本文介绍了一种可重复的小鼠Willis环分离方案。
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摘要
摘要
大脑动脉环（cerebral arterial circle，circulus arteriosus cerebri），又称威尔斯环（circle of Willis，CoW），是一个围绕视交叉和下丘脑的循环吻合结构，负责向大脑及周围组织供血。该结构与多种脑血管疾病相关，包括与脑淀粉样血管病（CAA）相关的血管病变、颅内动脉粥样硬化以及颅内动脉瘤。为了揭示这些疾病的分子机制并发现新的药物靶点以实现预防，需要借助动物模型开展研究。其中一些模型可能是转基因的，而另一些则涉及脑血管系统的分离，包括CoW的分离。本文所述方法适用于任何小鼠品系的CoW分离，在针对小鼠脑血管大血管的高通量筛选研究方面具有广阔的应用前景，可用于基因表达、蛋白质生成、翻译后蛋白修饰、分泌组分析等（etc.）研究。此外，通过调整专为分离的小鼠嗅动脉设计的器官浴系统，该方法也可用于离体（ex vivo）实验研究。
引言
脑动脉环（circulus arteriosus cerebri），也称为威尔氏环（circle of Willis，CoW）、威利斯环或威利斯多边形，最早由托马斯·威利斯（Thomas Willis）于1664年描述。该结构是一种位于视交叉和下丘脑周围的功能性动脉吻合环，可视为向大脑及周围结构供血的中心枢纽。血液通过颈内动脉和椎动脉进入此环，并经由大脑前动脉、大脑中动脉和大脑后动脉流出。这些动脉在环的左右两侧均有分支。基底动脉、后交通动脉和前交通动脉共同完成该环的闭合（图1 和 图2）。由于来自颈动脉系统和椎-基底动脉系统的血液在此汇合，即使某一支流出动脉血流受阻，其供血风险也被降至最低，从而确保大脑获得充足的血液供应。此外，该结构还在颈内动脉严重闭塞性疾病时，作为侧支循环血流的主要通路发挥关键作用。
多种脑血管疾病起源于大脑动脉环（CoW）。最常见的包括与脑淀粉样血管病（CAA）相关的血管病变、颅内动脉粥样硬化以及颅内动脉瘤。1,2,3 这些疾病可能导致由于血管扩张引起的脑灌注不足，并引发脑实质和/或蛛网膜下腔出血，最终导致缺血性或出血性脑卒中，或至少表现为短暂性脑缺血发作。近年来，诊断技术不断进步，包括神经影像学检查，可能结合血管造影，使得临床医生能够在无需脑组织活检的情况下诊断这些主要的脑血管疾病。然而，目前仍缺乏有效且特异性的治疗方法（药物或血管内治疗），因此有必要确定新的分子治疗靶点。
在人体中发现预防这些疾病的新药物靶点，将需要借助动物模型以及分离脑血管系统（包括大脑动脉环）的方法。这些模型应能提供证据并揭示在颅内动脉瘤、脑淀粉样血管病（CAA）或颅内动脉粥样硬化动物模型中，大血管壁发生的特定变化（包括炎症性改变）的相关线索。4,5,6
我们建立了一种小鼠大脑Willis环（CoW）血管分离的方法，以促进对阿尔茨海默病（AD）及相关疾病（如CAA）中血管炎症的研究。该小鼠CoW分离方法旨在评估疾病进展过程中脑血管壁的炎症相关基因表达。结合对软脑膜和软膜动脉管壁内淀粉样蛋白β沉积的检测，该方法有助于阐明脑血管壁炎症基因表达与Aβ肽段累积之间可能存在的关联。脑内的血管网络，包括蛛网膜下腔中的软脑膜和软膜血管，是构成Willis环的大动脉的延伸。本文所述方法可用于分离任何品系小鼠的Willis环，适用于对小鼠脑大血管的各种筛查分析（例如，基因表达、蛋白质生成及翻译后修饰）。
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方案
所有操作均遵循欧洲共同体关于实验动物护理和使用的标准，并经当地动物实验伦理委员会（Ile de France-Paris-委员会，许可号 4270）批准。
1. 麻醉
- 手术前，向成年小鼠腹腔注射致死剂量的戊巴比妥钠（最多 1 mg/10 g 体重），使用 27 号针头和 1 ml 注射器。
2. 血管灌注
注意：在血管灌注过程中无需在眼睛上涂抹眼膏。该操作过程迅速（5-10 分钟），并以动物死亡结束。通过脚趾夹捏确认动物无反应。
- 使用虹膜剪在肋骨下方约4厘米处的腹壁和腹膜上做一个切口。
- 在膈肌上做一个小切口（几毫米长），然后沿整个肋骨长度继续切开膈肌，以暴露胸膜腔。
- 将胸骨向上抬起，并用止血钳夹住胸骨尖端，将止血钳置于颈部。小心修剪连接胸骨与心脏的脂肪组织。
- 将15号灌注针穿过左心室插入心脏心尖。
- 最后，用剪刀剪开一个肝叶以形成出口。
注意：也可使用虹膜剪在右心房处做一切口，作为替代出口。 - 使用泵以2.5 ml/min的速度向动物体内灌注25至50 ml磷酸盐缓冲液（PBS）。随着血液被PBS取代，肝脏应逐渐变白。
- 约5分钟后，当从肝脏流出的液体完全澄清时，停止灌注。
- 如果计划进行免疫染色或常规染色，则以50 ml多聚甲醛（PFA；4%溶于PBS）灌注动物15分钟。
注意：注意，PFA蒸气有毒。含PFA的灌注操作应在通风良好的通风橱中进行。
3. 脑组织与威尔利斯环的分离
- 脑组织的分离
- 用手术剪剪下头部。
- 使用虹膜剪沿皮肤从颈部至鼻部做正中切口。
- 用虹膜剪修剪皮肤以暴露颅骨，并清除残留的肌肉和脂肪组织。
- 将虹膜剪的尖端从一侧枕骨大孔插入，小心沿颅骨内表面滑动至外耳道（也称为耳道）。
- 在对侧重复3.1.4中所述的切口，并沿顶间骨内表面做一中线切口，延伸至矢状缝起始处。
- 将虹膜剪插入前额骨正中、两眼之间的矢状缝处，然后打开剪刀以将颅骨纵向分为两半。
- 取出脑组织，抓住嗅球，并用虹膜剪切断其腹面的神经连接。
- 取出脑组织并置于含有冰冻 PBS 的 60 mm 培养皿中，用于 CoW 分离。将脑组织完全浸入 PBS 中。若脑组织已用 4% PFA 固定（用于后续切片及免疫染色或常规染色），则将其保存在 4% PFA 溶液中 4 °C 24 小时。
- 大脑动脉环的分离
注意：分离 CoW 需要使用解剖显微镜。脑组织应保持在 4 °C 在整个过程中。- 将脑组织倒置（即， 在其背侧表面以观察大脑动脉环（CoW）。
- 使用小镊子夹住嗅球基部的前 cerebral 动脉（ACA）a，图1）并施加压力，使其与血管主干分离。采用相同步骤切断大脑中动脉（MCA）。 b (图1).
- 使用镊子的尖端提起并移除构成大脑动脉环（CoW）的主要动脉。
- 用镊子夹住大脑中动脉（MCA），抬起后交通动脉（PCA）起始部，将其与脑组织分离。提起前部动脉（ACA 和 MCA），轻柔地沿前背侧方向牵拉至视交叉上方。为防止破坏大脑动脉环（CoW），需暂停操作以处理其他动脉。
- 重复步骤 3.2.2 和 3.2.3，用于小脑上动脉（SCA）和小脑后下动脉（PCA）c，图1)以及基底动脉（BA）(d，图1），将其向背侧-头侧方向牵拉。在完成3.2.4步骤所述操作时停止。
- 用镊子轻轻牵拉，取下完整的基底动脉环（CoW）。将CoW置于盛有冰冻PBS的60 mm培养皿中，用两把镊子去除残留的脑组织，并用小针固定CoW的位置。
- 将收获的 CoW 保存在 -80 °C 用于后续的RNA纯化（RNA提取可获得大量RNA——约500 ng）或蛋白质提取。
注意：CoW 可以维持 离体 24小时，通过改进用于分离小鼠嗅动脉的器官浴系统。 7
图1：小鼠脑腹侧视图的示意图，突出显示大脑动脉环（CoW）。 大脑动脉环（CoW）由两条颈内动脉（MCA）组成，这两条动脉源自两条大脑前动脉（ACA）；基底动脉（BA）分出大脑后动脉（PCA）和大脑上动脉（SCA），以及两条椎动脉（VA）。
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结果
用PBS灌注的小鼠被处死后，按照方案第3.2节所述方法分离脑底动脉环（CoW）。若解剖操作正确，脑底动脉环应完整取出，且由于血管内无残留血液，呈现轻微透明状。
图2： 分离后的小鼠大脑动脉环（CoW）。(A) 在10 cm培养皿中观察到的CoW整体结构。(B) CoW各分支的细节。MCA代表大脑中动脉，ACA代表大脑前动脉，BA代表基底动脉，PCA代表大脑后动脉，SCA代表大脑上动脉。
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讨论
本文介绍了一种可重复的 Willis 环分离方案。涉及 Willis 环（CoW）最常见的脑血管疾病包括与脑淀粉样血管病（CAA）相关的血管病变、颅内动脉粥样硬化以及颅内动脉瘤，这些疾病均影响动脉血管壁。尽管相关危险因素已较为明确，但这些脑部疾病的分子发病机制仍不清楚，且目前缺乏可用于预测其发生的特异性生物标志物。因此，人们迫切希望建立从小鼠转基因模型中分离 Willis 环的方法，以将宏观观察结果与分子水平的变化联系起来。例如，通过在特定基因敲除的小鼠模型中诱导出稳定的动脉瘤（如 Hosaka et al.8 所述），并分析其 Willis 环，即可判断靶向该基因编码蛋白的治疗手段是否能够预防颅内动脉瘤和/或蛛网膜下腔出血。显然，该方法也可用于分析特定药物对阿尔茨海默病（AD）各种转基因小鼠模型中 CAA 相关血管病变进展的影响。
分离小鼠动脉比纯化完整的小鼠微血管更容易，但与大鼠相比，小鼠的取材仍然更为困难。实际上，大鼠的Willis环嵌在更坚韧的脑膜中，因此可以一次性完整分离整个结构。除了小鼠血管本身尺寸较小之外，由于在取出脑组织前用P...
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披露
作者无任何利益冲突披露。
致谢
本工作由巴黎第六大学和皮埃尔·法布尔创新基金资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| Dulbecco’s 磷酸盐缓冲液 | Sigma-Aldrich | D8537 | |
| Dumont #55 镊子 | Fine Science Tools | 11295-51 | |
| 硬化精细虹膜剪 | Fine Science Tools | 14090-11 | |
| 剪刀 - 直头/锐/锐 16.5 cm | Fine Science Tools | 14002-16 | |
| Dumont #7b 镊子 | Fine Science Tools | 11270-20 | |
| 体视变倍显微镜 | Nikon | SMZ745T | |
| CellBIND 表面 60 mm 培养皿 | Corning | #3295 | |
| 蠕动泵 - MINIPULS 3 | Gilson | M312 | |
| 戊巴比妥钠 | Ceva Santé Animale | FR/V/2770465 3/1992 |
参考文献
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