可靠且高效的肾脏免疫细胞提取方法

摘要

为了进行后续应用，需要可靠且高效的肾脏免疫细胞分离技术。该技术要求对少量肾脏免疫细胞进行表面抗体标记。本文介绍了一种简明的肾脏免疫细胞分离方法，该方法似乎能够实现这一目标。

摘要

多种肾脏疾病及病理生理过程中均会发生免疫系统激活。免疫系统由适应性免疫和固有免疫两部分组成，并包含多种细胞类型。有时，研究者感兴趣的细胞类型在从肾脏分离的大量总细胞中数量极低。因此，为了研究与肾脏疾病相关的免疫学问题，可靠且高效地分离肾脏单个核细胞群体显得尤为重要。传统上，肾脏单个核细胞的组织分离通常通过使用不同种类和浓度的胶原酶/DN酶进行酶消化来完成，所得存活免疫细胞的数量存在差异。近年来，随着用于单细胞分离的机械组织解离装置的发展，胶原酶消化步骤得以避免，取而代之的是在从小鼠体内取出肾脏后进行简单的机械性破碎。本文中，我们展示了一种简单且高效的日常免疫细胞提取用肾脏单个核细胞分离方法。我们进一步展示了肾脏中免疫细胞亚群分析的一个示例。重要的是，该技术可适用于其他柔软且非纤维性的组织，如肝脏和脑组织。

引言

免疫系统激活发生在多种肾脏疾病及病理生理过程中 ^6,10,11,13潜在的活跃研究领域包括免疫系统激活的各种诱因、所涉及的不同细胞类型、特定疾病状态下的细胞因子/趋化因子模式，以及特定药物对上述所有过程的调节作用等。例如，在缺血-再灌注损伤（急性肾损伤的模型）中，免疫细胞、骨髓来源的造血细胞或CD45阳性细胞数量增加⁺ 数小时内活化，并持续存在于修复或纤维化阶段（6周后） ^5,12这些免疫细胞分泌促炎性和抗炎性细胞因子及趋化因子，以协调修复过程。 ^5,12目前，随着配备四到五根激光器的现代流式细胞仪的出现，能够在单细胞悬液中同时使用多种荧光染料标记细胞群体的能力已显著提升。这大大增强了基于细胞功能状态区分不同细胞群体的能力 ^3,7例如，要准确地将巨噬细胞标记为 F4/80^低CD11b^高Ly6b^高CD206^低在同一样本体积中，至少还需要3种以上的荧光染料来圈定活细胞、CD45+（白细胞）和Ly6G-（中性粒细胞），而使用新型流式细胞仪完全可以实现这一目标。 ³然而，细胞因子分泌、细胞增殖、细胞毒性、巨噬细胞活化以及各类淋巴细胞和单核细胞亚群数量的检测等下游实验，不仅需要高质量的细胞（活细胞、单细胞），还需要足够数量的细胞。

肾脏中的免疫系统由适应性免疫和固有免疫....

方案

所有实验步骤均经过密苏里大学动物护理与使用委员会（ACUC）审查并批准。本实验方案使用15周龄的雄性C57Bl/6小鼠，但理论上任何年龄的啮齿类动物均可用于实验。由于本实验为非存活手术，动物处死通过放血和双侧 气胸法实现。

1. 肾脏灌注 

注意：灌注心脏、肝脏和肾脏等器官可去除可能干扰数据分析的血液。因此，如果条件允许，我们始终对器官进行灌注。

1. 将小鼠放入异氟烷（3 ml/min）诱导舱中，直至小鼠不再活动。随后将小鼠从诱导舱中取出，仰卧置于解剖台上，并将异氟烷面罩罩住小鼠鼻部，通过调节器以1.5 ml/min的流速输送异氟烷。
2. 使用镊子夹捏脚趾，检查趾夹反射，以评估动物是否达到外科麻醉深度。用生理盐水清洁腹部腹侧区域，用剪刀切开腹腔，并将腹腔器官（移出手术区域）推向小鼠左侧。
3. 使用固定在1 ml注射器上的25号针头从小鼠下腔静脉采集血液，并将其加入含有10 μl 0.5 M EDTA的1.5 ml微量离心管中。
   注意：血液采集为可选步骤。血浆可用于生化检测，白细胞可用于流式细胞术分析。
4. 使用剪刀在右心房处剪开一个小口，以便排出下一步中血液与PBS的混合液。
5. 取一支50 ml注射器，装入冰浴预冷的PBS（20–30 ml）。然后在注射器上安装21–25 G针头，用镊子轻轻夹住心脏，在....

结果

可运行的检测面板数量取决于能够从肾脏中可靠提取的免疫细胞数量。本文中，我们展示了运行两个面板的能力，一个用于T淋巴细胞，另一个用于巨噬细胞/树突状细胞。在T淋巴细胞面板中，我们首先观察前向散射（FSC）和侧向散射（SSC）图谱，并圈定感兴趣的细胞群，如图1（左上角散点图）所示。接着使用一种活力标记物（本实验中为可固定活力染料FVS510）排除死细胞，以进行后续分析（图1，中上散点图）。CD45是骨髓来源造血细胞的标志物，通常用于界定肾脏中的免疫细胞，其比例通常占总肾脏免疫细胞的2%-18%，具体数值取决于小鼠的年龄、性别、品系及炎症状态（图1，右上散点图）。在CD45⁺骨髓来源造血细胞中，可选择以CD3ε作为T淋巴细胞的标志物进行设门，或进一步通过CD4⁺/CD8⁺区分效应/细胞毒性细胞与骨髓来源造血细胞（图1，右下散点图）。通常情况下，CD4⁺细胞数.......

讨论

本文介绍了一种可靠且高效地从肾脏中获取免疫细胞的方法。与广泛使用的胶原酶消化步骤（组织机械性解离）相比，本方法的主要改进可节省约30分钟，且在两小时内即可完成4个肾脏样本的大量活免疫细胞分离。此外，根据我们的研究需求，目前我们仅使用单侧肾脏进行免疫细胞分离（另一侧肾脏可用于蛋白质印迹、免疫组织化学检测蛋白表达以及PCR检测mRNA表达），每次分离常规可获得约2 × 10⁶个细胞。我们已应用该方法成功从肝脏和心脏中分离出大量免疫细胞（心脏组织结合多酶消化与机械性解离，数据未展示），并确信机械性解离也可适用于其他非纤维性组织，如脑组织¹⁶。

与任何从组织中分离免疫细胞的实验方案一样，细节的把握对成功至关重要。若肾脏灌注是关键步骤，则需通过练习掌握将针头插入心脏的技巧，以避免心脏发生纤维性颤动或针头刺入过深而进入右心室。另一种替代方法是，在肾动脉上方插管腹主动脉并进行肾脏灌注⁸。此外，作者还提出其他建议，以确保免疫细胞分离的可靠性和一致性。肾脏应充分研磨，不应有可见的大块组织残留；若未达到该标准，则应重复机械性破碎操作以解.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
Stomacher 80 Biomaster 实验室系统	Seward
Stomacher 80 Classic 均质袋	Seward	BA6040/STR
Sorvall Legend XFR 离心机	Thermo Scientific		或性能相当的设备
血细胞计数板	Electron Microscopy Sciences	63514-11
分析型流式细胞仪	BD LSR-X20 Fortessa
Percoll	Sigma	P1644
Dulbecco’s 1× 磷酸盐缓冲液（DPBS）	Gibco, Life Technologies	14190-250
聚丙烯管，无盖	Becton Dickinson	352002
可固定活力染料	BD Biosciences	FVS510,  564406
抗 CD16/32（克隆：93）	EBioscience	14-0161
抗 CD45（克隆：30-F11） BV421	BD Pharmingen	103133/4
抗 Foxp3（克隆：FJK-16s）APC	EBioscience	17-5773
抗 CD127（克隆：A7R34）PE/Cy7	Biolegend	135013/4
抗 CD44（克隆：IM7）PerCP/Cy5.5	Biolegend	103031/2
抗 CD4（克隆：RM4-5）APC-Cy7	Biolegend	100413/4
抗 CD8（克隆：53-6.7）BV785	Biolegend	100749/50
抗 Ly6G（克隆：1A8）FITC	Biolegend	127605/6
抗 CD11b（克隆：M1/70）PerCP-Cy5.5	Biolegend	101227/8
抗 F4/80（克隆：BM8）APC	Biolegend	123115/6
抗 CD11c（克隆：N418）BV785	Biolegend	117335/6
抗 CD301（克隆：LOM-14）PE-Cy7	Biolegend	145705/6
抗 CD26（克隆：H194-112）PE	Biolegend	137803/4
100 μm 滤膜	Fisher Scientific	22363548
Fisherbrand 50 ml 离心管	Fisher		或性能相当的设备
Fisherbrand 15 ml 离心管	Fisher		或性能相当的设备
蔗糖	Fisher chemical	S5-3
细尖移液管	Samco Scientific	232	或性能相当的设备
流式细胞术染色缓冲液	EBioscience	00-4222-26	或性能相当的设备
1× 红细胞裂解缓冲液	EBioscience	00-4333-57	或性能相当的设备