动脉僵硬度是心血管疾病中的一个关键因素，而脉搏波传导速度（PWV）可作为评估动脉僵硬度的替代指标。本方案描述了一种基于超声图像处理的小鼠PWV计算图像处理算法，适用于不同动脉部位。
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摘要
摘要
通过计算脉搏波速度（PWV）可评估动脉僵硬度， 即脉搏波在导管血管中传播的速度。这一参数在小型啮齿类动物模型中的研究日益增多，常用于评估特定基因型/处理引起的血管功能改变，或用于表征心血管疾病的发展进程。本方案介绍了一种图像处理算法，仅利用超声（US）图像即可实现对小鼠动脉脉搏波速度（PWV）的无创测量。该技术已被用于评估小鼠腹主动脉的PWV，并分析其随年龄变化的特征。
使用配备高频超声探头的特定超声设备，对处于气体麻醉状态的小鼠进行腹部主动脉超声扫描。通过分析B型和脉冲波多普勒（PW-Doppler）图像，分别获取直径和平均速度的瞬时值。为此，采用边缘检测和轮廓追踪技术。将单次心跳的平均直径和速度波形进行时间对齐并合并，以获得直径-速度（lnD-V）环。脉搏波传导速度（PWV）值由该环线性部分的斜率得出，该线性部分对应于早期收缩期。
通过本方法，可无创地获取小鼠腹主动脉的解剖和功能信息。该方法仅需处理超声图像，因此可能成为一种用于无创评估小鼠不同动脉部位弹性特性的有效工具。本技术的应用可轻松扩展至其他血管区域，例如颈动脉，从而实现多部位动脉硬度的综合评估。
引言
小鼠模型在心血管疾病（CVD）研究中的应用日益广泛，尤其适用于可表征疾病发展不同阶段的纵向研究1。大动脉的弹性特性与多种病理状态相关；从技术角度而言，可通过测量脉搏波传导速度（PWV）来评估动脉僵硬度，该指标代表脉搏波在传导血管中传播的速度2。由于其重要的临床意义，PWV 的测量在临床前的小动物模型中也日益普遍3。
目前有多种技术可用于评估小鼠的脉搏波传导速度（PWV）。侵入性方法依赖于使用导管尖端压力传感器，通过在两个不同动脉位置获取压力信号，并将两点之间的距离除以信号之间的时间差来计算PWV4。这类技术的主要缺点是需要在实验结束后处死动物以测量两个检测点之间的实际距离，因此无法用于纵向研究。为克服这一限制，已开发出基于不同成像技术的非侵入性方法。既往研究报道了通过在速度编码磁共振成像数据5和脉冲多普勒信号6上应用渡越时间法来评估小鼠的PWV。然而，这些方法所得出的PWV值仅反映动脉僵硬度的区域性评估，实际上代表了在尺寸和弹性特性上存在差异的多条动脉的平均值。此外，此类评估仍需测量两个检测点之间的距离，而该距离的测定可能引入误差，从而影响最终结果。
PWV 可通过直径-速度（lnD-V）环进行评估7该方法基于对选定血管的管径和血流速度值进行同步评估。根据此方法，通过绘制自然对数管径值与平均速度值的关系曲线得到lnD-V环，脉搏波传导速度（PWV）则通过计算所得环形曲线中对应于早期收缩期线性部分的斜率来估算。关于该方法的实际应用，已有先前研究报道了其在某一领域的应用结果 体外 系统设置7 及其在人体颈动脉和股动脉脉搏波传导速度评估中的应用8.
本研究的主要目的是详细描述一种仅使用超声图像对小鼠进行无创动脉脉搏波传导速度（PWV）测量的图像处理算法。该方法通过处理B型和脉冲波多普勒（PW-Doppler）图像，实现对局部动脉硬度的评估，并可应用于腹主动脉等具有重要生理意义的动脉。
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方案
动物实验遵循欧洲指令（2010/63/UE）和意大利法律（D.Lvo 26/2014）进行，并符合实验室动物护理原则。本研究已获得当地伦理审查委员会批准。
1. 成像步骤
- 将小鼠放入麻醉诱导舱中，以1 L/min的纯氧携带2.5%异氟烷进行麻醉。通过脚趾夹捏无反应来确认麻醉深度。
- 将动物仰卧位固定于温控板上，并用眼膏湿润其眼睛，以防角膜干燥。通过将小鼠鼻部置于专用鼻罩中，持续供给1.5%异氟烷维持麻醉。必要时可根据具体实验动物情况调整异氟烷浓度。将温控板温度设定为40 °C。
- 在动物四肢涂抹导电膏，并将其固定于温控板内置的ECG电极上。使用凡士林润滑的直肠探头测量体温。确认所有生理参数（ECG、呼吸信号及体温）均被正确采集并显示。
- 使用脱毛膏对腹部进行化学脱毛，并涂抹超声耦合凝胶。
- 将（13-24 MHz）超声探头安装至机械臂上。
- 将超声探头与动物体位保持平行，并调整其位置，以获得腹主动脉的纵向图像，确保感兴趣区域位于焦点范围内。
- 采集解剖学信息。
- 点击启用高帧率ECG门控采集的按钮9，设置采集帧率为700 fps后开始采集。注意：由此可获取与单个心动周期相关的血管解剖图像。
- 采集血流速度信息。
- 在相同扫描切面下，点击脉冲波多普勒（PW-Doppler）按钮，将取样容积置于血管中心，采集图像并确保动态循环序列不少于3秒。获取数据时应尽可能减小角度校正，根据实际获得的超声切面逐例调整校正角度。
- 将动物从温控板上移除，并等待其完全苏醒。
注意：根据我们的经验，此过程约需10分钟。在动物恢复足够意识、能够维持胸卧位之前，不得无人看护。
2. 后处理
- 将B模式和脉冲波多普勒（PW-Doppler）图像导出为DICOM文件，并保存至个人计算机。将PW-Doppler的DICOM文件转换为.tiff图像。
- 处理B型超声图像。
- 使用专用的图形用户界面（GUI）导入相应的 DICOM 文件。
- 为初始化轮廓，在血管远端壁附近绘制一条线（单击开始，双击结束），并在近端壁附近双击。一条与远端壁附近线条平行的线将自动出现。通过点击“ANALYSE”按钮，对单帧图像应用算法。
- 检查结果。如果边缘已被正确识别（即., 初始化点的演化已检测到后壁和前壁），通过点击“GO”按钮将算法应用于整个电影序列。如果边缘未被正确识别，点击“Clear Contour”清除轮廓，并重复步骤2.2.2重新初始化。
注意：该算法基于边缘检测和轮廓追踪技术，此前已有详细描述10. - 通过按下“RECORD”按钮获取最终结果，并保存相应的 .mat 文件，该文件包含与单个心动周期相关的瞬时直径值。
- 打开用于实现 lnD-V 回路的图形用户界面。
- 单击“VELOCITY”按钮，以启动脉冲波多普勒（PW-Doppler）图像处理，从而获得单个心动周期的平均速度曲线。
- 识别脉冲波多普勒（PW-Doppler）轨迹，通过按下“WHITE LINE”按钮找到对应于速度值为零的线。
- 使用“VELOCITY”和“TIME”按钮（位于校准面板中）分别进行速度校准和时间校准。按下这些按钮后，可绘制一条线段，其长度对应于输入的校准因子。
- 使用“ROI PHYSIO”按钮手动选择包含生理信号的感兴趣区域。
- 通过按下“ROI SIGNAL”按钮，手动选择包含PW-Doppler频谱的感兴趣区域。
- 单击“ANALYSE”按钮，检查是否已识别出包络。如果结果不理想，更改阈值（在“Velocity Threshold”可编辑文本框中输入新数值），然后再次按下“ANALYSE”按钮。根据图像质量逐例调整阈值。按下“ELABORATION”按钮。
- 定位 ECG 信号的 R 波峰值，并通过点击“UPDATE”按钮相应地分割速度包络信号。通过点击“CHOOSE BEATS”按钮，选择未受噪声污染且不位于吸气阶段的心跳周期。由此获得单个心动周期的平均速度波形。
- 使用快速傅里叶变换方法在频域对选定的心跳波形进行插值，使其均包含相同数量的数据点，具体步骤详见参考文献11. 在选定心动周期后，只需按一下计算机键盘上的回车键即可自动执行此操作。如果勾选了“平均速度”复选框，则通过将最大速度曲线除以二来获得单个心动周期的平均速度信号，该计算基于抛物线速度分布的假设12. 按下“OK”按钮。
- 单击“DIAMETER”按钮。通过点击“INTERPOLATE”按钮，在时间域内对单次搏动的直径波形进行插值，以获得与单次搏动速度信号具有相同采样频率的单次搏动直径信号。单击“OK”按钮。
注意：为了使单次心跳的直径和平均速度曲线具有相同的采样频率和相同的数据点数量，需在频域内对它们进行插值。 - 选择“二阶导数”法作为对齐方法（位于显示直径和速度波形的图形上方），然后点击“UPDATE”按钮。两条曲线将使用二阶导数法自动进行时间对齐。14.
- 通过将单次搏动的直径值的自然对数与单次搏动的平均速度值作图，构建最终的 lnD-V 环。当两个波形对齐时，此过程将自动完成。注意：系统会自动识别单次搏动平均速度曲线最大值的 5% 至 90% 范围内的数据点，并对这些点进行线性插值，以计算该环线性部分的斜率。
- 根据以下公式计算 PWV7
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结果
在之前的一项研究中，该方法已应用于小鼠腹主动脉11。以下图示展示了该方法在真实小鼠图像上的应用结果。这些数据来自单只动物（野生型小鼠，13周龄，品系：C57BL6，体重：33 g）。具体而言，图1展示了超声图像分析的结果。对采用高帧率心电图门控模式获取的B型图像应用边缘检测和轮廓追踪技术，可得到直径波形；另一方面，通过识别脉冲波多普勒（PW-Doppler）信号包络，可评估单个心动周期的平均速度曲线。单个心动周期平均速度波形的评估包括来自不同心动周期数据的平均值。对于所示数据，速度曲线的标准差（以每个时间点标准差的平均值计算）为0.0137 m/sec。
单次心跳的直径和平均速度波形在频域和时域均进行了插值处理，然后进行时间对齐（图 2A）。通过将自然对数直径值与平均速度测量值作图，得到 lnD-V 环（图 2B
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讨论
本研究详细描述了一种基于lnD-V环路的小鼠脉搏波速度（PWV）评估图像处理算法。该方法仅基于超声图像的处理，因此可作为现有技术6,13在小鼠模型中评估动脉僵硬度的有效替代方案。事实上，与依赖动脉内压力信号采集并需处死动物的侵入性方法6相反，该技术完全无创，因此特别适用于纵向研究。此外，该方法提供的是局部而非区域性的动脉僵硬度评估。尽管已知该方法会受到反射波的影响15，但与其它基于超声的局部PWV评估方法（如基于血流-面积技术的方法13，后者需要获取横断面投影下的彩色血流数据）相比，可能提供更精确的PWV评估结果。在"代表性结果"部分所示的PWV值为1.69 m/sec，与参考文献11中的报道一致：该研究中，成年小鼠腹主动脉PWV为1.91 ±0.44 m/sec，老年动物则为2.71 ±0.63 m/sec。
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| VEVO2100 | FUJIFILM VisualSonics Inc, Toronto, Canada | 微型超声成像设备 | |
| MS250 超声探头 | FUJIFILM VisualSonics Inc, Toronto, Canada | 微型超声探头 | |
| EKV 软件 | FUJIFILM VisualSonics Inc, Toronto, Canada | 软件 | |
| Matlab R2015a | MathWorks Inc, Natick, MA, USA | 软件 | |
| 导电膏 | 由操作者自行选择 | 实验材料 | |
| 凡士林 | 由操作者自行选择 | 实验材料 | |
| 脱毛膏 | 由操作者自行选择 | 实验材料 | |
| 声学耦合凝胶 | 由操作者自行选择 | 实验材料 | |
| 自主开发的 Matlab 软件 | 作者愿意与对本软件感兴趣的科研人员合作，并在作者监督下提供该软件的使用 |
参考文献
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