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方法文章

胸腺类器官切片培养物的制备与应用

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DOI：

10.3791/54355

⸱

2016年8月6日

 ,  , 
1Centre de Recherche, Hôpital Maisonneuve-Rosemont, 2Department of Microbiology, Infectiology and Immunology, Université de Montréal, 3Department of Medicine, Université de Montréal

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

我们描述了胸腺切片的制备方法，该方法结合流式细胞术可用于模拟发育中T细胞的阳性选择和阴性选择。胸腺切片还可适用于 原位 通过免疫荧光和双光子显微镜分析胸腺细胞迁移、定位及信号传导。

摘要

胸腺选择在独特且高度有序的胸腺微环境中进行，从而产生具有功能且对自身耐受的T细胞库。体外研究T细胞谱系承诺与发育的模型为此过程提供了宝贵的见解。然而，这些系统缺乏T细胞发育所必需的完整三维胸腺环境，因此对体内胸腺选择的模拟并不完全。通过使用提供完整胸腺微环境的原位模型，可在一定程度上克服与模拟T细胞发育相关的部分挑战。胸腺组织切片类器官培养技术是对现有原位技术的有力补充。胸腺切片可保持胸腺皮质与髓质区域的完整性，并为研究特定发育阶段的外源性胸腺细胞或成熟胸腺微环境内源性T细胞的发育提供了平台。鉴于每只小鼠可制备约20片胸腺切片，该方法在高通量实验的可扩展性方面具有独特优势。此外，胸腺切片制备相对简便，且可叠加来自不同遗传背景的不同胸腺亚群或其他细胞群体，进一步增强了该方法的灵活性。本文中，我们描述了一种胸腺切片制备、胸腺细胞的分离与叠加以及胸腺切片解离用于流式细胞术分析的实验方案。该系统还可用于研究非传统T细胞的发育，并可通过双光子显微镜观察胸腺细胞迁移、胸腺细胞-基质细胞相互作用以及与胸腺选择相关的TCR信号。

引言

T细胞在胸腺中经历一系列发育中间阶段，在此过程中会遇到多个检查点，以确保产生功能正常且对自身抗原耐受的T细胞库1-3。阳性选择促进那些T细胞受体（TCR）能够以低至中等亲和力识别由皮质胸腺上皮细胞（cTEC）上的主要组织相容性复合物分子（MHC）提呈的肽段的胸腺细胞存活2,3。阴性选择和调节性T（Treg）细胞的发育则通过清除或转化那些对MHC提呈的自身肽段产生强烈反应的胸腺细胞，从而建立自身耐受2,4。表达TCR并成功通过选择过程的未成熟CD4+CD8+双阳性（DP）胸腺细胞，会分化为成熟的T细胞亚群，其中大多数为MHC I类限制性的CD8+细胞毒性T细胞或MHC II类限制性的CD4+辅助性单阳性（SP）T细胞，随后离开胸腺，进入次级淋巴器官执行效应功能1-3。

T细胞发育的复杂性还体现在发育中的胸腺细胞在整个基质细胞网络中的动态迁移和细胞间相互作用5-9。这些基质细胞在胸腺细胞发育过程中发挥着不同的作用，并在胸腺皮质区和髓质区之间呈差异性分布，而阳性选择和阴性选择分别发生于这两个区域10。尽管阳性选择主要发生在皮质区，但越来越多的证据表明，双阳性（DP）胸腺细胞会迁移至髓质区，并在分化为成熟T细胞之前继续依赖TCR信号，提示髓质区可能提供完成阳性选择及谱系分化所必需的额外信号11,12。此外，尽管存在表达并呈递组织限制性抗原的特化髓质胸腺上皮细胞（mTEC），从而促进自身反应性胸腺细胞的清除13,14，但大部分阴性选择实际上是由树突状细胞呈递广泛表达的自身肽段而在皮质区触发的15,16。因此，准确的T细胞发育模型必须具备高度组织化的胸腺微环境，包含完整的皮质和髓质区域，能够促进胸腺细胞与基质细胞之间的相互作用，并支持胸腺细胞在经历阳性与阴性选择过程中的迁移。

为了补充通过胸腺细胞的离体（ex vivo）分析来研究阳性选择和阴性选择的方法，研究人员已开发出多种T细胞发育的体外（in vitro）、原位（in situ）和体内（in vivo）模型17-22。在体外（in vitro）重现阳性选择一直极具挑战性，但将干细胞群体或T细胞前体与表达Notch配体（尤其是OP9-DL1/4细胞）的基质细胞共培养，能够支持T细胞谱系的定向分化以及有限的阳性选择，因此成为研究T细胞发育的重要体外模型23-25。然而，该系统的局限性在于这些细胞缺乏胸腺基质细胞所特有的肽类加工机制以及三维结构的胸腺微环境。

尽管在技术上更为繁琐， 原位 和 体内 胸腺选择模型可克服一些与之相关的障碍 体外 系统。胸腺器官再聚集培养（RTOC）包含明确配比的胸腺细胞与胸腺间质细胞18,26,27这些胸腺上皮细胞聚集体可维持MHC I类和II类分子的表达，并能支持常规T细胞两个亚群的发育，但仍缺乏明确的皮质和髓质结构。胎儿胸腺器官培养（FTOC）是一种常用的T细胞发育研究模型，可通过悬滴培养法将淋巴细胞耗竭的胸腺叶与胸腺细胞共培养，或通过向富含淋巴细胞的胸腺叶中注射胸腺细胞来接种，从而有效支持CD4+ 和 CD8+ 培养过程中T细胞随时间的变化18,28-31在胎儿胸腺叶培养的初期，mTEC数量较少，但根据培养条件的不同，随时间推移可能逐渐形成明确的皮质和髓质结构。需要注意的是，该模型可能更倾向于支持胎儿来源而非成体T细胞的发育。最后，在成年小鼠中进行胸腺内注射特定胸腺前体细胞虽在技术上具有挑战性，但明确可提供支持T细胞发育的微环境 T细胞发育 体内。这些 原位 和 体内 模型是研究T细胞发育的优秀工具，应根据具体实验情况决定是否使用。

然而，胸腺切片最近已成为研究胸腺选择的一种多功能且互补的模型 原位 能够容纳独特、复杂且通量通常更高的实验。胸腺切片保持了皮质区和髓质区的完整性，并提供了支持胸腺细胞在发育过程中迁移以及有效进行阳性选择和阴性选择的基质细胞框架11,32-39胸腺细胞亚群被添加至胸腺切片表面后，可迁移进入组织并到达其相应的微环境生态位34,37通过同源标记或荧光标记可将叠加的胸腺细胞与胸腺组织切片内源性细胞区分开来，并可在培养中维持数天。胸腺组织切片类器官培养可用于研究T细胞发育的多个方面，包括胸腺选择、胸腺细胞行为（迁移和细胞间相互作用）以及胸腺细胞定位等。鉴于每只小鼠可制备约20个胸腺切片，该方法的实验可扩展性通常优于其他方法。 原位 胸腺选择模型。尽管胸腺切片的制备需要使用振动切片机等专用设备，且由于细胞随时间推移发生死亡以及缺乏包被的膜结构，胸腺切片在培养中的存活时间有限，但胸腺切片仍为在成熟的胸腺微环境中分析同步化胸腺细胞群体的胸腺选择过程提供了优良模型。本文介绍胸腺切片的制备（包括胸腺的采集、胸腺叶的琼脂糖包埋及包埋组织的振动切片）、胸腺细胞的分离与覆加，以及胸腺切片的解离以进行流式细胞术分析。

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方案

所有动物实验方案均经玛桑诺-罗斯蒙特医院研究中心动物护理委员会批准。

1. 小鼠胸腺的采集以制备胸腺切片和单细胞悬液

  1. 使用 CO2 对小鼠实施安乐死，随后进行颈椎脱位。
  2. 在超净工作台内，将小鼠仰卧位固定于解剖板上。用 70% 乙醇喷洒小鼠体表，并用纱布轻轻吸去多余乙醇，以防止乙醇进入胸腔而损伤组织。
  3. 用镊子提起胸骨基部的皮肤，剪开切口，并将皮肤切口向上延伸至前肢两侧。
  4. 在胸骨基部做额外切口，以分离膈肌与肋骨 cage。然后沿肋骨 cage 两侧向锁骨方向剪开。将肋骨 cage 翻折至头部方向，暴露胸腔。胸腺的两个叶位于心脏上方。
  5. 使用镊子、显微解剖剪和/或尖头弯剪去除胸腺叶周围的结缔组织。用一对细尖弯镊通过下方或残留的结缔组织轻轻提起单个胸腺叶。
    注意：切勿直接夹取胸腺组织。
  6. 将分离的胸腺叶置于含有 PBS 的 15 ml 锥形管中，并置于冰上备用。

2. 胸腺叶的琼脂糖包埋与振动切片

  1. 通过将2 g低熔点琼脂糖溶解于50 ml无菌PBS中，并在低功率下微波加热至琼脂糖完全溶解，制备4%琼脂糖溶液用于包埋。用铝箔覆盖烧瓶，并置于55 °C水浴中备用。
  2. 在组织培养超净台中，配制含10%胎牛血清（FBS）、4 mM L-谷氨酰胺、1×青霉素/链霉素和10 µM 2-巯基乙醇的完全RPMI-1640培养基。
  3. 向6孔细胞培养板每孔加入1.5 ml完全RPMI-1640培养基，并在每孔中放置一个细胞培养小室。将培养板置于37 °C培养箱中备用。
  4. 在冰桶中用水和冰制备冰水混合浴。
  5. 使用精细尖头镊子小心去除每个胸腺叶周围残留的所有结缔组织。操作时可将胸腺叶浸没于组织培养皿中的PBS内，或转移至浸有PBS的无菌擦拭纸上，或在解剖显微镜下进行。
  6. 待琼脂糖冷却至低于40 °C（烧瓶仅微温）以避免组织过热。将冷却后的4%琼脂糖倒入组织模具中，高度约为1 cm。
  7. 用镊子小心将胸腺叶转移至无菌擦拭纸上，轻轻滚动以干燥组织，注意避免损伤。确保组织完全干燥，否则在切片过程中会从琼脂糖中滑脱。
  8. 小心将胸腺叶插入琼脂糖中，并将其水平放置（以增加每片切面的表面积）或垂直放置（以增加切片数量）于模具底部。将模具置于冰水中5–10分钟，使琼脂糖充分凝固。
  9. 在此期间，安装振荡切片机的缓冲槽、组装样品盘并插入振荡切片刀。在样品盘上贴一片实验室胶带。用70%乙醇对清洁且已组装的工作区域进行消毒。
  10. 琼脂糖完全凝固后，将模具倒置，轻轻按压其中心以释放包埋在琼脂糖中的胸腺叶。
  11. 使用锋利刀片修去胸腺叶周围的多余琼脂糖，每侧保留约2 mm，底部保留约0.5 cm。
  12. 用一滴组织胶将每个琼脂糖块固定在样品盘的胶带上。可在胶带上粘贴多个琼脂糖块。
  13. 调整振荡切片刀与琼脂糖块顶部对齐。向缓冲槽中加入无菌PBS，直至刀片和琼脂糖块完全浸没。
  14. 对包埋在琼脂糖中的组织进行切片，获得厚度为400–500 µm的切片。将振荡切片机参数设置为速度0.225 mm/sec、频率100 Hz、角度5°。
  15. 使用弯头刮铲在切片过程中将胸腺切片收集至含有无菌PBS的组织培养板中。弃去首片和末片切片。
  16. 在4倍光学显微镜下观察切片。选择含有完整胸腺组织及周围琼脂糖的切片（图1A）。
  17. 使用移液器吸头将切片从弯头刮铲轻轻滑入步骤2.3中准备好的细胞培养小室中。每个小室可容纳约3个切片。确保切片之间以及切片与细胞培养小室壁之间互不接触。
  18. 将培养板保存在37 °C环境中备用。

3. 准备用于覆盖的胸腺细胞

  1. 按照第1节所述方法分离胸腺叶。使用装有5 ml含2% FBS的无菌PBS的无菌15 ml组织研磨器手动解离胸腺叶，制备单细胞悬液。将细胞转移至15 ml锥形管中。
  2. 在4 °C下以545 × g离心5分钟。弃去上清液，将细胞重悬于1 ml 1× ACK裂解缓冲液（0.15 M NH4Cl、10 mM KHCO3、0.1 mM Na2EDTA）中，室温孵育3分钟以裂解红细胞。
  3. 用含2% FBS的PBS将管内液体补至15 ml。在4 °C下以545 × g离心5分钟。
  4. 将细胞重悬于10 ml含2% FBS的PBS中，并通过255 µm孔径滤膜过滤。
  5. 使用血细胞计数板对细胞进行计数。在4 °C下以545 × g离心5分钟，将细胞沉淀重悬于含2% FBS的PBS中，调整细胞浓度至每毫升1 × 107个细胞。
  6. 若未使用表达同源标记或基因编码荧光报告蛋白的小鼠胸腺细胞来区分切片内源性细胞，则需根据制造商说明书用细胞染料（如羧基荧光素琥珀酰亚胺酯，CFSE）对细胞进行标记。
  7. 标记细胞最后一次洗涤后，将细胞沉淀重悬于完全RPMI-1640培养基中，调整浓度为每15 µl含1–3 × 106个细胞。

4. 将胸腺细胞覆盖于胸腺切片上

  1. 使用移液器吸取插入物上胸腺切片周围的任何液体 。
    注意：注意避免损坏琼脂糖。如果琼脂糖受损，由于表面张力丧失，覆盖的胸腺细胞将无法附着在切片表面。
  2. 用移液器将15 µl在第3部分中制备的胸腺细胞悬液加至每个胸腺切片上，注意移液器吸头不要接触切片。
  3. 将培养板在37 °C孵育2小时，以使细胞迁移进入胸腺切片。
  4. 2小时后，用1 ml PBS将胸腺切片冲洗3次，以去除尚未迁移进入组织的过量胸腺细胞。
  5. 将培养板在37 °C继续孵育，直至胸腺切片达到收获条件，通常为1–72小时，具体时间取决于实验设计。

5. 用于流式细胞术的胸腺组织切片解离

  1. 为每个切片准备一个微量离心管，每管加入含2% FBS的150 µl PBS。
  2. 向含有胸腺切片的组织培养小室中加入1 ml含2% FBS的PBS，并用弯头刮勺轻轻搅拌，使切片从培养小室表面脱离。
  3. 用弯头刮勺将切片从小室转移至微量离心管中。
  4. 使用微量离心管样品研磨杵手动破碎切片。再加入150 µl含2% FBS的PBS，终体积为300 µl。
  5. 将解离的组织通过40 µm滤膜过滤至新的微量离心管中。过滤后的细胞即可用于流式细胞术染色分析40。
  6. 在上流式细胞仪前再次过滤细胞，以确保完全去除琼脂糖，防止堵塞流式细胞仪。
  7. 使用流式细胞仪获取细胞数据，并按照先前所述方法进行数据分析40。

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结果

胸腺切片支持对T细胞发育不同方面的分析，例如阳性选择和阴性选择。实验成功的关键在于胸腺切片的质量。 因此，应检查胸腺切片，以确保胸腺组织的完整性以及包围胸腺切片的琼脂糖完整无损（图1A）。当琼脂糖受损时，表面张力可能被破坏，导致迁移进入组织的胸腺细胞数量显著减少。因此，凡显示组织损伤或琼脂糖出现缺口/撕裂的胸腺切片均应弃用（图1B).

TCR 转基因（tg）小鼠常被用于研究胸腺选择，因为其每个胸腺细胞表面均表达一种明确且功能性的 TCR，使得阳性选择的发生频率高于多克隆细胞群体。为了捕获阳性选择的各个阶段，可将未经历选择的 TCR tg 胸腺细胞接种于胸腺组织切片之上，并通过流式细胞术随时间追踪成熟 CD4+ 或 CD8+ 单阳性（SP）T 细胞的发育过程40。来源于 MHC I 类限制...

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讨论

本文描述了一种制备胸腺切片的方案，并展示了通过流式细胞术分析在预选择阶段的MHC I类限制性TCR转基因胸腺细胞上高效进行阳性与阴性选择的代表性结果。该系统已被成功用于支持MHC II类限制性CD4+ T细胞从预选择双阳性（DP）胸腺细胞中的阳性选择32，并且在激动性抗原存在下，还可支持阴性选择及胸腺调节性T细胞（Treg）的发育11,12,36,38,39,43,44。本方案可进行修改，以研究在抑制剂、特定肽段、基因修饰的胸腺细胞或基质细胞群体存在或缺失条件下胸腺选择的过程。胸腺切片也适用于叠加除胸腺细胞亚群以外的其他细胞群体。例如，最近的研究表明，叠加在胸腺切片上的树突状细胞能够有效迁移进入组织，并支持阴性选择和Treg的发育39,43。迄今为止的研究均使用预选择的双阳性（DP）胸腺细胞或总胸腺细胞来研究阳性与阴性选择。尽管T细胞在胸腺切片中至少可发育4天，但如果希望使用更早期的前体细胞群体开展实验，则需注意该系统的局限性：由于细胞死亡以及缺乏包被膜结构，胸腺切片的质量在培养1至2天后即开始下降。

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披露

作者声明不存在任何竞争性经济利益。

致谢

我们感谢 Marilaine Fournier 对手稿的评论以及 Josée Tessier 提供的技术支持。C57BL/6-Tg (OT-I)-RAG1 #4175 小鼠通过美国国家过敏与传染病研究所（NIAID）交换项目（NIH）获得。本研究得到了病童基金会和 CIHR-IHDCYN（NI15-002）的资助，CIHR-III（MOP-142254）的运行基金，以及来自魁北克健康研究基金会（FRQS）青年研究人员启动基金（Établissement de jeunes chercheurs）和霍舍维尔-罗斯蒙特医院基金会向 HJM 提供的启动资金支持。HJM 是魁北克健康研究基金会（FRQS）的初级一级学者、加拿大健康研究院（CIHR）新研究者（MSH-141967）以及科尔基金会早期职业转型奖获得者。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
振动切片机Leica BiosystemsVT1000S 
NuSieve GTG 琼脂糖Lonza50080低熔点琼脂糖
包埋模具（截断型 - T12）Polyciences1898622 mm × 22 mm 方形，截断至 12 mm × 12 mm
双刃切片刀Personna74-0002
组织粘合剂3M 1469SB
0.4 µm 细胞培养小室插件 BD Falcon353090在测试的多个品牌中，该产品能最有效地使细胞保持在组织切片上方
杜氏磷酸盐缓冲液ThermoFisher21600-010
含 L-谷氨酰胺的 RPMI-1640 培养基Wisent350-000-CL
胎牛血清Wisent080-110经热灭活处理
L-谷氨酰胺，200 mMWisent609-065-EL
青霉素/链霉素，100 倍浓度Wisent450-201-EL
2-巯基乙醇Alfa AesarA15890
15 ml Tenbroeck 组织研磨器Wheaton357426
尼龙筛网滤器Component SupplyU-CMN-255
微量离心管样品研磨杵Bel-ArtF19922-0000
40 µm 尼龙细胞筛BD Falcon352340
不锈钢尖头镊子Dumont RS-5047细尖弯头镊子，尺寸为 0.17 × 0.10 mm
微型镊子Dumont RS-5090 

参考文献

  1. Carpenter, A. C., Bosselut, R. Decision checkpoints in the thymus. Nat Immunol. 11, 666-673 (2010).
  2. Starr, T. K., Jameson, S. C., Hogquist, K. A. Positive and negative selection of T cells. Annu Rev Immunol. 21, 139-176 (2003).
  3. Vrisekoop, N., Monteiro, J. P., Mandl, J. N., Germain, R. N. Revisiting thymic positive selection and the mature T cell repertoire for antigen. Immunity. 41, 181-190 (2014).
  4. Stritesky, G. L., Jameson, S. C., Hogquist, K. A. Selection of self-reactive T cells in the thymus. Annu Rev Immunol. 30, 95-114 (2012).
  5. Bousso, P., Bhakta, N. R., Lewis, R. S., Robey, E. Dynamics of thymocyte-stromal cell interactions visualized by two-photon microscopy. Science. 296, 1876-1880 (2002).
  6. Takahama, Y. Journey through the thymus: stromal guides for T-cell development and selection. Nat Rev Immunol. 6, 127-135 (2006).
  7. Halkias, J., Melichar, H. J., Taylor, K. T., Robey, E. A. Tracking migration during human T cell development. Cell Mol Life Sci. 71, 3101-3117 (2014).
  8. Yin, X., Chtanova, T., Ladi, E., Robey, E. A. Thymocyte motility: mutants, movies and migration patterns. Curr Opin Immunol. 18, 191-197 (2006).
  9. Ladi, E., Yin, X., Chtanova, T., Robey, E. A. Thymic microenvironments for T cell differentiation and selection. Nat Immunol. 7, 338-343 (2006).
  10. Klein, L., Kyewski, B., Allen, P. M., Hogquist, K. A. Positive and negative selection of the T cell repertoire: what thymocytes see (and don't see). Nat Rev Immunol. 14, 377-391 (2014).
  11. Ross, J. O., et al. Distinct phases in the positive selection of CD8+ T cells distinguished by intrathymic migration and T-cell receptor signaling patterns. Proc Natl Acad Sci U S A. 111, E2550-E2558 (2014).
  12. Hu, Z., Lancaster, J. N., Sasiponganan, C., Ehrlich, L. I. CCR4 promotes medullary entry and thymocyte-dendritic cell interactions required for central tolerance. J Exp Med. 212, 1947-1965 (2015).
  13. Anderson, M. S., et al. Projection of an immunological self shadow within the thymus by the aire protein. Science. 298, 1395-1401 (2002).
  14. Takaba, H., et al. Fezf2 Orchestrates a Thymic Program of Self-Antigen Expression for Immune Tolerance. Cell. 163, 975-987 (2015).
  15. McCaughtry, T. M., Baldwin, T. A., Wilken, M. S., Hogquist, K. A. Clonal deletion of thymocytes can occur in the cortex with no involvement of the medulla. J Exp Med. 205, 2575-2584 (2008).
  16. Stritesky, G. L., et al. Murine thymic selection quantified using a unique method to capture deleted T cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 110, 4679-4684 (2013).
  17. Anderson, G., Jenkinson, E. J. Review article: thymus organ cultures and T-cell receptor repertoire development. Immunology. 100, 405-410 (2000).
  18. Hare, K. J., Jenkinson, E. J., Anderson, G. In vitro models of T cell development. Semin Immunol. 11, 3-12 (1999).
  19. de Pooter, R., Zuniga-Pflucker, J. C. T-cell potential and development in vitro: the OP9-DL1 approach. Curr Opin Immunol. 19, 163-168 (2007).
  20. Lian, Z., et al. Intrathymically injected hemopoietic stem cells can differentiate into all lineage cells in the thymus: differences between c-kit+ cells and c-kit < low cells. Stem Cells. 15, 430-436 (1997).
  21. Manna, S., Bhandoola, A. Intrathymic Injection. Methods Mol Biol. 1323, 203-209 (2016).
  22. Goldschneider, I., Komschlies, K. L., Greiner, D. L. Studies of thymocytopoiesis in rats and mice. I. Kinetics of appearance of thymocytes using a direct intrathymic adoptive transfer assay for thymocyte precursors. J Exp Med. 163, 1-17 (1986).
  23. Schmitt, T. M., Zuniga-Pflucker, J. C. Induction of T cell development from hematopoietic progenitor cells by delta-like-1 in vitro. Immunity. 17, 749-756 (2002).
  24. de Pooter, R. F., Schmitt, T. M., Zuniga-Pflucker, J. C. In vitro generation of T lymphocytes from embryonic stem cells. Methods Mol Biol. 330, 113-121 (2006).
  25. Dervovic, D. D., Ciofani, M., Kianizad, K., Zuniga-Pflucker, J. C. Comparative and functional evaluation of in vitro generated to ex vivo CD8 T cells. J Immunol. 189, 3411-3420 (2012).
  26. White, A., Jenkinson, E., Anderson, G. Reaggregate thymus cultures. J Vis Exp. (18), (2008).
  27. Anderson, G., Owen, J. J., Moore, N. C., Jenkinson, E. J. Thymic epithelial cells provide unique signals for positive selection of CD4+CD8+ thymocytes in vitro. J Exp Med. 179, 2027-2031 (1994).
  28. Anderson, G., Jenkinson, E. J. Fetal thymus organ culture. CSH Protoc. , (2007).
  29. Mazda, O., Watanabe, Y., Gyotoku, J., Katsura, Y. Requirement of dendritic cells and B cells in the clonal deletion of Mls-reactive T cells in the thymus. J Exp Med. 173, 539-547 (1991).
  30. Ceredig, R., Jenkinson, E. J., MacDonald, H. R., Owen, J. J. Development of cytolytic T lymphocyte precursors in organ-cultured mouse embryonic thymus rudiments. J Exp Med. 155, 617-622 (1982).
  31. Fairchild, P. J., Austyn, J. M. Developmental changes predispose the fetal thymus to positive selection of CD4+CD8 T cells. Immunology. 85, 292-298 (1995).
  32. Bhakta, N. R., Oh, D. Y., Lewis, R. S. Calcium oscillations regulate thymocyte motility during positive selection in the three-dimensional thymic environment. Nat Immunol. 6, 143-151 (2005).
  33. Le Borgne, M., et al. The impact of negative selection on thymocyte migration in the medulla. Nat Immunol. 10, 823-830 (2009).
  34. Ehrlich, L. I., Oh, D. Y., Weissman, I. L., Lewis, R. S. Differential contribution of chemotaxis and substrate restriction to segregation of immature and mature thymocytes. Immunity. 31, 986-998 (2009).
  35. Ueda, Y., et al. Mst1 regulates integrin-dependent thymocyte trafficking and antigen recognition in the thymus. Nat Commun. 3, 1098(2012).
  36. Dzhagalov, I. L., Chen, K. G., Herzmark, P., Robey, E. A. Elimination of self-reactive T cells in the thymus: a timeline for negative selection. PLoS Biol. 11, e1001566(2013).
  37. Halkias, J., et al. Opposing chemokine gradients control human thymocyte migration in situ. J Clin Invest. 123, 2131-2142 (2013).
  38. Au-Yeung, B. B., et al. Quantitative and temporal requirements revealed for Zap70 catalytic activity during T cell development. Nat Immunol. 15, 687-694 (2014).
  39. Melichar, H. J., Ross, J. O., Herzmark, P., Hogquist, K. A., Robey, E. A. Distinct temporal patterns of T cell receptor signaling during positive versus negative selection in situ. Sci Signal. 6, (2013).
  40. Hu, Q., Nicol, S. A., Suen, A. Y., Baldwin, T. A. Examination of thymic positive and negative selection by flow cytometry. J Vis Exp. (68), e4269(2012).
  41. Mombaerts, P., et al. RAG-1-deficient mice have no mature B and T lymphocytes. Cell. 68, 869-877 (1992).
  42. Hogquist, K. A., et al. T cell receptor antagonist peptides induce positive selection. Cell. 76, 17-27 (1994).
  43. Weist, B. M., Kurd, N., Boussier, J., Chan, S. W., Robey, E. A. Thymic regulatory T cell niche size is dictated by limiting IL-2 from antigen-bearing dendritic cells and feedback competition. Nat Immunol. 16, 635-641 (2015).
  44. Melichar, H. J., Ross, J. O., Taylor, K. T., Robey, E. A. Stable interactions and sustained TCR signaling characterize thymocyte-thymocyte interactions that support negative selection. J Immunol. 194, 1057-1061 (2015).
  45. Hadjantonakis, A. K., Macmaster, S., Nagy, A. Embryonic stem cells and mice expressing different GFP variants for multiple non-invasive reporter usage within a single animal. BMC Biotechnol. 2, (2002).
  46. Schaefer, B. C., Schaefer, M. L., Kappler, J. W., Marrack, P., Kedl, R. M. Observation of antigen-dependent CD8+ T-cell/ dendritic cell interactions in vivo. Cell Immunol. 214, 110-122 (2001).

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