的细胞数量。这一点在图2a中可见，使用血细胞计数板在低细胞密度下表现出结果波动较大，且在后期时间点标准差显著增加。这些缺点...
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披露
作者声明不存在任何竞争性经济利益。
致谢
我们感谢 Hamish Campbell 博士和 Antony Braithwaite 教授在构建转导的 MCF-7-LeGO 细胞系过程中提供的帮助。我们感谢布卢姆菲尔德集团基金会通过亨特医学研究所在资金方面给予的支持。B.C.M. 获得了纽卡斯尔大学提供的澳大利亚研究生奖学金（APA）以及亨特医学研究所提供的 MM Sawyer 奖学金资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 不含酚红的杜尔贝科改良伊格尔培养基 | ThermoFisher Scientific | 21063-045 | 添加 10% 胎牛血清、200 mM L-谷氨酰胺、1 µg/ml 胰岛素和 1 µg/ml 嘌呤霉素 |
| L-谷氨酰胺溶液（100倍浓缩） | ThermoFisher Scientific | 25030-081 | |
| 人胰岛素溶液 | Sigma-Aldrich | I9278-5ML | |
| 胎牛血清（FBS） | Bovogen Biologicals | SFBS-F-500ml | |
| 盐酸嘌呤霉素二水合物 | Sigma-Aldrich | P9620-10ML | |
| 0.5% 胰蛋白酶-EDTA 溶液（10倍浓缩） | ThermoFisher Scientific | 15400-054 | 用 DPBS 稀释至 2 倍浓度 |
| 杜尔贝科磷酸盐缓冲液（DPBS）（1倍浓度） | ThermoFisher Scientific | 30028-02 | |
| 组织培养瓶，75 cm2 生长面积 | Greiner Bio-One | 658175 | |
| Scepter 2.0 细胞计数仪 | Merck Millipore | 自动细胞计数仪 | |
| 96 孔多孔板，平底 | Nunc | 167008 | |
| 改进型纽鲍尔血细胞计数板 | BOECO Germany | BOE 01 | |
| Olympus IX51 倒置显微镜 | Olympus | IX51 | |
| CellTiter-Glo 2.0 检测试剂盒 | Promega | G9242 | 基于化学发光的检测方法 |
| Cytation 3 细胞成像多功能微孔板检测仪 | BioTek | 用于化学发光、荧光和明场细胞成像的微孔板检测仪 | |
| Gen5 数据分析软件 | BioTek | GEN5 |
参考文献
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