一种非细胞接触式双细胞共培养插件系统的开发

摘要

在多细胞生物中，分泌的可溶性因子通过旁分泌信号传导，引发不同类型细胞的反应。插入式共培养系统提供了一种简单的方法，可在无细胞间直接接触的情况下评估分泌的可溶性因子所介导的变化。

摘要

分泌型可溶性因子在调控细胞反应中的作用是各类组织和系统研究中反复出现的主题。为了简化多细胞生物中多种细胞亚型之间极为复杂的关系，研究人员已开发出体外（in vitro）技术，以深入理解单一细胞群体的行为。其中一种技术采用带有通透性膜的插入式培养小室，使分泌的可溶性因子得以扩散。因此，可将生长在插入小室中的一群细胞与另一类细胞共同培养于同一孔板或培养皿中，从而在无细胞间直接接触的条件下，评估旁分泌信号传导所引发的细胞变化。此类插入式共培养系统相较于其他共培养技术具有多种优势，包括支持双向信号传递、维持细胞极性，以及能够特异性检测特定细胞群体的改变。除了广泛应用于炎症、癌症、血管生成和分化研究外，这类共培养系统在研究中枢神经系统中不同细胞亚型之间复杂相互作用方面尤为重要，特别是在神经炎症的背景下。本文旨在提供通用的方法学指导，以建立基于插入式共培养系统来评估分泌型可溶性因子介导的细胞变化的实验。此外，还将详细描述一项具体实验方案：检测脂多糖激活的N9小胶质细胞所分泌的细胞因子对神经元样PC12细胞产生的神经炎症效应，从而为插入式共培养技术提供具体而清晰的理解。

引言

组织、器官或系统的研究 体外 旨在简化构成多细胞生物的多种细胞亚型之间存在的极为复杂的相互关系。事实上， 体外 研究使得深入理解单细胞群体成为可能。进行此类研究有两个主要优势。 体外 实验具有两个优势：1）减少细胞间的相互作用；2）能够便捷地调控细胞所处的微环境。因此，这两个优势使得科学家能够预测特定细胞类型的行为 体内，从而能够在整体生物体水平上调控外部因素的影响结果。从这一意义上讲， 体外 细胞培养常常作为连接基础生命科学与应用生命科学的桥梁。然而，进行细胞培养也存在若干缺点 体外，其中最重要的一点是，所观察到的表型在生理相关性方面可能存在一定局限性。事实上，当单一细胞类型在培养容器中生长时，该培养体系在不同程度上失去了与其他细胞类型的细胞间连接，失去了对原组织及机体体液环境的贡献，也失去了在组织中维持其特定三维结构（有时对细胞功能至关重要）的锚定位点。

细胞间关系的问题已通过混合培养技术的发展得到解决。该方法将两种或多种细胞群体共同培养于同一培养容器中。然而，这种混合培养存在重要缺陷。一方面，某些细胞亚型在来源组织中并不直接发生物理相互作用，而是完全依赖由分泌的可溶性因子和邻近受体介导的旁分泌信号进行通讯。许多依赖邻近细胞因子信号传导的炎症过程即属于此类情况。在混合培养中，细胞间的物理接触不可避免，导致无法在排除细胞间直接接触的情况下研究旁分泌通讯，而这些接触可能....

方案

注意：以下每个步骤均须在层流罩内按哺乳动物细胞培养要求的无菌条件下进行。此外，还需遵循最佳无菌细胞培养的一般准则。 例如，弃去吸头时应避免任何可能导致交叉污染的情况，在进行全量换液时尽量减少细胞暴露于空气中的时间，所有细胞悬液均需适当且轻柔地混匀以确保移液均匀等。此外，小室（inserts）属于需要特殊操作的一类塑料耗材。首先，操作小室时应避免触碰其脆弱的膜，该膜极易撕裂，可能因此危及实验结果。其次，不宜采用真空抽吸法去除细胞培养基，因其存在刺穿膜或使贴壁细胞脱落的风险。再者，小室在多孔组织培养板中为悬垂状态，因此在移动耗材或移液时需格外小心，以防贴壁细胞脱落。此外，当使用孔径较大的小室时，培养基可能渗过膜，因此需频繁监测液体水平。最后需注意，本方案专为贴壁细胞设计，若用于悬浮细胞，需进行少量修改。

1. 进行插入式共培养实验的一般指南

1. 在插件中接种细胞类型 #1
   1. 将插件从包装中取出。
   2. 使用镊子夹住插件的最上缘，将其放入适当尺寸的空多孔组织培养板中。
   3. 为促进贴壁细胞的附着和铺展，在接种前用细胞培养基对插件进行预处理。使用微量移液器将细胞培养基覆盖整个膜表面。
      注意：根据需要对相应数量的插件进行此操作。
   4. 盖上培养板盖子，在相同条件下（通常为 37°C，5-10% CO₂）孵育至少 1 小时或过夜。
   ....

结果

使用插入式共培养系统在研究展示中枢神经系统（CNS）不同细胞参与者之间旁分泌关系的神经炎症过程时尤为关键。中枢神经系统的免疫功能主要由一类称为小胶质细胞的常驻细胞完成，这些细胞在其静息的分支状状态下持续监测周围环境（图2A），并能够感知可能破坏神经元正常功能所依赖的极为重要的稳态的干扰^76-78。小胶质细胞的活化表现为细胞形态转变为阿米巴样（图2B）以及细胞数量增加（称为小胶质细胞增生，图3），随后释放促炎性介质（如细胞因子），这是神经炎症的核心特征⁷⁹。细胞因子的释放旨在保护神经元免受有害攻击，且受到严密调控。然而，当神经炎症脱离这种严格控制时，便会表现出破坏性，可能对中枢神经系统造成严重损伤。由于神经组织的再生能力极为有限，中枢神经系统尤其容易受到此类自我破坏性炎症反应的影响。研究神经元与小胶质细胞之间存在的相互作用，对于阐明神经炎症的潜在机制至关重要。与混合培养不同，插入式共培养系统使研究者能够明确识别出哪一类细胞群体产生.......

讨论

在任何插入式共培养系统实验中，最关键的步骤实际上在于选择合适的插入式培养小室。孔径大小和膜材料必须被充分考虑，同时不能忽视将要接种的细胞类型以及实验目的。例如，趋化性实验可能使用与细胞共培养相同的膜类型，以分析在无细胞-细胞直接接触条件下由分泌的可溶性因子诱导的细胞行为改变。然而，这两类实验需要不同的孔径大小：前者需要较大的孔径以允许细胞迁移，而后者则需要较小的孔径以阻止细胞迁移和细胞间的直接接触。在评估由分泌的可溶性因子介导的细胞变化（无细胞-细胞接触）时，通常选用0.4 µm或3 µm的孔径，因为这些孔径允许大分子（如蛋白质）通过，但可阻止大多数细胞穿过。膜材料的选择主要取决于细胞类型以及细胞培养结束后拟采用的技术手段。简而言之，PET膜透明度高，有利于良好的细胞观察，但其未包被胶原蛋白，这可能对需要支持物经过处理才能贴附的贴壁细胞造成问题；此外，PET膜对固定剂具有最佳的化学耐受性，结合其优良的光学特性，使其成为组织学研究的理想选择。另一方面，PC膜呈半透明状，细胞可视性较差，且同样未包被胶原蛋白；但其具有最高的孔密度以及最丰富的孔径规格可供选择。最后，PTFE膜在湿润状态下透明，但在显微镜下仅能观察到细胞轮廓；其主要优势在于已包.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
RPMI-1640 培养基	Sigma	R8755	37℃预热 °使用前将水浴预热至 C
杜尔贝科’s 改良伊格尔’Ham's F-12 营养混合物	Sigma	D6421	37℃预热 °使用前需在 C 水浴中预热，并添加 0.365 g/L L-谷氨酰胺
马血清	ATCC	30-2040	37℃预热 °使用前将水浴锅预热至 C
胎牛血清	多细胞	80350	37℃预热 °使用前将水浴锅预热至 C
来自小鼠下颌下腺的神经生长因子-7S	Sigma	N0513	用含有0.1%的缓冲盐溶液或组织培养基重新溶解冻干粉–1.0% 牛血清白蛋白或 1–10% 血清
胰蛋白酶-EDTA 溶液	Sigma	T3924	37℃预热 °使用前将水浴锅预热至 C
脂多糖来自 大肠杆菌 055:B5	Sigma	L2880	有毒的
用于24孔板的细胞培养小室	BD Falcon	353095	0.4 μ微米级孔隙
24孔板	TrueLine	TR5002	使用前用胶原蛋白包被
常规PC12细胞培养基			常规N9细胞培养基
-       85% RPMI 培养基			-       90% DMEM-F12 培养基
-       10% 热灭活马血清			-       10% 热灭活马血清
-       5% 热灭活胎牛血清
PC12分化培养基			N9 处理培养基
-        99% RPMI 培养基			-       99% DMEM-F12 培养基
-        1% 热灭活胎牛血清			-       1% 热灭活胎牛血清
-        50 ng/mL 神经生长因子
PC12处理培养基
-        99% RPMI 培养基
-        1% 热灭活胎牛血清