医疗器械细菌高通量鉴定驱蚊聚合物

摘要

描述了一种用于鉴定聚合物的高通量微阵列方法，这些聚合物可减少医疗器械上的细菌表面结合。

摘要

医疗器械通常与医院获得性感染有关，这会给患者和医疗保健系统带来巨大压力，并导致抗菌素耐药性。减少器械相关感染的一种可能途径是识别这些器械的抗菌聚合物涂层，这将防止细菌在初始连接步骤中的结合。这里描述了一种基于使用微阵列平行筛选数百种聚合物来识别此类排斥聚合物的方法。这种高通量方法导致鉴定出一系列有前途的聚合物，这些聚合物可以单独抵抗各种临床相关细菌物种的结合，也可以抵抗多物种群落的结合。一种聚合物 PA13 （聚（甲基丙烯酸甲酯-co-二甲基丙烯酰胺）） 在涂覆到两个市售中心静脉导管上时，显示许多医院分离株的附着显着减少。所描述的方法可用于识别用于细菌附着修饰很重要的广泛应用的聚合物。

引言

聚合物微阵列是小型化，其中高达7,000聚合物¹被印刷到载玻片于原核或真核细胞²平行分析的高通量平台。这里介绍的方法基础上，与我们于2010年首次³所述。这种筛选系统已被应用于许多类型的细胞，包括人肝细胞^4，干细胞^5，肾小管上皮细胞^2，细菌^3,6和原生动物病原体^7。在每一种情况下，促进或所研究的细胞的抗蚀剂结合性聚合物被确定^8。用合成的聚阳离子聚合物的DNA的复合物也已在基因转染的候选⁹的高通量筛选的微阵列形式使用。以及筛选细胞-基底相互作用，聚合物微阵列也被用于评估材料特性^10。

">合成聚合物的调节细菌附着于表面的能力是公认的^3,6,11。许多因素，包括电荷，疏水性和聚合物表面的表面粗糙度是已知的影响发现生物材料细菌结合。该常规方法该抗蚀剂的细菌通过依次或结合凭经验设计和一次测试一个材料是劳动密集型的，昂贵的和耗时的过程。聚合物微阵列提供规避这种限制一个有吸引力的替代方案。

表面相关的细菌成长为一个复杂的人口称为生物膜 - 这种生物膜对许多环境压力和抗生素高度耐药。这部分是由于它们的稠密细胞外基质（蛋白质，多糖和核酸组成^）12，部分由于健壮"persistor"细胞的生物膜¹³增加的存在。本书虽然是啊表面关联和随后的生物膜形成的确切机制是难以表征，它一般认为有表面生长¹⁴的三个不同阶段^{- 16。}最初，可逆附着后跟细胞更强的粘附性，由生产的胞外蛋白和多糖基质和细胞增殖建立生物膜。最后，成熟的生物膜释放自由生活的浮游细胞，它可以在其他地方引发新的感染。菌驱蚊防止细菌的初始附着，从而防止生物膜形成的早期阶段的聚合物，可能代表用于最小化感染的最佳解决方案。给予抗生素抗性的上升（也表面相关的细菌¹²的内在阻力较大），减少了感染的无抗生素的装置是特别有意义的。在医院环境中，细菌驱蚊聚合物涂层可以在医院内感染，这通常形成围绕植入设备¹⁷的减少有直接的医疗应用。

这里，描述了用于381聚合物为针对一系列与院内感染相关的病原性细菌的驱避活性的筛选的高通量方法，随后命中的验证和随后的涂覆和中心静脉导管的材料的测定中，（ 图1）。简要地说，将聚合物点样到由接触印刷琼脂糖包被的载玻片上，干燥和消毒后，小型化的阵列，用临床上重要的细菌培养物温育。孵育后，将微阵列轻轻洗涤和粘附的细菌细胞染色，并通过荧光可视化。接着，其抑制细菌结合聚合物是通过涂覆到玻璃盖玻片上的较大规模研究和利用电子显微镜观察。所选击退然后借给聚合物涂覆到商业导管和示出了近100倍，以减少细菌的附着。

方案

1.琼脂糖包膜幻灯片的制备

注:制造聚合物微阵列之前，氨基烷基硅烷涂覆的玻璃载片涂覆有琼脂糖的IB以减少非特异性背景结合，并允许结合或排斥菌⁶的聚合物的评价。硅烷涂层有利于琼脂糖以幻灯片的结合。

1. 补2％（重量/体积）琼脂糖ⅠB的在蒸馏水中的250毫升瓶中溶液。
2. 松散封盖瓶子后，加热在微波炉的悬浮液在30秒时间段直至溶解。确保该帽不紧紧关闭，以避免任何可能的压力累积。定期取出瓶子，轻轻摇动。
3. 确保固体溶解，将溶液是明确的。倒在65℃的水浴此琼脂糖溶液的100毫升烧杯中，并地方保持液体溶液。
4. 浸硅烷包被的载玻片放入琼脂糖溶液，以确保均匀的涂层，和WiPE的幻灯片用棉纸背面。
5. 干的幻灯片，用涂边了，在无尘的环境中（ 例如 ，一个柜子里或通风柜）最少24小时。
6. 确认通过目测均匀的涂层。会形成冷凝非涂布地区 - 涂层可以通过呼吸到幻灯片很容易评估。只有完全和均匀包被的载玻片应该用于微阵列打印。

2.印刷聚合物溶液的制备

1. 选择包括在玻璃小瓶N-甲基吡咯烷酮（NMP）中的聚丙烯酸酯，聚丙烯酰胺和聚氨基甲酸乙酯预形成聚合物的制备溶液（1％重量/体积）。 （制备各1ml聚合物）。涡旋直至聚合物完全溶解。聚合物的合成在别处^6中描述。
2. 用微型移液管，填充用25微升的聚合物溶液384微孔板的各孔中，以确保不存在交叉CONTA萌发和每个孔含有独特的聚合物。使用NMP作为在至少2个孔的阴性对照。记录上的孔板模板或电子表格文件在每个孔中的聚合物溶液的身份。

3.印刷聚合物微阵列使用接触打印机

注:使用接触打印机进行芯片的打印。关于聚合物微阵列打印具体说明如下。有关使用打印机和安全建议的一般准则，遵循从制造商的用户手册。虽然我们使用一个接触打印机，合适的手动冲压设备也可使用。

1. 作为在打印机的用户手册劝，创建例程（参见步骤3.3），允许的384液体（聚合物溶液或NMP）中一式四份的印刷，使用的是32针microarraying头（设置为8行和4列）。
2. 打印排列为48行和32列的1536点。编程例程在12节打印S， 即 ，在时间32的解决方案，从而使打印机能够打印每个部分，以允许销清洗后停止。
3. 要创建一个打印程序:
   1. 打开软件，然后从可用选项中选择"创建一个新的程序"。选择"说明"选项卡，在实验的输入信息。选择"头"选项卡，然后选择'32 -pin microarraying头"。
   2. 选择"源"选项卡，然后选择板夹（来源板支架（1×5）），板型（板384点¯x6000），总板（1）和源顺序（按列）。
   3. 在选项卡"幻灯片设计"，选择"3X1'滑'，并选择通过排列田间号"。然后选择"组阵模式"。输入"现货视图"作为"布局"和"布局尺寸"为"行数"（6），"列数"（8），"行间距"（750）和"列间距"（560）。选择一款打印冷杉吨。
   4. 在"幻灯片版式"选项卡中输入用于打印幻灯片的数量。选择"打印"选项卡输入打印参数（每墨邮票数量:1，每点邮票数量:100毫秒5，冲压时间:200毫秒，墨时间）。
      注:现在一式肆份打印384液体（聚合物溶液或NMP），采用32引脚microarraying头（排列为8行4列）创建的程序。总共日常应打印排列为48行和32列具有750微米的行距和560微米的行距1536点。
4. 放置在平台上的琼脂糖包被的载玻片，并确保良好的真空密封以保持滑动就位。
5. 调整打印头，使得所有管脚处于相同的高度。通过手动降头在载玻片上，并确认该引脚在同一时间拉升检查。如果有与高度的任何差异，通过使用黑色PU皮ip调整E在针向上或向下。
6. 放置在正确的方向在板夹持器， 即 ，A1孔是在支架的右上角的孔板并确保孔板被牢固地固定。
7. 使用高度调节，确保该板保持器的高度是这样的，采摘聚合物溶液时，销不接触孔的底部。
   注:这是均一的聚合物斑点重要，也避免了聚合物溶液的蔓延到相邻的井，从而造成交叉污染。
8. 选择"开始"选项卡，选择"运行类型"为"正常"。点击"运行"，并确认该幻灯片，孔板等 ，在出现提示时在适当的位置。
9. 在一个时间（每次32解决方案; 12节）打印1部分，允许部分之间的引脚清洁。清洁销在丙酮彻底用纸巾浸渍，接着干燥的薄纸，以确保销完全干燥。
10. 在微阵列的打印完成时，将它们放置在滑动架和在炉中在45℃以除去NMP中的聚合物斑点真空过夜干燥。用UV光30分钟灭菌后，将微阵列准备好细菌的接种。
11. 细菌接种幻灯片之前，请背景荧光的测量（如第5节）。细菌结合的计算中使用这种测量。

4.聚合物微阵列接种细菌

注:确保良好的无菌技术。培养物的所有处理应该在无菌环境中进行的:要么使用本生灯或在流罩。培养物应当用氧的可用性，生长培养基，和温度调节到每个物种的要求来生长。

1. 接种5毫升的Luria-BERTANI肉汤（LB准备过夜培养10克L- ^-1细菌用蛋白胨，5克L ^-1 NaCl的，和10克L- ^{-1酵母抽提物）与从板的殖民地。在37℃下孵育过夜，以200rpm振荡。}
2. 通过添加甘油（10％浓度的整体）的准备过夜培养的冷冻库存，并存储在股票-80℃。
3. 为了从解冻的细菌种群的样品确定的细胞数，进行各股票的连续稀释并过夜生长的细菌在固体培养基上。在股细胞数量的准确测定可确保各种⁶的适当接种。
4. 微阵列准备接种。单一物种培养物如上述生长并直接施用到微阵列。 BacMix-1是肺炎克雷伯氏菌 （ 肺炎克雷伯 ）， 腐生葡萄球菌 （ 腐生葡萄球菌 ）和金黄色葡萄球菌 （ 金黄色葡萄球菌 ）的细菌混合物。BacMix-2是由链球菌（变形链球菌）的细菌混合物， S.金黄色葡萄球菌 ，K.肺炎和粪肠球菌 （ 粪肠球菌 ）。
5. ，以产生混合培养，在相同体积（3毫升每个）混合过夜并稀释四次新鲜LB（到50 ml终体积）。
6. 放置紫外线灭菌的聚合物微阵列在矩形4孔板并用6ml的混合细菌培养物，在37℃，轻轻摇动（30转）5天孵育它们。
7. 孵育后，轻轻地用磷酸缓冲盐水冲洗微阵列两次（PBS:137mM的氯化钠，2.7mM的氯化钾，10毫_的 Na ₂ HPO _4，1.8毫摩尔KH ₂ PO _4），并用1微克毫升的溶液孵育4 ^-1 '，6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）在PBS中染色30分钟。
8. 用PBS覆盖，并轻轻摇动，改变了PBS洗一次在一个新的孔板染色芯片幻灯片。空气流下干燥。应用盖玻片的微阵列及密封的地方用胶水。一旦ðRY，消毒的外表面，用70％（体积/体积）乙醇。
9. 根据自己的防护水平的安全文化处分的权利。

5.芯片成像和分析

1. 捕捉每个聚合物点单幅图像在明和DAPI（前/ EM = 358纳米/ 361纳米）的通道。用安装有一20X物镜的荧光显微镜或使用自动荧光显微镜（由图像获取软件控制的XYZ载物台）手动执行此。
   注意:请参考手册¹⁸操作软件和调整显微镜获得使用明和DAPI通道的图像。确保用于图像捕获的增益和曝光时间对于所有的微阵列是相同的。
2. 通过选择的点区域和量化用图像处理软件的荧光获得在DAPI通道中的每个点的平均荧光强度。
3. 对于每个点的背景荧光，OBTA在复制芯片聚合物点的图像只能用无细菌培养的媒体。从点的强度扣除背景荧光从细菌获得的荧光。
4. 从四个点计算平均归一化值，代表每个聚合物，用于比较细菌各种聚合物⁶的结合。
5. 识别表现出最少的细菌结合（最低荧光）为"重灾区"聚合物⁶聚合物。

6.涂层盖玻片为"重灾区"验证

1. 与聚合物涂层盖玻片:
   1. 制备"击中"的聚合物的溶液（〜2％重量/体积）在四氢呋喃（THF），或其它适当的溶剂。
   2. 用旋涂器以2000rpm进行10秒的聚合物溶液的合适尺寸的旋涂圆形盖玻片。
      注意:在不存在旋涂器，盖玻片或其它材料可以是浸涂，虽然旋涂层产生更均匀的表面。
   3. 干燥的对流烘箱中涂覆的盖玻片在40℃下过夜，并使用UV光进行接种细菌之前30分钟消毒。
2. 与琼脂糖大衣盖玻片阴性对照:
   1. 清洁盖玻片或者通过等离子体处理10分钟或在1M氢氧化钠中浸渍4小时。
   2. 沉浸盖玻片在含有1％（3-氨基丙基）三乙氧基硅烷过夜乙腈。用丙酮清洗盖玻片3次，并放入烘箱（100℃）1小时。
   3. 浸涂用1％琼脂糖水溶液干燥盖玻片，在60℃的水浴中保持。放置在平坦的表面上的琼脂糖包被的盖玻片在24小时无尘环境条件和使用UV光进行接种细菌之前30分钟消毒。

7.附件和盖玻片利用扫描电镜分析（SEM）

1. 后灭菌用UV光30分钟，放置在标准的12孔板或24孔板（取决于盖玻片的大小）的盖玻片（聚合物/琼脂糖涂覆或未涂覆的玻璃）中，用菌孵育作为部分所述4。
2. 与细菌培养后，用0.1M二甲胂酸盐缓冲液（pH 7.4）洗涤未涂覆和涂覆的盖玻片两次，然后用2.5％（重量/体积）在0.1M二甲胂酸盐缓冲液戊二醛（pH7.4）中固定2小时。
3. 修复交样品用1％（重量/体积）的四氧化锇在室温下1小时，并用连续的乙醇洗涤，在50，70％，90％和100％（V / V），每30分钟脱水。
4. 在CO ₂的干样品根据标准方法^19。干燥时间取决于样品的性质。
5. 涂层样品在用溅射镀膜机，在30毫安的电流，并在真空在0.75乇的金/钯合金（60/40％）。电子显微镜按标准协议^，20岁以下^的检查。
   注:少尉URE足够的安全预防措施，以管理来自贮存，处理和处置的四氧化锇导致的风险，因为它是剧毒。
6. 直观比较的无涂层盖玻片的图像和那些涂有琼脂糖或"重灾区"的聚合物，以确认聚合物的细菌结合/排斥能力。
   注:附件的阻力应尽量减少细胞存在容易看到。
7. 选择最有前途的"重灾区"非约束性聚合物用于医疗设备（ 例如 ，中心静脉导管^）6涂层的研究。

8.一种溶剂为涂料导管的选择

1. 评估各种溶剂为它们与导管的留置部分的相容性，以及它们以溶解"击中"聚合物的能力。切割导管-1，并进入圆筒件5毫米份的长度，并用数字游标卡尺测量。
2. 评估各种溶剂如ACET集成电路酸，氨，丙酮，乙腈，二乙醚，四氢呋喃（THF），二甲基甲酰胺（DMF），N-甲基-2-吡咯烷酮（NMP），乙醇，甲醇，乙二醇，甲苯和二甲苯。沉浸在溶剂导管件12小时，对导管和溶剂清晰度的完整性目视评价。
   注意:选择不会导致导管膨胀或崩解或导致混浊溶剂的溶剂。溶剂必须溶解"重灾区"的聚合物。

9.激光共聚焦显微镜上的导管细菌吸附分析

1. 制备2.5％（重量/体积）的丙酮或其它合适的溶剂的聚合物溶液作为第8.将5毫米导管件确定成一个小玻璃小瓶（5毫升）和沉浸其中在1ml的聚合物溶液2分钟。除去多余的聚合物溶液，并在40℃的真空烘箱中过夜干燥所述导管件。
2. 通过混合细菌解冻ST接种准备ocks，得到约10 ⁶各自物种的细胞在50ml的LB ^6。
3. 消毒涂覆和未涂覆的导管件用UV光30分钟，并用1ml在24孔平板接种LB孵育，在37℃下进行3天，用温和搅拌^6。
4. 温育后，冲洗导管，用PBS（2×2毫升）中，固定用在PBS中的10％的多聚甲醛的菌30分钟，并用PBS（1ml）中洗涤。染色上导管件用DAPI细菌（1微克毫升^{- 1）20}分钟，并用PBS（1ml）中洗涤。
5. 获得使用以下设置导管件共聚焦图像:405纳米的蓝色激光二极管，检测范围414到502纳米，销孔 - Airy1，图像大小 - 1,024×1,024像素，像素宽度 - 105.2纳米，Z-栈间距0.5μ米，放大倍率 - 40X 1.25。
6. 由Z-堆叠横跨导管的100微米长50幅图像完成共焦成像。
7. 分析使用suitab图像乐分析软件:扁平化的Z堆叠图像Z平面，使用功能来扩展景深，创造了导管件的单个图像。
   注:然后将该图像进行分析，以获得由细菌覆盖导管的区域中，之后使用"弄平背景'功能背景校正。

通过SEM导管上细菌附着10.分析

1. 制备10％的丙酮的聚合物溶液（重量/体积）。
2. 按一个枪头（200微升微量）插入切片导管的中间部分，以保持它与浸在聚合物溶液中的一块约30秒。干在环境条件下涂覆的片30分钟。通过再次浸入在环境条件下在聚合物溶液中并干燥过夜施加第二涂层。
3. 紫外线处理和培养细菌后洗片（N = 3）用PBS（2×1毫升），并将它们转移到含有1 48孔板在PBS 0％甲醛30分钟。定影后，洗片用PBS（1ml）中，在室温下干燥过夜，安装在用导电性碳磁盘存根和金涂层用溅射涂布机（见步骤7.5）。
4. 获得使用扫描电子显微镜⁶的图像。

结果

图2示出了细菌附着（归一化的荧光强度）与数如通过微阵列分析测定的聚合物。印刷没有聚合物斑点（NMP只）是阴性对照，如琼脂糖强烈抵抗细菌结合⁶ -记录荧光很低。显示的聚合物是所有低结合虽然在大多数情况下，聚合物的拒水拒油性测试细菌物种之间显著而变化。这反映了在不同种类的附件机制之间的巨大差异。适当聚合物的选择是因此依赖于应用，但低结合性聚合物容易被琼脂糖比较鉴定。高粘合聚合物有可能在一个阵列被识别，并且可以用作用于随后的实验中的阳性对照。为不显示自发荧光的DAPI通道的聚合物，定性共光斑图像的mparison可以视觉进行（ 如图3，突出一个代表性的高结合性聚合物和三个示例低结合性聚合物）。这样的比较，同时提供比统计分析少的信息，可以是计算出的强度值的有用的视觉验证。

使用微阵列鉴定22适当的聚合物，扩大进行了实验用于涂覆大表面时，以确认其细菌排斥性。显示的是表现最好的例子，用于涂层的玻璃盖玻片（用扫描电镜分析（ 图4和图 5））和导管片（共聚焦显微镜（ 图6）和SEM分析（ 图7））。这两种显微方法具有允许在表面上的直接细胞计数，提供明确的数据的好处;减少细胞附着是容易visibl即其中最好保持在按比例放大的驱避性能，以及作为适合于大规模的涂布技术的那些涂层，进行进一步的研究。所示结果表明，从每个阶段表现最好的聚合物。

图 1: 通过聚合物微阵列生物医学应用参与细菌斥聚合物的鉴定步骤 SEM =扫描电子显微镜。

图 2: 细菌在一系列的聚合物，通过微阵列分析测定的结合低细菌结合被认为在许多聚丙烯酸酯/丙烯酰胺（PA）和聚氨酯（PU）的。从聚合物微阵列探测的结果与一些细菌小号 pecies（ 空肠弯曲杆菌 ， 艰难梭菌 ， 产气荚膜梭菌 ， 变形链球菌和两个财团; BacMix-1和BacMix-2）被示出。细菌结合表示为背景校正的平均DAPI荧光强度（归一化）。误差棒代表标准偏差。从参考⁶改编。 请点击此处查看该图的放大版本。

图 3:BacMix-2的聚合物点的实施例的图像荧光吲哚（DAPI）和明显微镜图像示出了有代表性的聚合物细菌附着。一个强结合聚合物是包括比较几个非结合性聚合物（PU-20，PA-336和PU-179）。比例尺= 100微米。从参考⁶改编。://www.jove.com/files/ftp_upload/54382/54382fig3large.jpg"目标="_空白">点击此处查看该图的放大版本。

图4: 规模化的实验用玻璃盖片的SEM图像显示在无涂层的玻璃及玻璃涂有"重灾区"聚合物（从表1中挑选的例子）细菌附着。比例尺= 20微米。

图 5: 细菌结合由细胞计数从SEM图像量化每涂覆有最好的"击中"聚合物表面的单位面积附着的细胞的比较。琼脂糖用作对照"非约束'的表面上，玻璃作为对照结合表面。误差棒表示标准偏差。

图6: 光面铜版纸和胶版导管片细菌结合的比较比较孵育后未经处理的导管（导管-1）（A）和导管涂上PA13（B）与BacMix-2共聚焦图像。用40X的目标（比例尺= 20微米）拍摄的图像。从参考⁶改编。

图 7: 细菌结合对涂覆和未涂覆导管切片比较 SEM图像显示孵育后涂覆有PA13（B）的用细菌鸡尾酒组成BacMix-2的未经处理的导管（导管-1）（A）和导管的比较量表。酒吧= 101，M。从参考⁶改编。

聚合物	单体1	单体2	单体3	单体的比率
PA465	MEMA	DEAEMA	HEA	8	1	1
PA475	MEMA	DEAEA	HEMA	6	1	3
PA513	MEMA	DEAEMA	MMA	8	1	1
PA515	MEMA	DEAEA	MMA	6	1	3
PA13		DMAA	-	9	1	-
PU1	PEG2000	HDI	-	4.9	5.2	-
PU16	PEG2000	MDI	-	4.9	5.2	-
PU161	PEG2000	MDI	BD	2.5	5.2	2.3
PU7	PEG900	BICH	-	4.9	5.2	-
PU83	PEG900	HMDI	BD	2.5	5.2	2.3
PU227	PPG-PEG-1900	HDI	-	4.9	5.2	-
PU129	PPG425	BICH	DMAPD	2.5	5.2	2.3
PU10	PTMG2000	BICH	-	4.9	5.2	-
PU179	PTMG2000	HDI	NMAPD	2.5	5.2	2.3
PU20	PTMG2000	MDI	-	4.9	5.2	-
PU5	PTMG2000	HDI	-	4.9	5.2	-

表1: 细菌的组成非约束在图2中"命中"的聚合物。

讨论

细菌附着到一个表面是由依赖于细菌种类广泛的因素决定的一个复杂的过程，从表面上看，周围介质和物理环境的属性。虽然某些化学基团是已知的影响细菌的结合（聚乙二醇，例如，典型地抗蚀附件^11），关联的聚合物与它们的化学结构的生物影响是困难的，使聚合物的合理设计为具有挑战性的特定功能。在没有详细的附件机制，其他研究都试图模仿天然驱蚊表面，具有长期和广泛的优化处理^21。这里介绍的小型化高通量方法克服了便利数百聚合物的平行筛选，以确定进一步研究的线索这些挑战。

从微阵列方法结果主要用于IDEntify有可能导致的候选者。 图2示出22名候选人与低结合的至少一个品种，而图3说明了在结合能力的明显减少。在图2中所示的全部22个低结合性聚合物被带到正向成比例增加的实验中，在此期间，最好（以排斥和涂层性质方面）被确定为PU83，PA13，和PA515（ 图4和5）。聚丙烯酸酯提供在聚合方法方面具有更大的灵活性，因此将结合最低聚丙烯酸酯，PA13，被选定为导管涂层的研究（ 图6和7）。对其他候选人更详细的进一步开展这项工作，并已在别处⁶日报道。

通过一些实验性的迭代，我们发现了一些小的步骤是成功的关键和可重复性。以及促进的粘附聚合物的玻璃载玻片，使用琼脂糖下涂层提供了一个干净的背景，如琼脂糖是细菌定植高度抵抗性。同样在聚合物中的一致性掩护本身，都在同一阵列中与阵列之间，是至关重要的，因此，阵列的打印，必须仔细控制。需要在打印头销与384孔板中也均匀填充仔细调整，以确保均匀的斑点。如一些我们所使用的聚合物的表现出一定程度的自体荧光的，取背景荧光数据对每个幻灯片之前孵育细菌是至关重要的。为了说明变化和取得的芯片强大的数据重复建议。

吲哚（DAPI）此处所用的染色剂具有用于细菌种类，结合非特异性DNA的无选择性。因此，一旦细菌培养被引入污染物可能会被忽视，混淆了interpre良好的无菌技术是必不可少的结果的塔季翁。同样是使用扫描电子显微镜，它是仅能够区分杆和球菌但不属或种以后的实验事实。

基因芯片筛选后，有前途的聚合物应选择进一步验证。在这里介绍的实施例中，感兴趣7聚合物进行可以通过明显减少在荧光确定在微阵列和它们附着的抑制通过在较大的表面上涂敷他们证实。 图4和5示出在上玻璃盖玻片上，一个结合所取得的还原实用装置来测试聚合物作为散装涂料，而不是作为微阵列点的行为。随后，这些聚合物被涂覆在医疗器械的完全量化在细菌附着减少。重要的是，该溶剂选择（见协议部分8），用于这些涂料的研究是良性到所需的基板（在此，导管），同时保留ING溶解感兴趣的聚合物，以便允许涂层的能力。这里，我们用丙酮其中，以及属性所提到的，具有低的沸点，并迅速蒸发，留下一个均匀的涂层。

正在研究的选择将取决于具体应用的验证的装置。正如电子和荧光显微镜细胞观察允许单个细胞附着的直接量化，我们选择了这些技术作为补充大量染色芯片分析。结果示于图6和7，其展示的免费验证方法的重要性。 图6中的共焦图象提供各个单元的非常清晰的图像，而扫描电镜具有允许该聚合物，这是这里平滑和均匀的表面的评估的附加益处。这些方法是由视所使用的显微镜​​的领域的限制，因此，它是性重要NT采取一系列快照有结果的可信度。上述方法不能定量细菌粘附在整个表面上，只有从多个小区域的推断覆盖。我们相信，这是足以为所描述的应用程序。减少细菌的结合可以通过使用其他地方²²所描述的方法，整个涂层和非涂层的导管件列举表面细菌附着进行评估。然而，这样的方法需要筛选有均匀的表面面积，这是困难的，当分析用的医疗器械，这往往具有复杂的几何形状进行保持生物材料的表面。

显然，用于临床使用的任何设备都必须经过大量的进一步的测试，以确保在人类中的安全性和有效性。这里介绍的方法代表此过程和进一步的工作的开始必须包括在体内活性的确认。在这种情况下，学习静脉Çatheters，初始工作可以调查血液成分和全细胞与聚合物的结合。对细菌结合的血液成分的效果，也应考虑，可能通过在灭活血清或解fibrinated血液²³的存在重复结合测定。该技术的明确的测试将在体内模型中，诸如皮下植入感染模型^24。

我们表现​​出表面改变聚合物的筛分聚合物微阵列的方法的潜力。这种聚合物（包括抵制和促进细菌的结合）有医药，食品行业和生物技术应用了大量的，这意味着这种方法可能会在研究许多领域是有用的。虽然工作在这里使用的细菌中，该方法可以适用于其他类型的细胞，同样其它化学微阵列。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
琼脂糖	Sigma	05066
硅烷制备玻片	Sigma	S4651
聚合物	内部合成	不适用
NMP	Sigma	494496
LB 肉汤	Oxoid	CM1018
DAPIThermo Fisher	D1306
四氢呋喃	Sigma	401757
（3-氨丙基） 三乙氧基硅烷涂层载玻片	Sigma	硅烷制备
甲胂酸盐缓冲液	Sigma	97068
导管 1	Arrow International	CS12123E
导管 2	Baxter Healthcare	ECS1320
四氧化锇	Sigma	201030
设备
接触式打印机	Genetix	Qarraymini
微阵列芯片显微镜	IMSTAR	Pathfinder
旋涂机	Speedline Technologies	6708D
共聚焦显微镜	Leica	SP5
图像分析软件	Media Cybernetics	Image-Pro Plus
扫描电子显微镜	Philips	XL30CP
溅射镀膜机	Bal-Tec	SCD050