胸腺类器官切片培养物的制备与应用

摘要

我们描述了胸腺切片的制备方法，该方法结合流式细胞术可用于模拟发育中T细胞的阳性选择和阴性选择。胸腺切片还可适用于 原位 通过免疫荧光和双光子显微镜分析胸腺细胞迁移、定位及信号传导。

摘要

胸腺选择在独特且高度有序的胸腺微环境中进行，从而产生具有功能且对自身耐受的T细胞库。体外研究T细胞谱系承诺与发育的模型为此过程提供了宝贵的见解。然而，这些系统缺乏T细胞发育所必需的完整三维胸腺环境，因此对体内胸腺选择的模拟并不完全。通过使用提供完整胸腺微环境的原位模型，可在一定程度上克服与模拟T细胞发育相关的部分挑战。胸腺组织切片类器官培养技术是对现有原位技术的有力补充。胸腺切片可保持胸腺皮质与髓质区域的完整性，并为研究特定发育阶段的外源性胸腺细胞或成熟胸腺微环境内源性T细胞的发育提供了平台。鉴于每只小鼠可制备约20片胸腺切片，该方法在高通量实验的可扩展性方面具有独特优势。此外，胸腺切片制备相对简便，且可叠加来自不同遗传背景的不同胸腺亚群或其他细胞群体，进一步增强了该方法的灵活性。本文中，我们描述了一种胸腺切片制备、胸腺细胞的分离与叠加以及胸腺切片解离用于流式细胞术分析的实验方案。该系统还可用于研究非传统T细胞的发育，并可通过双光子显微镜观察胸腺细胞迁移、胸腺细胞-基质细胞相互作用以及与胸腺选择相关的TCR信号。

引言

T细胞在胸腺中经历一系列发育中间阶段，在此过程中会遇到多个检查点，以确保产生功能正常且对自身抗原耐受的T细胞库^1-3。阳性选择促进那些T细胞受体（TCR）能够以低至中等亲和力识别由皮质胸腺上皮细胞（cTEC）上的主要组织相容性复合物分子（MHC）提呈的肽段的胸腺细胞存活^2,3。阴性选择和调节性T（T_reg）细胞的发育则通过清除或转化那些对MHC提呈的自身肽段产生强烈反应的胸腺细胞，从而建立自身耐受^2,4。表达TCR并成功通过选择过程的未成熟CD4⁺CD8⁺双阳性（DP）胸腺细胞，会分化为成熟的T细胞亚群，其中大多数为MHC I类限制性的CD8⁺细胞毒性T细胞或MHC II类限制性的CD4⁺辅助性单阳性（SP）T细胞，随后离开胸腺，进入次级淋巴器官执行效应功能^1-3。

T细胞发育的复杂性还体现在发育中的胸腺细胞在整个基质细胞网络中的动态迁移和细胞间相互作用^5-9。这些基质细胞在胸腺细胞发育过程中发挥着不同的作用，并在胸腺皮质区和髓质区之间呈差异性分布，而阳性选择和阴性选择分别发生于这两个区域¹⁰。尽管阳性选择主要发生在皮质区，但越来越多的证据表明，双阳性（DP）胸腺细胞会迁移至髓质区....

方案

所有动物实验方案均经玛桑诺-罗斯蒙特医院研究中心动物护理委员会批准。

1. 小鼠胸腺的采集以制备胸腺切片和单细胞悬液

1. 使用 CO₂ 对小鼠实施安乐死，随后进行颈椎脱位。
2. 在超净工作台内，将小鼠仰卧位固定于解剖板上。用 70% 乙醇喷洒小鼠体表，并用纱布轻轻吸去多余乙醇，以防止乙醇进入胸腔而损伤组织。
3. 用镊子提起胸骨基部的皮肤，剪开切口，并将皮肤切口向上延伸至前肢两侧。
4. 在胸骨基部做额外切口，以分离膈肌与肋骨 cage。然后沿肋骨 cage 两侧向锁骨方向剪开。将肋骨 cage 翻折至头部方向，暴露胸腔。胸腺的两个叶位于心脏上方。
5. 使用镊子、显微解剖剪和/或尖头弯剪去除胸腺叶周围的结缔组织。用一对细尖弯镊通过下方或残留的结缔组织轻轻提起单个胸腺叶。
   注意：切勿直接夹取胸腺组织。
6. 将分离的胸腺叶置于含有 PBS 的 15 ml 锥形管中，并置于冰上备用。

2. 胸腺叶的琼脂糖包埋与振动切片

1. 通过将2 g低熔点琼脂糖溶解于50 ml无菌PBS中，并在低功率下微波加热至琼脂糖完全溶解，制备4%琼脂糖溶液用于包埋。用铝箔覆盖烧瓶，并置于55 °C水浴中备用。
2. 在组织培养超净台中，配制含10%胎牛血清（FBS）、4 mM L-谷氨酰胺、1×青霉素/链霉素和10....

结果

胸腺切片支持对T细胞发育不同方面的分析，例如阳性选择和阴性选择。实验成功的关键在于胸腺切片的质量。 因此，应检查胸腺切片，以确保胸腺组织的完整性以及包围胸腺切片的琼脂糖完整无损（图1A）。当琼脂糖受损时，表面张力可能被破坏，导致迁移进入组织的胸腺细胞数量显著减少。因此，凡显示组织损伤或琼脂糖出现缺口/撕裂的胸腺切片均应弃用（图1B).

TCR 转基因（tg）小鼠常被用于研究胸腺选择，因为其每个胸腺细胞表面均表达一种明确且功能性的 TCR，使得阳性选择的发生频率高于多克隆细胞群体。为了捕获阳性选择的各个阶段，可将未经历选择的 TCR tg 胸腺细胞接种于胸腺组织切片之上，并通过流式细胞术随时间追踪成熟 CD4⁺ 或 CD8⁺ 单阳性（SP）T 细胞的发育过程⁴⁰。来源于 MHC I 类限制.......

讨论

本文描述了一种制备胸腺切片的方案，并展示了通过流式细胞术分析在预选择阶段的MHC I类限制性TCR转基因胸腺细胞上高效进行阳性与阴性选择的代表性结果。该系统已被成功用于支持MHC II类限制性CD4⁺ T细胞从预选择双阳性（DP）胸腺细胞中的阳性选择³²，并且在激动性抗原存在下，还可支持阴性选择及胸腺调节性T细胞（T_reg）的发育^{11,12,36,38,39,43,44}。本方案可进行修改，以研究在抑制剂、特定肽段、基因修饰的胸腺细胞或基质细胞群体存在或缺失条件下胸腺选择的过程。胸腺切片也适用于叠加除胸腺细胞亚群以外的其他细胞群体。例如，最近的研究表明，叠加在胸腺切片上的树突状细胞能够有效迁移进入组织，并支持阴性选择和T_reg的发育^39,43。迄今为止的研究均使用预选择的双阳性（DP）胸腺细胞或总胸腺细胞来研究阳性与阴性选择。尽管T细胞在胸腺切片中至少可发育4天，但如果希望使用更早期的前体细胞群体开展实验，则需注意该系统的局限性：由于细胞死亡以及缺乏包被膜结构，胸腺切片的质量在培养1至2天后即开始下降。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
振动切片机	Leica Biosystems	VT1000S
NuSieve GTG 琼脂糖	Lonza	50080	低熔点琼脂糖
包埋模具（截断型 - T12）	Polyciences	18986	22 mm × 22 mm 方形，截断至 12 mm × 12 mm
双刃切片刀	Personna	74-0002
组织粘合剂	3M	1469SB
0.4 µm 细胞培养小室插件	BD Falcon	353090	在测试的多个品牌中，该产品能最有效地使细胞保持在组织切片上方
杜氏磷酸盐缓冲液	ThermoFisher	21600-010
含 L-谷氨酰胺的 RPMI-1640 培养基	Wisent	350-000-CL
胎牛血清	Wisent	080-110	经热灭活处理
L-谷氨酰胺，200 mM	Wisent	609-065-EL
青霉素/链霉素，100 倍浓度	Wisent	450-201-EL
2-巯基乙醇	Alfa Aesar	A15890
15 ml Tenbroeck 组织研磨器	Wheaton	357426
尼龙筛网滤器	Component Supply	U-CMN-255
微量离心管样品研磨杵	Bel-Art	F19922-0000
40 µm 尼龙细胞筛	BD Falcon	352340
不锈钢尖头镊子	Dumont	RS-5047	细尖弯头镊子，尺寸为 0.17 × 0.10 mm
微型镊子	Dumont	RS-5090