我们在此报告对分子遗传操作的方法 Yarrowia lipolytica Po1g菌株以提高基因敲除效率。所获得的基因工程菌株 Y. lipolytica 菌株在生物燃料和生物化学品生产中具有潜在应用价值。
需要JoVE订阅才能观看此内容。 请登录或开始免费试用
本文内容
摘要
摘要
Yarrowia lipolytica 是一种非致病性、双相型且严格需氧的酵母菌种。由于其独特的生理特征和代谢特性，这种非常规酵母不仅是研究真菌分化基本特性的良好模型，而且是一种具有前景的微生物平台，可用于生化物质生产及多种需要广泛遗传操作的生物技术应用。然而，对该酵母的遗传操作 Y. lipolytica 由于缺乏高效且稳定的遗传转化系统，以及极高频率的非同源重组（这主要归因于） KU70 基因。本文报道了一种简便、快速的高效遗传转化及基因敲除实验方案 Y. lipolytica Po1g。首先，一种将外源DNA高效转化到 Y. lipolytica Po1g 已建立。其次，为了实现增强的双交换同源重组率，以进一步删除目标基因， KU70 基因通过转化携带1 kb同源臂的破坏盒被敲除。第三，为了证明在敲除后基因删除效率的提高 KU70 基因，我们采用相同的方法逐一敲除了编码醇脱氢酶和醇氧化酶的11个目标基因 KU70 敲除平台菌株。观察到精确同源重组率从删除突变时的不到0.5%显著提高 的 KU70 Po1g 中11个靶基因单基因缺失的基因比例为33%-71% KU70Δ. 构建了一种携带潮霉素B抗性标记和Cre/LoxP系统的复制型质粒，通过表达Cre重组酶切除酵母敲除菌株中的筛选标记基因，从而实现多轮靶向遗传操作。所获得的单基因敲除突变体在生物燃料和生物化学品生产中具有潜在应用价值。
引言
与……不同 酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）, 解脂耶氏酵母（Yarrowia lipolytica）， 一种非常规酵母，可根据环境条件的变化以酵母或菌丝形式生长 1,2因此，这种双相酵母可作为研究真菌分化、形态发生及分类学的理想模型。 3,4,5通常被认为是一种公认安全（GRAS）的酵母菌种，广泛用于生产多种食品添加剂，如有机酸、多元醇、芳香化合物、乳化剂和表面活性剂 6,7,8,9它是一种专性需氧菌，也是一种著名的产油酵母，能够自然积累大量脂质。 即，高达细胞干重的70% 10它还能利用多种碳源进行生长，包括废弃物资源中不同种类的残留物作为营养物质。 11,12,13所有这些独特特性使得 Y. lipolytica 非常适合多种生物技术应用。
尽管解脂耶氏酵母（Y. lipolytica）的全基因组序列已经公布14,15，但对该非常规酵母的遗传操作比其他酵母物种更为复杂。首先，由于缺乏稳定且高效的遗传转化系统，该酵母物种的转化效率显著较低16,17。其次，由于尚未发现该酵母中存在天然的游离型质粒系统，通常需通过繁琐的基因组整合线性表达盒来实现目的基因的表达18。第三，基因敲除和敲入的....
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
方案
1. 构建Y. lipolytica KU70基因缺失菌株
- 敲除盒的构建
注意：参见 表1 用于所有聚合酶链式反应（PCR）扩增中所用引物。- 设计引物 20 PCR 扩增 LEU2 表达盒（参见 表1) 来自一个 解脂耶氏酵母 表达载体，并在目标基因的5'端和3'端引入LoxP位点 LEU2 带有长正向引物的表达盒（#1； 表1）以及一段长的反向引物（#2； 表1），分别用于在克隆过程的后续步骤中引入额外的限制性酶切位点。 Bam引物#1中的HI限制性位点。
- 使用高保真DNA聚合酶进行PCR，具体步骤如下所述 表 2.
- 使用PCR纯化试剂盒，按照制造商说明书纯化PCR产物LoxP-启动子-LEU2-终止子-LoxP片段。按照制造商说明书，为纯化的PCR产物添加3'-A突出端。 21使用T4 DNA连接酶将A尾PCR产物连接至TA克隆载体，以获得质粒T-LEU2。 表3.
- PCR 扩增 KU70 基因的 1 kb 5' 上游序列 KU70 ....
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
结果
线性化的 Y. lipolytica 表达载体被插入到基因组中的 pBR 拴系平台 Y. lipolytica 通过单次交换重组获得 Po1g 菌株 27通过本研究建立的快速化学转化方法，将线性化的 Y. lipolytica 表达载体已成功转化至野生型Po1g菌株，转化效率为 >100 cfu/µg DNA。将两端带有1 kb同源序列的敲除盒转化至Po1g菌株中，并将 KU70 基因被成功敲除（图1。在此，正向引物#56退火至位于5'同源臂内的序列 KU70 基因。反向引物#55位于编码区内部 LEU2 标记。反向引物#57位于编码区内部 KU70 基因。然而，在超过200个菌落中，仅有一个为缺失突变的阳性菌落 KU70 基因被观察到，表明基因缺失率极低（<0.5%）。随后，构建了一种携带潮霉素B抗性标记和Cre/LoxP系统的复制型质粒（图2<.......
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
讨论
本研究的目标是实现快速高效地生成特定基因敲除 Y. lipolytica Po1g 菌株. 要实现这一点，需要考虑几个因素。首先，需要具有较高的转化效率。因此，需要一种高效且便捷的化学转化方案，用于 Y. lipolytica 本研究描述了Po1g菌株。使用PEG-4000是该菌株成功转化的关键因素。当使用PEG-3350进行质粒转化时，未能获得转化子（用于转化的 S. cerevisiae）替代 PEG-4000。此外，为在该菌株中获得较高的转化效率，必须使用新鲜制备的感受态细胞。其次，为减少该菌株中通过优势性NHEJ途径发生的非同源重组和随机整合事件，随后采用了一种高效的转化方法来构建 KU70 敲除突变体。第三，为了提高通过同源重组实现基因替换的效率，在基因删除盒中使用了位于目标基因上下游的较长侧翼臂（1 kb）。这些破坏盒中较长的同源侧翼区域对于该菌株中高效的同源重组至关重要。当使用仅含50 bp同源区域的破坏盒时（该长度在其他菌株中足以实现高效的同源重组），未能获得阳性克隆。 S. cerevisiae）。综合运用所有这.......
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
我们衷心感谢新加坡国家环境局（National Environment Agency of Singapore，ETRP 1201102）、新加坡国家研究基金会竞争性研究计划（NRF-CRP5-2009-03）、新加坡科技研究局（Agency for Science, Technology and Research of Singapore，1324004108）以及全球研究计划&韩国知识经济部 #38;D 项目计划（N0000677）、美国国防威胁降低局（DTRA，HDTRA1-13-1-0037）以及新加坡国立大学合成生物学计划（DPRT/943/09/14）
....访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 试剂/材料 | |||
| 寡核苷酸引物 | Integrated DNA Technologies | 25 nmole DNA 寡核苷酸 | |
| Y. lipolytica 菌株 Po1g | Yeastern Biotech | 野生型菌株 W29 (ATCC 20460) 的亮氨酸营养缺陷型衍生物 | |
| 载体 pYLEX1 | Yeastern Biotech | FYY203-5MG | Y. lipolytica 表达载体 |
| E. coli TOP10 | Invitrogen | 用于质粒的克隆与扩增 | |
| pGEM-T 载体 | Promega | A3600 | TA 克隆载体 |
| QIAprep Spin Miniprep 试剂盒 | Qiagen | 27106 | 用于质粒提取 |
| Wizard SV 凝胶与 PCR 纯化系统 | Promega | A9282 | 从琼脂糖凝胶中提取 DNA 片段 并纯化扩增反应中的 PCR 产物 |
| iProof 高保真 DNA 聚合酶 | Bio-Rad | 172-5302 | 高保真 DNA 聚合酶 |
| BamHI | New England Biolabs | R0136S | 限制性内切酶 |
| BglII | New England Biolabs | R0144L | 限制性内切酶 |
| KpnI | New England Biolabs | R0142S | 限制性内切酶 |
| NdeI | New England Biolabs | R0111S | 限制性内切酶 |
| NotI | New England Biolabs | R0189L | 限制性内切酶 |
| PmlI | New England Biolabs | R0532S | 限制性内切酶 |
| PstI | New England Biolabs | R0140S | 限制性内切酶 |
| SacII | New England Biolabs | R0157S | 限制性内切酶 |
| SalI | New England Biolabs | R0138S | 限制性内切酶 |
| XhoI | New England Biolabs | R0146L | 限制性内切酶 |
| T4 DNA 连接酶 | New England Biolabs | M0202L | |
| Taq DNA 聚合酶 | Bio-Rad | M0267L | |
| 氨苄青霉素 | Gibco-Life Technologies | 11593-027 | 抗生素 |
| 潮霉素 B | PAA | P21-014 | 抗生素 |
| GeneRuler 1 kb DNA 标准品 | Thermo Scientific | SM0312 | 1 kb DNA 标准品 |
| PEG4000 | Sigma | 95904-F | |
| Tris | Promega | H5135 | |
| EDTA | Bio-Rad | 161-0729 | |
| 鲑鱼精 DNA | Invitrogen | 15-632-011 | |
| 乙酸锂 | Sigma | ||
| 乙酸 | Sigma | ||
| 玻璃珠 (425-600 µm) | Sigma | G8772 | |
| RNase A | Thermo Scientific | EN0531 | |
| DNA 上样染料 | Thermo Scientific | R0611 | |
| Bacto 酵母提取物 | BD | 212750 | |
| Bacto 蛋白胨 | BD | 211677 | |
| D-葡萄糖 | 1st Base | BIO-1101 | |
| 无氨基酸酵母氮源基础培养基 (YNB) | Sigma | Y0626 | |
| DO Supplement-Leu | Clontech | 630414 | |
| 甘油 | Sigma | G5516 | |
| Difco LB 肉汤 | BD | 244620 | |
| Difco LB 琼脂 | BD | 244520 | |
| Bacto 琼脂 | BD | 214010 | |
| 仪器 | |||
| PCR 仪 | Biorad | T100 Thermal Cycler | |
| 水浴锅 | Memmert | WNB 14 | |
| 恒温/摇床培养箱 | Yihder | LM-570RD | |
| 恒温振荡器 | Allsheng | MS-100 | |
| 微量离心机 | Eppendorf | 5424R | |
| 离心机 | Eppendorf | 5810R | |
| 分光光度计 | Eppendorf | BioPhotometer plus | |
| 凝胶成像系统 | GE | Amersham Imager 600 |
参考文献
- Jiménez-Bremont, J. F., Rodrìguez-Hernández, A. A., Rodrìguez-Kessler, M. Development and dimorphism of the yeast Yarrowia lipolytica. Dimorphic fungi: Their importance as models for differentiation and fungal pathogenesis. J, R. uiz-H. errera , 58-66 (2012).
- Coelho, M., Amaral, P., Belo, I.
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
重印与许可
