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方法文章

非常规酵母的基因工程改造用于可再生生物燃料与生物化学品生产

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DOI：

10.3791/54371

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2016年9月20日

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Biochemistry, Yong Loo Lin School of Medicine, National University of Singapore, 2NUS Synthetic Biology for Clinical and Technological Innovation (SynCTI), Life Sciences Institute, National University of Singapore, 3Food Science and Chemical Engineering, Singapore Institute of Technology

本文内容

摘要

我们在此报告对分子遗传操作的方法 Yarrowia lipolytica Po1g菌株以提高基因敲除效率。所获得的基因工程菌株 Y. lipolytica 菌株在生物燃料和生物化学品生产中具有潜在应用价值。

摘要

Yarrowia lipolytica 是一种非致病性、双相型且严格需氧的酵母菌种。由于其独特的生理特征和代谢特性，这种非常规酵母不仅是研究真菌分化基本特性的良好模型，而且是一种具有前景的微生物平台，可用于生化物质生产及多种需要广泛遗传操作的生物技术应用。然而，对该酵母的遗传操作 Y. lipolytica 由于缺乏高效且稳定的遗传转化系统，以及极高频率的非同源重组（这主要归因于） KU70 基因。本文报道了一种简便、快速的高效遗传转化及基因敲除实验方案 Y. lipolytica Po1g。首先，一种将外源DNA高效转化到 Y. lipolytica Po1g 已建立。其次，为了实现增强的双交换同源重组率，以进一步删除目标基因， KU70 基因通过转化携带1 kb同源臂的破坏盒被敲除。第三，为了证明在敲除后基因删除效率的提高 KU70 基因，我们采用相同的方法逐一敲除了编码醇脱氢酶和醇氧化酶的11个目标基因 KU70 敲除平台菌株。观察到精确同源重组率从删除突变时的不到0.5%显著提高 的 KU70 Po1g 中11个靶基因单基因缺失的基因比例为33%-71% KU70Δ. 构建了一种携带潮霉素B抗性标记和Cre/LoxP系统的复制型质粒，通过表达Cre重组酶切除酵母敲除菌株中的筛选标记基因，从而实现多轮靶向遗传操作。所获得的单基因敲除突变体在生物燃料和生物化学品生产中具有潜在应用价值。

引言

与……不同 酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）, 解脂耶氏酵母（Yarrowia lipolytica）， 一种非常规酵母，可根据环境条件的变化以酵母或菌丝形式生长 1,2因此，这种双相酵母可作为研究真菌分化、形态发生及分类学的理想模型。 3,4,5通常被认为是一种公认安全（GRAS）的酵母菌种，广泛用于生产多种食品添加剂，如有机酸、多元醇、芳香化合物、乳化剂和表面活性剂 6,7,8,9它是一种专性需氧菌，也是一种著名的产油酵母，能够自然积累大量脂质。 即，高达细胞干重的70% 10它还能利用多种碳源进行生长，包括废弃物资源中不同种类的残留物作为营养物质。 11,12,13所有这些独特特性使得 Y. lipolytica 非常适合多种生物技术应用。

尽管解脂耶氏酵母（Y. lipolytica）的全基因组序列已经公布14,15，但对该非常规酵母的遗传操作比其他酵母物种更为复杂。首先，由于缺乏稳定且高效的遗传转化系统，该酵母物种的转化效率显著较低16,17。其次，由于尚未发现该酵母中存在天然的游离型质粒系统，通常需通过繁琐的基因组整合线性表达盒来实现目的基因的表达18。第三，基因敲除和敲入的构建受到限制，因为该酵母中依赖精确同源重组的基因靶向效率较低，大多数整合事件通过非同源末端连接（NHEJ）发生19。

本研究报道了一种针对Y. lipolytica Po1g菌株优化的转化方案，该方法简便、快速、高效且可重复。为了提高精确同源重组的频率，我们删除了编码NHEJ通路关键酶的KU70基因。通过采用优化后的转化方案，并转化含有1 kb侧翼同源区域的线性敲除片段，成功实现了Y. lipolytica Po1g菌株中KU70基因的敲除。随后，通过靶向Po1g KU70Δ菌株中的醇脱氢酶和醇氧化酶基因，验证了该基因敲除方法的稳健性。结果表明，KU70基因缺失菌株在介导同源重组的基因靶向效率上显著高于野生型Po1g菌株。此外，我们构建了一个携带潮霉素B抗性标记的复制型Cre表达质粒，用于实现标记基因的回收。该标记回收系统可在获得的基因敲除突变体中实现多轮基因靶向操作。除了基因敲除外，本文所述的遗传转化与基因敲除方案还可用于将基因插入特定位点，以及在Y. lipolytica基因组中引入位点特异性突变。

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方案

1. 构建Y. lipolytica KU70基因缺失菌株

  1. 敲除盒的构建
    注意：参见 表1 用于所有聚合酶链式反应（PCR）扩增中所用引物。
    1. 设计引物 20 PCR 扩增 LEU2 表达盒（参见 表1) 来自一个 解脂耶氏酵母 表达载体，并在目标基因的5'端和3'端引入LoxP位点 LEU2 带有长正向引物的表达盒（#1； 表1）以及一段长的反向引物（#2； 表1），分别用于在克隆过程的后续步骤中引入额外的限制性酶切位点。 Bam引物#1中的HI限制性位点。
    2. 使用高保真DNA聚合酶进行PCR，具体步骤如下所述 表 2.
    3. 使用PCR纯化试剂盒，按照制造商说明书纯化PCR产物LoxP-启动子-LEU2-终止子-LoxP片段。按照制造商说明书，为纯化的PCR产物添加3'-A突出端。 21使用T4 DNA连接酶将A尾PCR产物连接至TA克隆载体，以获得质粒T-LEU2。 表3.
    4. PCR 扩增 KU70 基因的 1 kb 5' 上游序列 KU70 使用引物#3/#4从该基因 解脂耶氏酵母 Po1g 基因组 DNA 22 按照 表 2使用PCR纯化试剂盒，按照制造商说明书纯化PCR产物。
      1. 用双酶切分别处理纯化的PCR产物和T-LEU2质粒 Sac二和 BamHI酶按照以下方式处理 表 4. 使用PCR纯化试剂盒，按照制造商说明书纯化消化后的混合物。利用T4 DNA连接酶将纯化并经消化的PCR产物与 SacII/BamT-LEU2 的 HI 位点以得到质粒 T-LEU2-5E 表3.
    5. PCR 扩增 KU70 基因 3' 下游 1 kb 序列 KU70 使用引物#5/#6从目标基因扩增 解脂耶氏酵母 Po1g 基因组 DNA 22 按照 表2使用PCR纯化试剂盒，按照制造商说明书纯化PCR产物。用限制性内切酶对纯化的PCR产物和T-LEU2-5E质粒进行双酶切消化。 否我与 NdeI 酶按照 表4.
      1. 使用PCR纯化试剂盒，按照制造商说明书纯化消化后的混合物。然后，将纯化并经消化的PCR产物连接至 否一/NdeT-LEU2-5E 的 I 位点，使用 T4 DNA 连接酶连接以获得质粒 T-KO 表3.
    6. 用限制性内切酶消化 T-KO 质粒 Sac二和 NdeI 酶按照 表4 以制备敲除盒（图1). 使用PCR纯化试剂盒，按照制造商说明书纯化消化后的DNA片段。
  2. 感受态细胞制备与转化 解脂耶氏酵母 Po1g 菌株
    1. 感受态细胞制备
      1. 接种一环菌落 解脂耶氏酵母 从新鲜的酵母提取物-蛋白胨-葡萄糖（YPD）平板中挑取Po1g菌株，接种于100 ml三角瓶中的10 ml YPD培养基（1%酵母提取物、2%蛋白胨、2%葡萄糖和50 mM柠檬酸缓冲液，pH 4.0）中。在30 °C下培养 °C摇床培养箱中，225 rpm振荡培养20小时至饱和（OD600 约为15（使用分光光度计测定）。
      2. 将细胞在室温下以 5,000 × g 离心 5 分钟，收集菌体。用 20 ml Tris-EDTA（TE）缓冲液（10 mM Tris，1 mM EDTA，pH 7.5）洗涤细胞，并按照步骤 1.2.1.2 所述方法收集菌体。将细胞重悬于 1 ml 0.1 M 醋酸锂溶液（pH 6.0，用醋酸调节）中，在室温下孵育 10 分钟。
      3. 分装感受态细胞（100 μL） µl）分装至无菌的1.5 ml离心管中。立即进行下述转化步骤，或加入甘油至终浓度25%（v/v），于-80℃保存。 °用于长期保存。
    2. 转化
      1. 轻轻混匀10 µ10 毫克/毫升的变性鲑鱼精子 DNA 1-5 微升 µ纯化的破坏盒100微克及 µl 感受态细胞，30 ℃孵育 °15分钟，37°C
      2. 加入700 µ40% 聚乙二醇（PEG）-4000（溶于 0.1 M 醋酸锂，pH 6.0）1 升，充分混匀，于 30 ℃孵育 °225 rpm 条件下于摇床培养箱中振荡培养 60 分钟
        注意：必须使用平均分子量为4000的聚乙二醇（PEG），而非常规酵母转化中常用的PEG-3350。
      3. 将转化混合物置于39℃水浴中进行热激 °C水浴60分钟。
      4. 加入1 ml YPD培养基，30℃恢复培养2小时 °C 和 225 rpm。在室温下以 9,000 x g 离心 1 分钟，弃上清液，将沉淀重悬于 1 ml TE 缓冲液中。
      5. 通过在室温下以 9,000 x g 离心 1 分钟使细胞重新沉淀，弃去上清液。将沉淀重悬于 100 µTE缓冲液，并涂布于选择性平板上（例如，亮氨酸缺陷平板），于30℃培养 °2-3天，4°C
      6. 挑取4到10个单菌落，分别接种于2 ml YPD培养基中，30℃过夜培养。 °225 rpm 条件下于摇床培养箱中培养。通过 PCR 分析转化子的基因组 DNA 以鉴定阳性克隆 22 按照 表5 分别使用引物对 #55/#56 和 #56/#57。
        注意： 否将线性化的 pYLEX1 载体转化入 解脂耶氏酵母 Po1g 感受态细胞，通过计数每单位形成菌落的菌落数（cfu）来确定转化效率 µg 质粒 DNA 使用量 23.

2. 标记基因回收

  1. Cre表达质粒的构建
    1. pYLEX1-CRE 和 pYLEX1-HPH 的构建
      1. 设计引物 20 扩增开放阅读框的PCR cre 和 hph在正向引物#82和#84的起始密码子上游添加一个额外的腺嘌呤核苷酸，并插入 Kpn在反向引物#83和#85的终止密码子下游引入I型限制性酶切位点。通过PCR扩增目标基因的开放阅读框。 Cre 和 hph 来自 pSH69（登录号 HQ412578） 24 按照 表 2.
      2. 纯化两者 cre 和 hph 使用PCR纯化试剂盒按照制造商说明书纯化片段。将纯化后的两者进行消化 cre 和 hph 带有 KpnI 酶按照 表 4. 用双酶切消化 pYLEX1 质粒 Pml我与 KpnI 酶如上所述 表 4使用PCR纯化试剂盒，按照制造商说明书纯化消化产物。
      3. 按照 T4 DNA 连接酶的使用说明进行操作 表3 连接纯化并消化的 Cre 和 hph 片段 Pml一/KpnI位点的 解脂耶氏酵母 表达载体，分别得到 pYLEX1-CRE 和 pYLEX1-HPH。
    2. pSL16-CRE-HPH 的构建
      1. PCR 扩增启动子-基因-终止子片段 Cre 使用引物#86/#87从pYLEX1-CRE上扩增出两侧带有同源臂的片段 盐一/PstI 限制性酶切位点，按照 表 2使用PCR纯化试剂盒，按照制造商说明书纯化PCR产物。
        1. 用双酶切消化纯化的PCR产物和pSL16-CEN1-1 (227)质粒 25 与 盐我与 PstI 酶按照 表 4使用PCR纯化试剂盒，按照制造商说明书纯化消化后的混合物。随后，将纯化并消化的PCR产物在相应位点使用T4 DNA连接酶连接至pSL16-CEN1-1 (227)，构建pSL16-CRE。 表3.
      2. PCR 扩增启动子-基因-终止子片段 hph 使用引物#88/#89从pYLEX1-HPH中扩增，引物位于两侧 flank 区 Xho一/BglII型限制性酶切位点 表 2使用PCR纯化试剂盒，按照制造商说明书纯化PCR产物。
        1. 用双酶切分别处理纯化的PCR产物和pSL16-CRE质粒 Xho我与 BglII型酶按照 表 4使用PCR纯化试剂盒，按照制造商说明书纯化消化后的混合物。然后，将纯化并消化的PCR产物利用T4 DNA连接酶在相应位点连接至pSL16-CRE，以构建pSL16-CRE-HPH。 表3.
          注意：所获得的 Cre 表达质粒 pSL16-CRE-HPH 携带可筛选的潮霉素 B 标记，是一种着丝粒型且可游离复制的载体图2).
      3. 使用适当的限制性内切酶对所有构建体进行酶切验证例如, 盐一/PstI，以从载体中切除插入片段）按照 表4.
  2. Cre重组酶介导的标记基因回收
    1. 将 pSL16-CRE-HPH 转化至感受态的 KU70 按照上述第1.2节所述转化方案，将转化后的细胞涂布于含潮霉素B的YPD平板（YPDH，含400 µg/ml 潮霉素B），于30℃培养 °2-3天，4℃
    2. 按照以下步骤进行菌落PCR 表 5 使用引物#84/#85鉴定转化后含有pSL16-CRE-HPH质粒的阳性菌落。
      注意：上游引物#84和下游引物#85位于编码区内部 hph 基因表1只有阳性克隆能在PCR反应中产生特异的PCR产物。
    3. 挑选一个阳性克隆，接种于2 ml YPDH培养基中，在30 °C下振荡培养24小时。 °C 摇床培养箱中，225 rpm 过夜培养至饱和。测定细胞 OD600 使用分光光度计测定。在 OD 值达到指定条件时收获细胞600 约15。在室温下以5,000 x g离心5分钟，并用2 ml无菌水洗涤一次。
    4. 将细胞重新接种至 2 ml YPD 培养基中，初始 OD600 0.1，并在30℃下培养细胞 °225 rpm 条件下于恒温摇床中过夜培养。将过夜培养的菌液涂布于 YPD 平板，以分离单菌落。 23将菌落复制到YPD、YPDH和缺乏亮氨酸的平板上 23.
      注意：已丢失两个标记的菌落 LEU2 标记基因和pSL16-CRE-HPH质粒只能在YPD平板上生长（图3).

3. 醇脱氢酶和醇氧化酶基因的敲除

  1. 使用基本局部比对搜索工具（BLAST）在 Y. lipolytica 基因组数据库中进行搜索，以鉴定待删除的候选基因26。将 S. cerevisiae 酒精脱氢酶 I 的蛋白质序列输入 BLAST 搜索工具（http://www.genome.jp/tools-bin/search_sequence?prog=blast&db=yli&seqid=aa）。
    注意：BLAST 搜索工具将返回 Y. lipolytica 基因组数据库中序列最相似的蛋白质。
  2. 使用引物 #7 至 #56（表 1）通过 PCR 构建删除盒，并采用与上述第 1.1 节所述相同的方法进行限制性内切酶消化和连接反应。
  3. 制备 KU70 基因敲除菌株的感受态细胞，按照上述第 1.2 节所述方案进行转化，并使用引物 #55、#58 至 #81（表 1）通过 PCR 鉴定阳性克隆。
    注意：以 YALI0E17787g 基因的删除为例，其操作流程见图 4和图 5。文中还报道了 1 kb 和 2 kb 长度同源区域对同源重组效率的影响。

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结果

线性化的 Y. lipolytica 表达载体被插入到基因组中的 pBR 拴系平台 Y. lipolytica 通过单次交换重组获得 Po1g 菌株 27通过本研究建立的快速化学转化方法，将线性化的 Y. lipolytica 表达载体已成功转化至野生型Po1g菌株，转化效率为 >100 cfu/µg DNA。将两端带有1 kb同源序列的敲除盒转化至Po1g菌株中，并将 KU70 基因被成功敲除（图1。在此，正向引物#56退火至位于5'同源臂内的序列 KU70 基因。反向引物#55位于编码区内部 LEU2 标记。反向引物#57位于编码区内部 KU70 基因。然而，在超过200个菌落中，仅有一个为缺失突变的阳性菌落 KU70 基因被观察到，表明基因缺失率极低（<0.5%）。随后，构建了一种携带潮霉素B抗性标记和Cre/LoxP系统的复制型质粒（图2<...

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讨论

本研究的目标是实现快速高效地生成特定基因敲除 Y. lipolytica Po1g 菌株. 要实现这一点，需要考虑几个因素。首先，需要具有较高的转化效率。因此，需要一种高效且便捷的化学转化方案，用于 Y. lipolytica 本研究描述了Po1g菌株。使用PEG-4000是该菌株成功转化的关键因素。当使用PEG-3350进行质粒转化时，未能获得转化子（用于转化的 S. cerevisiae）替代 PEG-4000。此外，为在该菌株中获得较高的转化效率，必须使用新鲜制备的感受态细胞。其次，为减少该菌株中通过优势性NHEJ途径发生的非同源重组和随机整合事件，随后采用了一种高效的转化方法来构建 KU70 敲除突变体。第三，为了提高通过同源重组实现基因替换的效率，在基因删除盒中使用了位于目标基因上下游的较长侧翼臂（1 kb）。这些破坏盒中较长的同源侧翼区域对于该菌株中高效的同源重组至关重要。当使用仅含50 bp同源区域的破坏盒时（该长度在其他菌株中足以实现高效的同源重组），未能获得阳性克隆。 S. cerevisiae）。综合运用所有这...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

我们衷心感谢新加坡国家环境局（National Environment Agency of Singapore，ETRP 1201102）、新加坡国家研究基金会竞争性研究计划（NRF-CRP5-2009-03）、新加坡科技研究局（Agency for Science, Technology and Research of Singapore，1324004108）以及全球研究计划&韩国知识经济部 #38;D 项目计划（N0000677）、美国国防威胁降低局（DTRA，HDTRA1-13-1-0037）以及新加坡国立大学合成生物学计划（DPRT/943/09/14）

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
试剂/材料
寡核苷酸引物Integrated DNA Technologies25 nmole DNA 寡核苷酸
Y. lipolytica 菌株 Po1gYeastern Biotech野生型菌株 W29 (ATCC 20460) 的亮氨酸营养缺陷型衍生物
载体 pYLEX1Yeastern BiotechFYY203-5MGY. lipolytica 表达载体
E. coli TOP10Invitrogen用于质粒的克隆与扩增
pGEM-T 载体 PromegaA3600TA 克隆载体
QIAprep Spin Miniprep 试剂盒Qiagen27106用于质粒提取
Wizard SV 凝胶与
PCR 纯化系统		PromegaA9282从琼脂糖凝胶中提取 DNA 片段
并纯化扩增反应中的 PCR 产物
iProof 高保真
DNA 聚合酶		Bio-Rad172-5302高保真 DNA 聚合酶
BamHI New England BiolabsR0136S限制性内切酶
BglII New England BiolabsR0144L限制性内切酶
KpnINew England BiolabsR0142S限制性内切酶
NdeI New England BiolabsR0111S限制性内切酶
NotINew England BiolabsR0189L限制性内切酶
PmlINew England BiolabsR0532S限制性内切酶
PstI New England BiolabsR0140S限制性内切酶
SacIINew England BiolabsR0157S限制性内切酶
SalINew England BiolabsR0138S限制性内切酶
XhoINew England BiolabsR0146L限制性内切酶
T4 DNA 连接酶New England BiolabsM0202L
Taq DNA 聚合酶 Bio-RadM0267L
氨苄青霉素Gibco-Life Technologies11593-027抗生素
潮霉素 BPAAP21-014抗生素
GeneRuler 1 kb DNA 标准品Thermo ScientificSM03121 kb DNA 标准品
PEG4000Sigma95904-F
TrisPromegaH5135
EDTABio-Rad161-0729
鲑鱼精 DNAInvitrogen15-632-011
乙酸锂Sigma
乙酸Sigma
玻璃珠 (425-600 µm)SigmaG8772
RNase AThermo ScientificEN0531
DNA 上样染料Thermo ScientificR0611
Bacto 酵母提取物BD212750
Bacto 蛋白胨BD211677
D-葡萄糖1st BaseBIO-1101
无氨基酸酵母氮源基础培养基 (YNB)SigmaY0626
DO Supplement-LeuClontech630414
甘油SigmaG5516
Difco LB 肉汤BD244620
Difco LB 琼脂BD244520
Bacto 琼脂BD214010
仪器
PCR 仪BioradT100 Thermal Cycler
水浴锅MemmertWNB 14
恒温/摇床培养箱YihderLM-570RD
恒温振荡器AllshengMS-100
微量离心机Eppendorf5424R
离心机Eppendorf5810R
分光光度计Eppendorf BioPhotometer plus
凝胶成像系统GEAmersham Imager 600

参考文献

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