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方法文章

可靠且高效的肾脏免疫细胞提取方法

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DOI：

10.3791/54368

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2016年8月19日

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1Division of Nephrology, Department of Medicine, University of Missouri-Columbia and Harry S Truman Memorial Veteran's Hospital, 2Division of Biomedical Sciences, Department of Medicine, University of Missouri-Columbia and Harry S Truman Memorial Veteran's Hospital, 3Division of Endocrinology, Department of Medicine, University of Missouri-Columbia and Harry S Truman Memorial Veteran's Hospital

本文内容

摘要

为了进行后续应用，需要可靠且高效的肾脏免疫细胞分离技术。该技术要求对少量肾脏免疫细胞进行表面抗体标记。本文介绍了一种简明的肾脏免疫细胞分离方法，该方法似乎能够实现这一目标。

摘要

多种肾脏疾病及病理生理过程中均会发生免疫系统激活。免疫系统由适应性免疫和固有免疫两部分组成，并包含多种细胞类型。有时，研究者感兴趣的细胞类型在从肾脏分离的大量总细胞中数量极低。因此，为了研究与肾脏疾病相关的免疫学问题，可靠且高效地分离肾脏单个核细胞群体显得尤为重要。传统上，肾脏单个核细胞的组织分离通常通过使用不同种类和浓度的胶原酶/DN酶进行酶消化来完成，所得存活免疫细胞的数量存在差异。近年来，随着用于单细胞分离的机械组织解离装置的发展，胶原酶消化步骤得以避免，取而代之的是在从小鼠体内取出肾脏后进行简单的机械性破碎。本文中，我们展示了一种简单且高效的日常免疫细胞提取用肾脏单个核细胞分离方法。我们进一步展示了肾脏中免疫细胞亚群分析的一个示例。重要的是，该技术可适用于其他柔软且非纤维性的组织，如肝脏和脑组织。

引言

免疫系统激活发生在多种肾脏疾病及病理生理过程中 6,10,11,13潜在的活跃研究领域包括免疫系统激活的各种诱因、所涉及的不同细胞类型、特定疾病状态下的细胞因子/趋化因子模式，以及特定药物对上述所有过程的调节作用等。例如，在缺血-再灌注损伤（急性肾损伤的模型）中，免疫细胞、骨髓来源的造血细胞或CD45阳性细胞数量增加+ 数小时内活化，并持续存在于修复或纤维化阶段（6周后） 5,12这些免疫细胞分泌促炎性和抗炎性细胞因子及趋化因子，以协调修复过程。 5,12目前，随着配备四到五根激光器的现代流式细胞仪的出现，能够在单细胞悬液中同时使用多种荧光染料标记细胞群体的能力已显著提升。这大大增强了基于细胞功能状态区分不同细胞群体的能力 3,7例如，要准确地将巨噬细胞标记为 F4/80低CD11b高Ly6b高CD206低在同一样本体积中，至少还需要3种以上的荧光染料来圈定活细胞、CD45+（白细胞）和Ly6G-（中性粒细胞），而使用新型流式细胞仪完全可以实现这一目标。 3然而，细胞因子分泌、细胞增殖、细胞毒性、巨噬细胞活化以及各类淋巴细胞和单核细胞亚群数量的检测等下游实验，不仅需要高质量的细胞（活细胞、单细胞），还需要足够数量的细胞。

肾脏中的免疫系统由适应性免疫和固有免疫成分以及多种细胞类型组成 1,7,13例如，在小鼠中，双侧肾脏共同含有2-17%（28,000-266,000）的CD45+ 总分离肾免疫细胞中的细胞（1.4 x 106 细胞）中约有5-15%（1,400-4,200）为CD4+ 细胞 1,5,12一小部分（5-15%，70-630）的这些CD4+细胞为FoxP3+细胞（图1)1由于这些逐步减少的细胞比例，有时目标细胞群（在此为CD45+CD4+FoxP3+细胞）仅约100个细胞。CD45+CD4+FoxP3+细胞数量较少，因此必须分离足够数量的总细胞，并确保细胞质量良好，以满足后续实验（如细胞因子分泌检测）的需求。此外，由于亚群细胞数量不足以进行可定量的检测，可能需要合并2至3只小鼠的肾脏样本。因此，为了研究与肾脏疾病相关的免疫谱系，建立可靠且高效的肾脏单个核细胞群分离方法是十分必要的。

传统上，为了分离肾脏单个核细胞，研究人员曾使用多种酶消化方法，例如胶原酶1A或II型，并加入DNase 11,5,12。众所周知，胶原酶的酶活性会因生产批次和制造商不同而存在差异，因此需要滴定确定最佳浓度和孵育时间4,14,15。此外，使用胶原酶消化需要将肾脏组织剪切成小块，增加了操作时间；还需将组织块置于37 °C加热浴中孵育，并额外加入EDTA孵育以终止反应。同时，在某些需要细胞培养的下游实验中，该方法可能难以保证较高的无菌性。更重要的是，由于不同研究人员以及各种实验变量的影响，该方法可能导致不同实验室之间数据和结果解释的不一致。近年来，随着机械组织破碎仪/匀浆器的发展16，胶原酶消化步骤已被完全避免，取而代之的是对肾脏组织进行简单的机械破碎2。本文中，我们展示了一种简单且高效的肾脏免疫细胞分离方法，适用于日常的免疫细胞提取。重要的是，该技术也可推广应用于其他柔软且非纤维性组织，如肝脏和脑组织16。

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方案

所有实验步骤均经过密苏里大学动物护理与使用委员会（ACUC）审查并批准。本实验方案使用15周龄的雄性C57Bl/6小鼠，但理论上任何年龄的啮齿类动物均可用于实验。由于本实验为非存活手术，动物处死通过放血和双侧 气胸法实现。

1. 肾脏灌注 

注意：灌注心脏、肝脏和肾脏等器官可去除可能干扰数据分析的血液。因此，如果条件允许，我们始终对器官进行灌注。

  1. 将小鼠放入异氟烷（3 ml/min）诱导舱中，直至小鼠不再活动。随后将小鼠从诱导舱中取出，仰卧置于解剖台上，并将异氟烷面罩罩住小鼠鼻部，通过调节器以1.5 ml/min的流速输送异氟烷。
  2. 使用镊子夹捏脚趾，检查趾夹反射，以评估动物是否达到外科麻醉深度。用生理盐水清洁腹部腹侧区域，用剪刀切开腹腔，并将腹腔器官（移出手术区域）推向小鼠左侧。
  3. 使用固定在1 ml注射器上的25号针头从小鼠下腔静脉采集血液，并将其加入含有10 μl 0.5 M EDTA的1.5 ml微量离心管中。
    注意：血液采集为可选步骤。血浆可用于生化检测，白细胞可用于流式细胞术分析。
  4. 使用剪刀在右心房处剪开一个小口，以便排出下一步中血液与PBS的混合液。
  5. 取一支50 ml注射器，装入冰浴预冷的PBS（20–30 ml）。然后在注射器上安装21–25 G针头，用镊子轻轻夹住心脏，在左心室心尖处穿刺，并在1–2分钟内缓慢将pH 7.4的磷酸盐缓冲盐水（PBS）灌注至左心室。
    注意：灌注最初几毫升后，心脏会立即变白。观察肝脏是否变白，此现象表明灌注液正通过下腔静脉的静脉回流将血液从肝脏中排出。此外，需确保灌注过程中肺部未膨胀，若肺部膨胀则提示针头误入右心室。一旦发生此情况，应将针头稍向后退出至左心室，并继续灌注。 从开始切口至完成安乐死的总时间少于2分钟

2. 肾脏解剖 

  1. 灌注完成后，使用剪刀和镊子将右肾从其附着组织（血管、脂肪和肾上腺）中分离并切除。
  2. 用镊子剪开并剥离覆盖在肾脏上的包膜，轻轻取下。称量肾脏重量。
    注：称量肾脏重量为可选步骤。然而，某些实验可能导致肾脏大小/重量发生变化，此时可利用重量数据对每克组织的细胞产量进行归一化处理。
  3. 称重肾脏后，将其放入含有0.5% FBS的1 ml RPMI-1640培养基或流式细胞术染色缓冲液中（置于50 ml带螺口盖的锥形管内），并将管子置于冰上，待后续使用。
    注意：为了便于描述，后续免疫细胞的分离步骤将在流式细胞术染色缓冲液中进行说明。此外，我们将以单个肾脏为例描述免疫细胞的分离过程，尽管实际操作中可同时使用双侧肾脏或1又1/3个肾脏。rd 肾脏的使用比例可根据下游实验而定（可选）。1/3rd 肾脏的三分之一可用于蛋白质/RNA实验并进行冷冻保存rd 可用于免疫组织化学或透射电子显微镜的缓冲液中。

3. 肾脏的匀浆化

  1. 用样本标识信息标记一个容量为5-80 ml的匀浆袋，取出袋内滤网（STR）并丢弃。向袋中加入5 ml冰上预冷的流式细胞术染色缓冲液，并将肾脏组织转移至缓冲液中。对需要处理的第二个或更多样本重复此步骤。
  2. 将匀浆袋对折，使其中一半含有浸没在流式细胞术染色缓冲液中的肾脏组织，另一半则简单地折叠覆盖其上。
  3. 开启组织匀浆器，并将其转速调至快速（fast）档位。将折叠好的匀浆袋放置在匀浆器上，确保肾脏一侧朝向搅拌桨叶，靠近底部边缘，但注意袋子的下端不要滑出桨叶的下边界。
    1. 由于设备配有两片桨叶，可同时处理第二个样本。设置匀浆时间为120秒。观察桨叶前后运动以完成肾脏组织的匀浆。
      注意：在此期间，可利用空闲时间准备另外两个肾脏（或其他组织）样本，以便前两份样本处理完成后立即进行下一轮操作。
  4. 完成第一组样本匀浆后，将匀浆袋放回冰上，并将下一组样本装入组织匀浆器中继续操作，依此类推。肉眼观察确认肾脏组织已充分匀浆，无明显大块组织残留。
    注意：通常情况下，在快速转速下使用组织匀浆器处理2分钟即可充分解离肾脏组织。
  5. 将100 µm细胞滤网置于冰上的50 ml锥形管中。随后，用移液器将全部匀浆液转移至细胞滤网上。设置离心机参数为50 × g、4 °C，离心1分钟，并将样品放入离心机中。
    注意：离心可确保所有匀浆液（含细胞）均通过细胞滤网。
  6. 从离心机中取出离心管，放回冰上。丢弃细胞滤网，保留滤过后的匀浆液。向细胞沉淀/上清液中加入等体积（约6 ml）的1×红细胞裂解缓冲液，反复吹打数次以形成均匀的细胞悬液。肉眼可见悬液中的红色迅速部分消退。将离心管置于冰上静置5分钟，以实现最大程度的红细胞裂解。
    注意：若研究者确信肾脏灌注充分且希望减少细胞操作步骤，可省略红细胞裂解步骤。我们观察到，不对细胞悬液进行红细胞裂解可显著提高肾脏细胞得率。
  7. 将离心管放入离心机中，设置条件为500 × g、4 °C，离心5分钟，以形成细胞沉淀。
    注意：在步骤3.6和3.7期间，准备用于胶体二氧化硅（Percoll）密度梯度离心的相关试剂。
    1. 取10 ml圆底聚丙烯管，根据对应样本编号进行标记，并放置于试管架中。
      注意：以下步骤描述的是制备足够用于4个肾脏样本的密度梯度试剂。
    2. 取7 ml流式细胞术染色缓冲液，用移液器将其加入一个15 ml锥形管中，再加入1 ml 2 M蔗糖，配制成0.25 M蔗糖溶液。
    3. 另取一个15 ml锥形管，加入7.2 ml密度梯度试剂，再加入1.55 ml流式细胞术染色缓冲液和1.25 ml 2 M蔗糖，配制成72%密度梯度试剂并含0.25 M蔗糖。
    4. 为每个样本对应的圆底聚丙烯管中加入1 ml 72%密度梯度试剂。

4. 梯度离心

  1. 在步骤3.7之后，取出离心管，轻轻倾倒上清液，动作应流畅连贯；同时，在倒置离心管时，将随后形成的下一滴液体也一并倾出。
    注意：此步骤非常重要，因为残留过多液体可能改变密度梯度，从而导致得率出现差异。当将离心管重新竖直放置时，约有 200–300 µl 液体仍会与细胞沉淀一同残留。
  2. 用移液器将1 ml 0.25 M蔗糖溶液加入细胞沉淀中，轻轻但用力地反复吹打，使细胞充分悬浮并形成均匀的细胞悬液。随后，将细胞悬液加入1 ml 72%密度梯度试剂（3.7.4）中，并再次用力吹打以充分混匀细胞，形成36%密度梯度试剂。
  3. 取1 ml 72%密度梯度试剂至聚丙烯巴斯德（转移）吸管中。轻轻挤压吸球以保持液体柱位于吸头内并防止气泡产生，将巴斯德吸管缓缓插入细胞悬液（36%密度梯度试剂）底部，缓慢释放72%密度梯度试剂，形成清晰的较重下层。
  4. 轻轻拿起样品管，放入处于室温的离心机中。在500 × g条件下离心20-30分钟。
  5. 同时，准备另外两组带有相应样本标识的聚丙烯圆底离心管。
  6. 完成步骤4.4后，轻轻取出含有聚丙烯管的样品，尽量避免振荡，并将其放置于试管架上。
  7. 取第一个样本管及其对应的空管。用聚丙烯巴斯德吸管，通过精确控制的吸力，轻柔而彻底地移除上层 "杂质层" 或 "黏稠物质" 并将其放入空的圆底离心管中。
    1. 继续移除梯度液的上层部分，直至到达 "血沉棕黄层" 达到时停止（可能呈现带红晕的淡白色[红细胞]）。当距底部高度约为 3 mm 时，停止抽吸 "血沉棕黄层".
      注意：在继续抽吸之前，务必确保梯度上层已完全去除该物质。
  8. 取一支新的巴斯德吸管和一支新的圆底离心管，轻柔地移除血沉棕黄层。继续在血沉棕黄层下方3 - 5 mm处进行抽吸，以确保收集到大部分细胞，并将其加入至2nd 带有适当样本标识符的新圆底管
  9. 加入 1–2 ml 流式细胞术染色缓冲液至 2nd 用移液器反复吹打混匀。
  10. 在 4 °C 条件下，以 500 × g 离心 5 分钟。A 2nd 用流式细胞术染色缓冲液进行洗涤步骤为可选步骤。将细胞重悬于500 µl流式细胞术染色缓冲液中，随后使用血细胞计数板进行细胞计数。

5. 可选步骤（细胞标记）

  1. 将每个样本调整为相同数量的细胞。加入终浓度为每106个细胞0.5 µg的阻断抗体（抗-CD16/CD32 FcR），冰上孵育15分钟。
  2. 在正式实验前，根据研究者预实验确定的兼容性，加入适当组合的偶联了相应荧光染料的一抗混合物。冰上孵育30分钟，随后用PBS洗涤细胞。
    注：本论文中用于展示肾脏免疫细胞标记的实验方案，采用了T淋巴细胞和巨噬细胞/树突状细胞两组抗体组合。T淋巴细胞组合包括：可固定活力染料FVS510、抗-CD45（克隆号：30-F11）BV421、抗-Foxp3（克隆号：FJK-16s）APC、抗-CD127（克隆号：A7R34）PE/Cy7、抗-CD44（克隆号：IM7）PerCP/Cy5.5、抗-CD4（克隆号：RM4-5）APC-Cy7、抗-CD8（克隆号：53-6.7）BV785。巨噬细胞组合包括：可固定活力染料FVS510、抗-CD45（克隆号：30-F11）BV421、抗-Ly6G（克隆号：1A8）FITC、抗-CD11b（克隆号：M1/70）PerCP-Cy5.5、抗-F4/80（克隆号：BM8）APC、抗-CD11c（克隆号：N418）BV785。
  3. 加入可固定活力染料，室温避光孵育5分钟。用流式细胞术染色缓冲液洗涤细胞，以去除未结合的活力染料。
  4. 加入固定/透化试剂，4 ºC过夜孵育。用透化溶液洗涤细胞。
  5. 进行胞内染色时，再次使用抗-CD16/32 FcR抗体阻断10分钟。加入胞内染色抗体，孵育20–30分钟，随后用透化溶液洗涤两次。
  6. 将细胞重悬于流式细胞术染色缓冲液中，并通过FACS仪器检测3,9。

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结果

可运行的检测面板数量取决于能够从肾脏中可靠提取的免疫细胞数量。本文中，我们展示了运行两个面板的能力，一个用于T淋巴细胞，另一个用于巨噬细胞/树突状细胞。在T淋巴细胞面板中，我们首先观察前向散射（FSC）和侧向散射（SSC）图谱，并圈定感兴趣的细胞群，如图1（左上角散点图）所示。接着使用一种活力标记物（本实验中为可固定活力染料FVS510）排除死细胞，以进行后续分析（图1，中上散点图）。CD45是骨髓来源造血细胞的标志物，通常用于界定肾脏中的免疫细胞，其比例通常占总肾脏免疫细胞的2%-18%，具体数值取决于小鼠的年龄、性别、品系及炎症状态（图1，右上散点图）。在CD45+骨髓来源造血细胞中，可选择以CD3ε作为T淋巴细胞的标志物进行设门，或进一步通过CD4+/CD8+区分效应/细胞毒性细胞与骨髓来源造血细胞（图1，右下散点图）。通常情况下，CD4+细胞数...

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讨论

本文介绍了一种可靠且高效地从肾脏中获取免疫细胞的方法。与广泛使用的胶原酶消化步骤（组织机械性解离）相比，本方法的主要改进可节省约30分钟，且在两小时内即可完成4个肾脏样本的大量活免疫细胞分离。此外，根据我们的研究需求，目前我们仅使用单侧肾脏进行免疫细胞分离（另一侧肾脏可用于蛋白质印迹、免疫组织化学检测蛋白表达以及PCR检测mRNA表达），每次分离常规可获得约2 × 106个细胞。我们已应用该方法成功从肝脏和心脏中分离出大量免疫细胞（心脏组织结合多酶消化与机械性解离，数据未展示），并确信机械性解离也可适用于其他非纤维性组织，如脑组织16。

与任何从组织中分离免疫细胞的实验方案一样，细节的把握对成功至关重要。若肾脏灌注是关键步骤，则需通过练习掌握将针头插入心脏的技巧，以避免心脏发生纤维性颤动或针头刺入过深而进入右心室。另一种替代方法是，在肾动脉上方插管腹主动脉并进行肾脏灌注8。此外，作者还提出其他建议，以确保免疫细胞分离的可靠性和一致性。肾脏应充分研磨，不应有可见的大块组织残留；若未达到该标准，则应重复机械性破碎操作以解...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

本工作得到了 Dialysis Clinics 公司研究基金以及密苏里大学研究委员会基金的资助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
Stomacher 80 Biomaster 实验室系统Seward
Stomacher 80 Classic 均质袋SewardBA6040/STR
Sorvall Legend XFR 离心机Thermo Scientific或性能相当的设备 
血细胞计数板Electron Microscopy Sciences63514-11
分析型流式细胞仪BD LSR-X20 Fortessa
Percoll SigmaP1644
Dulbecco’s 1× 磷酸盐缓冲液（DPBS）Gibco, Life Technologies14190-250
聚丙烯管，无盖Becton Dickinson352002
可固定活力染料BD Biosciences FVS510,  564406
抗 CD16/32（克隆：93）EBioscience14-0161
抗 CD45（克隆：30-F11） BV421 BD Pharmingen103133/4
抗 Foxp3（克隆：FJK-16s）APCEBioscience17-5773
抗 CD127（克隆：A7R34）PE/Cy7Biolegend135013/4
抗 CD44（克隆：IM7）PerCP/Cy5.5Biolegend103031/2
抗 CD4（克隆：RM4-5）APC-Cy7Biolegend100413/4
抗 CD8（克隆：53-6.7）BV785Biolegend100749/50
抗 Ly6G（克隆：1A8）FITCBiolegend127605/6
抗 CD11b（克隆：M1/70）PerCP-Cy5.5Biolegend101227/8
抗 F4/80（克隆：BM8）APCBiolegend123115/6
抗 CD11c（克隆：N418）BV785Biolegend117335/6
抗 CD301（克隆：LOM-14）PE-Cy7Biolegend145705/6
抗 CD26（克隆：H194-112）PEBiolegend137803/4
100 μm 滤膜 Fisher Scientific22363548
Fisherbrand 50 ml 离心管Fisher或性能相当的设备 
Fisherbrand 15 ml 离心管Fisher或性能相当的设备 
蔗糖Fisher chemicalS5-3
细尖移液管Samco Scientific232或性能相当的设备 
流式细胞术染色缓冲液EBioscience00-4222-26或性能相当的设备 
1× 红细胞裂解缓冲液EBioscience00-4333-57或性能相当的设备 

参考文献

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