本机配合物的净化对结构研究使用串联亲和标签法

Summary

串联亲和纯化 （TAP） 方法已广泛用于从细胞提取物（主要是真核生物）中分离天然复合物，用于蛋白质组学。在这里，我们提出了一种针对纯化天然复合物进行结构研究而优化的 TAP 方法方案。

Abstract

亲和纯化的方法已经成功地分离出原生复合蛋白质组学表征。结构的异质性和一定程度的复杂的成分异质性通常不妨碍进行这种研究的进展。与此相反，用于结构表征的复合应是既在组成和结构上均匀的，以及在比所需的蛋白质组学更高浓度的状态下进行纯化。最近，一直在电子显微镜的应用的大型大分子复合物结构的决心显著的进步。这加剧了利益的方法通过电子显微镜净化足够数量和质量结构测定天然复合物。串联亲和纯化（TAP）的方法进行了优化，提取和纯化的18亚基，从〜芽殖酵母0.8丙二醛核蛋白组件（ 酿酒酵母）

Introduction

许多主要的细胞过程是由大的蛋白质和蛋白质-RNA复合物¹进行。一个显著瓶颈进行这种复合物的生物物理和结构研究是获得并在适当浓度的合适的质量（ 即 ，均匀性）它们。从天然来源隔离一个复杂的具有许多优点，包括护亚单位的相关转录后和/或翻译后修饰和投保适当的复杂的装配。然而，大蜂窝络合物以低拷贝数通常存在于细胞和纯化必须高效和近生理条件下发生，以确保复杂的完整性。来自真核来源纯化络合物是特别具有挑战性的，并且可以在经济上令人望而却步。因此，是有效率和产生均匀复杂的策略或方法是高度期望的。

这种策略已经成功地从净化真核细胞的天然复合物为他们的初步定性是串联亲和纯化（TAP）的方法^2,3。该方法TAP最初设计在复杂的纯化由芽殖酵母（ 酿酒酵母）天然蛋白与之交互因子^（S）2。该方法TAP利用了两个标签，串联融合到同一个蛋白质编码基因序列的每个标签。被选择的代码，以便平衡需要紧和选择性结合的亲和树脂，以保持接近生理溶液条件的愿望。这种平衡的作用是保持与净化后的特征相互作用的因子（S）标签蛋白的稳定的相互作用（S）。的基因组引入的TAP标记被放置在末端（C-末端）的蛋白质编码基因的和由一个序列编码的钙调蛋白结合肽（CBP），随后通过蛋白A的 - 加成刚刚超过20千道尔顿到标签蛋白。 CBP短，26个氨基酸，并通过识别的〜17 kDa蛋白钙调素在钙的存在下用K _的D 10....

Protocol

注意:下面的协议被设计为一个复杂的纯化从4升细胞培养物，细胞的大约40克湿重。一旦制备，所有缓冲区应储存在4℃并且在一个月它们的制备中使用。还原剂和蛋白酶抑制剂仅加入缓冲液在使用前。

1.全细胞提取的制备串联亲和纯化

1. S.生长酵母细胞
   1. 连胜所需的TAP标记S.酵母菌株从存储器（-80°C）到酵母蛋白胨葡萄糖（YPD）板。孵育3 - 5天（30°C），直到酵母细胞出现白色蓬松。
   2. 接种约2mm从板的新鲜细胞的²条纹到10ml的YPD培养基的50ml锥形聚丙烯离心管中。摇动该管以每分钟180转（rpm）过夜（30米℃）。
   3. 接种将2ml超过每升YPD媒体的夜间文化在2升锥形或锥形瓶中。摇匀，以180rpm（30°C）。监测在600nm（OD _600）的光密度的细胞生长，直至晚对数期，1.8的OD ₆₀₀为2时，典型地为20 - 24小时。
2. 收获S.酵母细胞
   1. 收获细胞，离心5,400×g离心15分钟（4℃）。
   2. 迅速倒出上清液，并保持细胞在4℃或冰上。
   3. 暂停用2ml冷却裂解缓冲液每升细胞沉淀（10毫摩尔Tris-HCL，pH8.0中; 300mM NaCl的1....

Results

使用了改良的方法TAP从S.净化酵母 U1的核蛋白，18亚基核糖核蛋白复合体。公布的协议^2,3以下复杂的初始的TAP纯化，得到一个复合物，出现异类，迁移作为银三个频带染色天然聚丙烯酰胺凝胶（ 图2A）。在TAP方法的优化的多轮，产生了迁移，主要是一个单波段上指示更均匀组件（ 图2A）的天然凝胶的配合物。用荧光染料染色为蛋白质和核酸，它建立了纯化的复杂既有生物聚合物存在（ 图2B）。

纯化的复合物还通过SDS-PAGE和使用TAP标记抗体（ 图3A）Western印迹进行分析。与那提一致已经凝胶结果，根据已发布的协议纯化复杂表现出的TAP的蛋白水解标签蛋白（Snu71）。蛋白水解的量，然而，显著与TAP方法的修饰减少。几乎所有在U1的核蛋白复合十七蛋白质通过SDS.......

Discussion

该TAP方法利用两个标签来平衡需要严格和选择性的结合到亲和树脂保持接近生理溶液条件的愿望。这种平衡的作用是保持与净化后的特征相互作用的因子（S）标签蛋白的稳定的相互作用（S）。此外，个别的TAP标记的ORFs可从商业来源，这样就可以得到具有为任何酵母复杂的标签化蛋白质的任何酵母菌株。保留的复合物的完整性和资源，以测试在用于纯化的复杂使用不同标记的蛋白质亚基的可用性两个优点用于利用用于纯化天然复合物的TAP方法。但是，原始的TAP方法协议不设计成确保复杂的纯化是在组成和结构上是均匀的。因此在TAP方法已被修改，如上文详细描述的，为实现这一目标。

各个在TAP方法步骤进行了评估，以确定最佳的方法和条件，净化的组成和结构的均匀复杂。一个早期的关键步骤是细胞裂解。此步骤需要较高的收率，从而最大裂解人的愿望之间的平衡，同时确保所获得的复合物是高品质的， 即 ，是均匀的。不同的方法来裂解酵母细胞进行了探讨，包括使用珠打浆机，高剪切流体处理器，和球磨机。更便宜的咖啡研磨机的使用比其他方法的效率较低（40 - 60％的裂解），但复杂的分离和纯化出现单分散而几个这些方法似乎任扰.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
酿酒酵母 TAP 标记菌株	Open Biosystems	YSC1177	这是用于开发 TAP 方案的主要酵母菌株。其背景是 S288C：ATCC 201388：MATa、his3Δ1、leu2Δ0， met15Δ0， ura3Δ0， SNU71：：TAP：：HIS3MX6
咖啡研磨机	Mr. Coffee	IDS77	用于细胞裂解
血细胞计数器， Bright Line	Hausser Scientific	3120	用于评估细胞裂解
JA 9.100 离心机转子	贝克曼库尔特公司		用于收获酵母细胞
JA 20 固定角离心机转子	Beckman Coulter， Inc.		用于清除不溶性细胞物质的细胞提取物
Ti 60 固定角离心机转子	Beckman Coulter， Inc.		用于进一步清除可溶性细胞提取物
Thermomixer	Eppendorf	R5355	温控摇床
Novex 凝胶系统	Thermo Fisher Scientific
IgG 填料	GE Healthcare	17-0969-01	琼脂糖凝胶 6 快速流速
钙调蛋白填料	Agilent Technologies， Inc.	214303	亲和树脂
蛋白酶抑制剂混合物，迷你片	Sigma Aldrich	589297	迷你 cOmplete ultra 不含EDTA的片剂
蛋白酶抑制剂混合物，大片	Sigma Aldrich	5892953	cOmplete ultra 不含EDTA的片剂
苯基甲烷磺酰氟（PMSF）			溶于异丙醇
2 ml Bio-spin柱	Bio-Rad实验室公司	7326008	用于填充和清洗钙调蛋白树脂
10 ml 多余制备柱	Bio-Rad Laboratories， Inc.	7311550	用于填充和洗涤 IgG 树脂
预制天然 PAGE Bis-Tris 凝胶	Life Technologies	BN1002	Novex NativePAGE Bis-Tris 4 - 16% 预制聚丙烯酰胺凝胶
NativeMark 蛋白质标准品	Thermo Fisher Scientific	LC0725	用于天然 PAGE 的未染色蛋白质标准品。加载 7.5 μl 为银染凝胶和 5 μl 用于 SYPRO Ruby 染色凝胶
预制 SDS PAGE Bis-Tris 凝胶	Life Technologies	NP0321	Novex Nu-PAGE Bis-Tris 4 - 12% 预制聚丙烯酰胺凝胶
PageRuler 蛋白质标准品	Thermo Fisher Scientific	26614	用于蛋白质印迹的未染色蛋白质标准品
SDS 运行缓冲液	Life Technologies	NP0001	1x NuPAGE MOPS SDS 缓冲液
TAP 抗体	Thermo Fisher Scientific	CAB1001	抗 CBP 标签的一抗
二抗	Thermo Fisher Scientific	31341	山羊抗兔碱性磷酸酶偶联
BCIP/NBT	Thermo Fisher Scientific	34042	5-溴-4-氯-3-吲哚基磷酸/硝基蓝四唑
透析装置	Thermo Fisher Scientific	88401	Slide-A-Lyzer 微型透析装置
离心过滤装置，100kDa MWCO	EMD Millipore	UFC5100008	Amicon Ultra-0.5 离心过滤装置，带 Ultracel-100 膜
洗涤剂吸收珠	Bio-Rad Laboratories， Inc.	1523920	Bio-bead SM-2 吸收剂
SYBR Green II	Thermo Fisher Scientific	S-7564	用于核酸染色的荧光染料，当存在 SYPRO Ruby 进行检测时，使用 488 nm 的激发波长和 532 nm 的发射波长
SYPRO Ruby	Molecular Probes	S-12000	用于蛋白质染色的荧光染料，当使用 SYBR Green II 进行检测时，使用 457 nm 的激发波长和 670 nm 的发射波长
铜网格	电子显微镜科学	G400-CP