方法文章

流式分选与经典霍奇金淋巴瘤中里-施细胞的外显子组测序

DOI：

10.3791/54399

⸱

2017年6月10日

 ,  ,  ,  ,  , 
1Innovation Laboratory, Center for Molecular Oncology, Memorial Sloan Kettering Cancer Center, 2Flow-Sorting Core Facility, Weill Cornell Medical College, 3Department of Laboratory Medicine, University of Washington, 4Department of Physiology and Biophysics, Institute for Computational Biomedicine, Weill Cornell Medical College, 5Department of Pathology and Laboratory Medicine, Weill Cornell Medical College, 6Department of Laboratory Medicine, Memorial Sloan Kettering Cancer Center

本文内容

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

本文介绍了一种结合流式细胞分选与低起始量下一代测序文库构建的实验方案，旨在从经典型霍奇金淋巴瘤（CHL）的霍奇金-里德-斯特恩伯格（HRS）细胞中获得高质量的全外显子组数据。

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

经典霍奇金淋巴瘤中的霍奇金-里德-斯特恩伯格细胞（Hodgkin Reed-Sternberg cells）稀疏分布于炎性淋巴细胞背景中，通常仅占肿瘤质量的不到1%。来源于整体肿瘤的材料中肿瘤含量浓度不足，难以进行有效表征。因此，本文介绍了一种利用八种抗体以及侧向散射和前向散射进行荧光激活细胞分选的方法，可快速分离并高纯度富集数千个HRS细胞用于后续研究。同时，由于外显子组测序的标准流程通常需要100–1,000 ng的输入DNA，这一要求即使经过流式分选仍常过高，我们还提供了一种优化的低输入量文库构建方案，仅需低至10 ng的输入DNA即可生成高质量数据。该组合方法可生成适用于全外显子捕获探针或更聚焦的靶向面板的下一代测序文库。将HRS细胞与肿瘤内健康的T细胞或B细胞进行比较，开展外显子组测序可识别体细胞变异，包括突变、插入与缺失以及拷贝数变异。这些发现有助于阐明HRS细胞的分子生物学机制，并可能揭示靶向药物治疗的新途径。

引言

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

由于下一代测序技术的发展，癌症基因组学取得了显著进展，从而在多种血液系统及非血液系统肿瘤的治疗靶点识别和预后判断方面实现了重大突破。基于特定基因组改变的新型个体化治疗策略正在多种肿瘤类型中迅速涌现（参见文献综述1,2）。尽管淋巴瘤基因组学已取得显著进展，经典型霍奇金淋巴瘤（CHL）中肿瘤性HRS细胞的基因组仍研究较少。由于肿瘤性HRS细胞存在于反应性微环境中且数量稀少，难以分离出纯化的HRS细胞群体，这限制了相关研究的开展3。

从原发性肿瘤中分离活体HRS细胞的方法由Fromm 等4,5,6建立。该方法采用包含CD30、CD15、CD40、CD95、CD45、CD20、CD5和CD64的八种抗体混合物，明确鉴定经典霍奇金淋巴瘤（CHL）肿瘤悬液中的HRS细胞。利用该技术，我们能够从新鲜或冷冻的肿瘤活检细胞悬液中分离出至少1,000个活体HRS细胞，这些悬液至少含有107个细胞（约10 mg组织）。流式细胞术分析显示纯度超过90%，在连续10例病例的外显子组基因组分析中估计纯度至少为80%。

我们改进了一种流式细胞术细胞分离技术，显著简化了操作流程，能够快速从原发性经典霍奇金淋巴瘤（CHL）肿瘤中分离出数千个有活力的HRS细胞7。我们已利用该技术获得了据信是首例原发性霍奇金淋巴瘤肿瘤细胞的全外显子组序列。我们的研究证明了对单个CHL病例进行高通量、全基因组分析的可行性，并已成功鉴定出一些新的基因组改变，有望揭示CHL发病机制的某些方面。

我们进一步开发了一条流程，用于将提取的DNA应用于高通量基因组研究。为了从仅1,000个分选获得的HRS细胞（连续病例中所能获得的最低数量）中获得可靠结果，我们进一步优化了下一代DNA文库构建流程8，从而提高了接头连接效率，并能够在无需过度扩增的情况下生成DNA片段文库。该方法使得常规临床样本的分析成为可能，并可用于检测反复出现的突变及染色体改变7。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

方案

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. 组织处理与冷冻

  1. 在磷酸盐缓冲液（PBS）或罗斯韦尔帕克纪念研究所培养基（RPMI）中收集淋巴结组织，并在采集后24小时内进行处理。将切除的淋巴结组织9转移至含有10 mL RPMI（含2%胎牛血清，FCS）的培养皿中，用新的手术刀片将其切碎。使用10 mL注射器活塞的尾部进一步研磨/解离组织。
  2. 通过100 µm细胞滤网将液体转移至50 mL锥形管中。用额外的10 mL RPMI（含2% FCS）冲洗培养皿和滤网。
  3. 使用自动细胞计数仪或血细胞计数板进行细胞计数。
    注意：通常，约5 mm3的CHL淋巴结组织可获得至少2 × 107个细胞。预期细胞活力超过80%，但可能因样本而异。
  4. 在400 × g条件下离心10分钟，吸除上清液。将含有细胞沉淀的离心管置于冰上。
  5. 将冻存液预先冰浴冷却。将细胞重悬于预冷的冻存液中，浓度为2 × 107/mL，通过移液混匀。切勿涡旋震荡。将细胞悬液在冰上孵育10分钟。
  6. 将样本以1 mL/冻存管分装（冻存管预先在冰上预冷）。将冻存管转移至-80 °C冰箱中保存1-2天，随后转移至液氮中长期保存。

2. 细胞分选用细胞悬液的制备

注意：每批抗体必须使用 1000 万细胞，在 300- µΛ 的染色体积中进行适当的滴定。除 CD30 外，所有抗体均可使用外周血；对于 CD30，可将 KMH2 细胞系加入外周血中用于滴定10。我们通常从生产商推荐的抗体体积开始，对每批抗体进行两次两倍稀释和一次两倍增加（共四个数据点）的滴定。例如，如果生产商推荐使用 10 µL 体积，则我们分别使用 2、5、10 和 20 µL 的体积进行滴定。

  1. 将水浴锅设定为 37 °C. 在避光玻璃瓶中预先混合滴定浓度的抗体，并加入 PBS + 2% BSA，使总体积达到指定的抗体混合液体积 100 µL.
    注意：尽管我们建议对抗体进行滴定，但以下体积可作为起始点：CD64， 20 µLCD95， 5 µLCD30， 20 µLCD5， 10 µLCD20 10 µLCD15, 20 µL；CD40， 5 µL；以及 CD45， 10 µL.
  2. 将冻存管从液氮中转移至含有干冰的冰桶中，以防止解冻。预先温育50 mL解冻培养基，其中含有RPMI/20% FCS/DNase100 µg/mL) 置于50 mL锥形管中 37 °C 水浴锅
  3. 将45 mL解冻培养基转移至一个新的离心管中，并保持在 37 °C. 通过手握冻存管在37°C水浴中快速解冻细胞 37 °C 水浴，直至仅剩极小部分仍处于冷冻状态。
  4. 将冻存管中的内容物倒入含有45 mL解冻培养基的离心管中。用1 mL解冻培养基将空的冻存管冲洗2次，并将冲洗液合并。
  5. 室温孵育细胞15分钟，以使DNase充分消化并让细胞重新平衡。500 × g离心10分钟，吸除上清液。
  6. 将细胞重悬于约 200 µL 保留的解冻培养基（5 mL）置于室温平衡2-3分钟。复苏的 >预计70%的冻存活细胞。
    注意：可选地，为了获得更高纯度的经附着T细胞形成玫瑰花环的HRS细胞，可在该步骤加入无标记抗体混合物（参见可选方案）。
  7. 添加 100 µL 加入抗体混合液，在室温（RT）避光孵育15分钟。加入3 mL分选培养基，以500 × g离心10分钟，弃去上清液。
  8. 用 1 mL 分选培养基重悬细胞，并转移至 5 mL 流式管上层滤网。
  9. 用额外的1 mL分选培养基冲洗50 mL锥形管和细胞滤网，并将细胞置于冰上。

3. （可选方案）T细胞花环阻断

注意：在组织切片和细胞悬液中，HRS 细胞周围常被 T 细胞呈花环状包绕，这些 T 细胞可能污染分选后的 HRS 细胞组分。这种相互作用由 HRS 细胞上的 CD54 和 CD58 与 T 细胞上的 LFA-1 和 CD2 结合所介导4,11。可通过未标记的针对这些黏附分子的抗体阻断上述相互作用。

  1. 取 100,000 至 500,000 个细胞，加入 100 µL RPMI 培养基中。
  2. 将细胞悬液与未标记的抗 CD2、CD54、CD58 和 LFA-1 抗体（各 10 µL）在冰上孵育 1 小时。此后，细胞悬液即可用荧光标记抗体进行标记。

4. 使用细胞分选进行HRS-、B-和T-细胞的分离

注意：尽管我们使用了配备5个激光器的特殊科研用分选仪（参见材料清单），但任何能够检测抗体组合中所用荧光染料的分选仪均适用。以下步骤的操作需要熟悉软件12功能，并具备细胞分选仪操作的基本知识。详细操作说明请参考在线软件手册。

  1. 流式细胞仪设置：
    1. 打开计算机并登录。开启生物安全柜（BSC）及其电源插座，然后开启流式细胞仪。等待至少 90 秒，使仪器内部 CPU 启动完成，随后打开激光控制软件，确认所有激光均已开启。启动流式细胞仪软件13并登录。
    2. 在流式细胞仪软件中，点击“细胞仪 → 查看配置”。当配置子程序的对话框打开后，选中 130-µm 自定义配置，点击“设置配置”和“确定”，然后退出配置子程序。
    3. 观察流式细胞仪软件中的对话框，点击“使用 CS&T 设置”。将 130-µm 喷嘴安装至仪器中，并通过点击流束窗口中的红色“X”按钮开启流束。让仪器预热至少 30 分钟。
    4. 使用选定方法对仪器进行性能检测（此处描述的分选仪配备有性能追踪软件模块，参见软件手册第 117–122 页及参考标准（参见材料表中本设置所用的标准）。
      1. 点击“细胞仪 → CST”，确保下拉菜单中的“Characterize”字段设置为“Check Performance”，然后点击“运行”。当软件提示时，将一管参考微粒加载到样品台，然后点击“确定”。
      2. 运行完成后，点击“完成”并关闭该软件模块。待流式细胞仪软件重新连接至仪器后，点击弹出对话框中的“使用 CS&T 设置”。
    5. 使用流式细胞仪软件的自动落滴延迟功能确定正确的落滴延迟时间（参见软件手册第 154–161 页）。
      1. 在流式细胞仪软件的“浏览器”窗口中打开“落滴延迟”实验，将一管校准微粒安装至样品台，点击“采集仪表板”窗口中的“加载”。通过点击“流束”窗口中的“Sweet Spot”按钮开启自动流束监测功能，并在后续所有步骤中保持该功能开启。
      2. 通过点击侧流窗口中的“电压”按钮开启偏转板电压，然后点击紧邻“电压”按钮的“测试分选”按钮开启测试分选。
      3. 将所有侧流设置调整为零，仅保留左侧侧流。调节左侧侧流设置，使侧流窗口中可见两个流束斑点。点击“光学滤镜”按钮，确认左侧侧流斑点将落入侧流窗口黑色区域中出现的左侧方框内。
      4. 如有需要，调整左侧侧流设置。再次点击“测试分选”按钮以关闭测试分选。在“浏览器”窗口中，点击“+”展开“落滴延迟”实验中的“全局工作表”元素。
      5. 双击“分选布局_001”以打开分选布局，通过目视检查确认左侧分选群体已分配为“P1”，然后在“分选布局”窗口中点击“分选”，接着点击“自动延迟”，再点击“运行”。
      6. 运行完成后，点击“退出”。将一管无菌去离子水安装至样品台，点击“采集仪表板”窗口中的“加载”，运行该管水至少 5 分钟，以清除仪器中残留的测试微粒，然后继续下一步操作。
    6. 运行补偿对照（使用材料表中提供的补偿微球或等效产品），利用分选仪软件内置的补偿设置功能（详见软件手册第 131–137 页）。
      1. 点击“实验 → 新建实验”创建新实验。在“仪器状态”窗口的“参数”选项卡中，删除未使用的参数（如有）。点击“实验 → 补偿设置 → 创建补偿对照”。
      2. 在“浏览器”窗口中，点击“+”号展开“补偿对照”样本。运行补偿对照管但不记录数据，如有必要，在“仪器状态”窗口的“参数”选项卡中调整检测器电压，使每种荧光染料的阳性微球群体位于通道 10,000 至 100,000 之间，并在其主要检测通道中亮度最高。
      3. 记录每根管所需各参数的电压值。在“补偿对照”样本下，单击左键选中“未染色对照”管。将未染色对照管加载至样品台，点击“采集控制”窗口中的“加载”。
      4. 手动将已确定的电压值填入所有参数的检测器电压字段中，然后点击“采集控制”窗口中的“记录”。运行其余所有补偿对照，记录数据但不更改任何检测器设置。安装一管无菌去离子水运行至少 5 分钟，以清除仪器中残留物质，然后继续下一步操作。
  2. HRS 细胞设门：
    1. 在调整流速至每秒采集 3,000–4,000 个事件的同时（参见步骤 4.1），采集并记录至少 100,000 个事件以进行初步设门。
      注意：若细胞浓度过高，可能需要额外添加分选培养基以稀释细胞。停止采集。
    2. 按照图 1中所述步骤对 HRS 细胞进行设门。
      注意：在大多数 CHL 病例中，HRS 细胞约占细胞总数的 0.01% 至 0.1%。
  3. B 细胞和 T 细胞设门：
    1. 通过 CD20 和 CD5 的设门分别识别体细胞对照（B 细胞和 T 细胞）（通过 CD45/SSH 设门淋巴细胞），然后进行 CD20 与 CD5 的联合设门（参见图 1）。
    2. 将目标收集流束导向预冷的两管位或四管位收集架中的收集管。在流式管或 15-mL 离心管中至少加入一半体积的收集培养基。
    3. 根据厂商说明，在分选设置中将 HRS 细胞和对照群体分配至相应的收集管。重新启动细胞采集并开始分选。
    4. 收集所有 HRS 细胞以及最多 100 万 B 细胞和 T 细胞。将收集流束导向预冷的四管位（或两管位）收集架中的收集管。

5. DNA 提取

  1. 将细胞在1.5 mL锥形管中以3,000 × g离心10分钟收集沉淀，弃上清，加入1 mL PBS重悬细胞以洗涤。
  2. 再次于3,000 x g离心10分钟，弃上清液；注意勿扰动微量沉淀。
  3. 添加 150 µL 加入裂解缓冲液（或根据所用试剂盒推荐的适当体积）至洗涤后的细胞中，并通过反复吹打混匀。
    注意：可将细胞裂解液在 -70 °C 如有需要，可在此时进行。
  4. 将过滤柱放入管中构建柱式装置，加入5.5步骤所得裂解液。以13,000 x g离心3分钟。
  5. 取出离心柱并弃去收集管中的液体，然后将离心柱放回收集管中。
  6. 添加 650 µL 向每个套件加入柱洗涤液。在13,000 x g下离心1分钟。弃去收集管中的液体。重复此步骤，共洗涤4次。
  7. 弃去收集管中的液体，重新组装微型离心柱装置。在13,000 × g离心2分钟，以干燥结合基质。
  8. 将微型柱转移至新的1.5 mL离心管中，并加入 25 µL 10 mM Tris-Cl（推荐用于后续超声处理步骤）或加热至指定温度的无核酸酶水 65 °C室温孵育2分钟，然后以13,000 × g离心1分钟。重复一次 25 µL 共计 50 µL.
  9. 通过移液器反复吹吸混匀DNA洗脱液，并使用荧光测定法进行定量14.

6. 文库构建

  1. 开始前的准备工作：
    1. 将超声波破碎仪设置为水位 12，强度 5，每周期脉冲次数 200，温度 7。
    2. 根据荧光测定法确定的可用DNA数量以及实验设计，确定用于文库构建的DNA用量。
      注意：需谨记，若使用的 DNA 量过少而导致文库质量下降，则可能无足够材料可用于后续验证。对于输入量不足的情况，输入质量越大，所获得的测序文库复杂性越高。本方案的一些参考建议如下：10 ng 可获得较好的结果，50 ng 可视为大致的上限。
    3. 根据以下数值大致确定接头与插入片段的摩尔比： 表1.
    4. 以下列方式计算所需接头的用量：
      注意：DNA 输入的摩尔数， n
          i. n = 1.54e-12-12 输入质量（单位为 ng）/（平均片段大小）
          ii. 当平均片段长度为 200 bp 时，可简化为：
      n = 7.7e-15 × 输入质量（单位：ng）
      需加入的接头分子摩尔数 a
          i. a = n * r
      接头连接步骤中使用的接头储存液的体积， v
          i. v（在 µL ) = a /[10-12 * 接头储存液浓度（在 µM )]
      注意：如果接头浓度较低，为确保包含所需的接头用量，可使用接头溶液代替水稀释末端修复试剂。
      示例：对于100 ng输入DNA，平均片段大小为200 bp，期望的摩尔接头：插入片段比例为15:1，接头储备液浓度为 2 µM，建议使用的接头体积为 5.8 µL.
    5. 为样本分配带索引的条形码。
      注意：将被合并用于杂交反应或测序仪流动池中同一泳道的文库，其索引序列不得存在任何重复。
  2. 文库构建——DNA剪切：
    1. 将要使用的全部DNA量加入到一个超声剪切管中。如果仅含投入DNA的样品体积不足 50 µL，加入 Buffer EB 至一个 50 µL 总体积并混匀。
    2. 超声处理30秒。
    3. 取出离心管，在微型离心机中快速离心片刻，足以使微管管壁上部的液滴沉降至管底。
    4. 重复步骤 6.2.2–6.2.3，共进行七次 30 秒超声处理，累计超声时间为 210 秒。
      注意: 可尝试将210秒分为更少的时段进行实验。
  3. 文库构建——末端修复、加A尾和接头连接：
    注意：在文库PCR扩增步骤之前，避免进行任何片段大小选择。
    1. 遵循制造商的说明19 用于样本DNA超声处理后的末端修复和A尾添加。
    2. A-tailing 后，在反应中使用适当摩尔数的接头（按步骤 6.1.3 计算），将接头、A-tailed DNA 片段、酶和缓冲液混合，于 4°C 孵育过夜 20 °C 约16小时。
  4. 文库构建 - 文库扩增：
    1. 对连接接头反应产物进行磁珠纯化。将磁珠加入PCR产物后，室温静置5分钟。将离心管置于磁力架上，吸除上清液，用洗涤液洗涤两次 200 µL 用80%乙醇洗涤珠子，干燥足够长时间以去除大部分液体但避免过度干燥，然后通过移液将DNA从珠子上洗脱下来 25 µL 将建议量的无核酸酶水加入珠子中，同时保持离心管置于磁力架上。
      注意：可以尝试使用聚乙二醇保存珠子
      （PEG）直至扩增结束后再弃去，但此方法尚未经过测试。
    2. 包含 0.6 µL 每1,000稀释度的绿色染料 50 µL PCR预混液。或者，根据设备要求，使用适量的适合实时PCR的嵌合染料。
    3. 设置PCR反应程序 98 °C 45 秒用于初始变性，随后进行变性、退火和延伸循环 98 °C 15 秒， 60 °C 30 秒，以及 72 °C 30秒，或根据所用的其他聚合酶选择相应的程序。
      1. 将仪器设置为采集荧光数据 72 °C 每个循环。设置最终延伸步骤于 72 °C 1 分钟，随后在 4 °C 可无限期保存。使用补充表格中试剂扩增接头连接文库的PCR引物为：Oligo 1，AATGATACGGCGACCACCGAGA 和 Oligo 2，CAAGCAGAAGACGGCATACGAG
    4. 使用上述 PCR 条件扩增文库，同时通过 qPCR 软件实时监测荧光强度值，并在指数增长期结束前立即停止。
    5. 扩增后，使用回收扩增反应产物体积的0.8倍量进行常规磁珠纯化（参见步骤6.4.1），通常为0.8 × 50 = 40 µL 珠子。将珠子加入PCR产物中，在室温下静置5分钟。
    6. 将其置于磁力架上，吸去液体，用洗涤液清洗两次 200 µL 加入80%乙醇，将磁珠干燥至大部分液体挥发但不过度干燥，然后向干燥的磁珠中加入无核酸酶的水进行洗脱。
    7. 使用荧光测定法对所得DNA进行定量。通过片段大小分析文库片段；参见相关章节 数据质量控制要求 详情请见。

7. 外显子杂交

  1. 合并带有不同接头条形码的四个文库。
    注意：通过荧光测定法测定质量，通过凝胶电泳测定片段大小，用于计算各文库的摩尔浓度，然后按等摩尔量混合，使混合后文库的总质量为 1,000 ng。最好将所有肿瘤-正常样本配对保留在同一混合池中，而不是将它们分到不同的池中。
  2. 应用外显子捕获方案15，在捕获纯化后进行 8 个 PCR 循环。也可选择其他捕获目标。

8. 多重测序

  1. 在材料电子表格中引用的测序平台上，于单个通道内对包含四个多重文库的单次杂交捕获进行测序16。
    注意：对于希望进一步规划和优化目标测序深度覆盖范围的高级用户，可采用其他配置方案。

9. 分析（可根据需要替换为其他分析流程）

  1. 单核苷酸多态性（SNPs）和小型插入缺失（indels）
    1. 使用 Burrows-Wheeler Aligner (BWA) 将原始数据比对至人类参考基因组 UCSC hg1917 或选择其他算法。使用 Samtools 筛选或标记比对质量评分低于 20 的读段以及 PCR 重复序列18 或 Picard19.
    2. 使用 Strelka 检测 HRS 样本相对于T细胞体细胞对照中的体细胞核苷酸变异和小片段插入缺失20 或选择一种变异检测软件。应用 snpEff21 对 Strelka 输出结果进行注释。如有需要，可使用整合基因组浏览器（Integrated Genome Viewer, IGV）系统性地检查变异位点是否存在人工假象22,23.
  2. 拷贝数变异：
    1. 计算对数转换后的比值 "ltr" 对于每个外显子靶向区间 "i" 以以下方式对肿瘤样本与正常样本的库内标准化读段数进行比较：
      figure-protocol-1
      注意： c 是比对到特定捕获区间的读段数量， l 是文库的总大小， t 表示肿瘤，且 n 表示正常。
    2. 过滤掉覆盖度不足的区间（Ct+Cn < 100 次读取）用于进一步分析。使用 DNAcopy v.1.0 进行全区间片段化分析24 来自 R 中的 Bioconductor。
      注意：考虑均值绝对值的片段 ltr 低于0.5以视为拷贝数中性。其余片段若其均值符号为正，可被定义为拷贝数增加 ltr 为阳性（换句话说，经过标准化后，肿瘤样本中的读数显著多于正常样本），或拷贝数缺失，如果均值的符号为负 ltr 为阴性。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

结果

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

文库扩增及0.8x磁珠纯化后应进行生物分析仪检测。应观察到片段大小在目标范围内呈现“类正态”分布（图2a）。若曲线形态偏离此模式，例如出现明显的“肩峰”，则提示存在高分子量或低分子量的异常产物。例如，图2b-2d展示了含有明显异常产物的文库示例，此类文库原则上不应进行测序。若文库质量严重受损，且仍有DNA材料可用，可考虑重新构建文库，或重新进行细胞分选以重新开始实验。

在第一次 0.8x 磁珠纯化过程中，有时可能会残留接头二聚体。若发生此情况，在约 125 - 130 bp 处会出现一个尖锐的峰（见图 2c）。此时，建议再进行一次额外的 0.8x 磁珠纯化，并重复使用生物分析仪检测，以确保成功去除二聚体。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

讨论

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

掌握该技术后的未来应用或发展方向

本方法可用于含有至少 10 ng DNA 的样本进行外显子组测序。在临床背景下，由于材料不足，该限量排除了大多数细针穿刺样本，但包括足够的穿刺活检和切除活检样本。这将能够从更多可能的样本中获取数据。

方案中的关键步骤

适当的冷冻和解离技术对实验成功至关重要。应尽可能完全解离整个样本，包括纤维化区域。使用130 µm喷嘴进行细胞分选似乎对最大化获得大体积HRS细胞及DNA产量至关重要。尽管尚未开展使用多种喷嘴尺寸的严格对照实验，但与100 µm喷嘴相比，使用更大尺寸喷嘴时细胞得率显著提高；而使用85 µm喷嘴分选后，载玻片上几乎未检测到细胞（未发表观察结果）。

修改与故障排除

当用于文库构建的输入DNA质量少于100 ng时，应尽...

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

披露

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

本项目方法的开发由威尔康奈尔医学院病理学与实验室医学系资助。我们感谢三校联合计算生物学与医学培训项目提供的部分资金支持。我们衷心感谢与我们分享宝贵时间与专业知识的科学家们，特别是Maryke Appel、Dan Burgess、Iwanka Kozarewa、Chad Locklear，以及来自威尔康奈尔医学院基因组核心设施的所有成员，包括Jenny Zhang、Xiaobo (Shawn) Liang、Dong Xu、Wei Zhang、Huimin Shang、Tatiana Batson和Tuo Zhang。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
培养皿或细胞培养皿（无菌）
RPMI-1640 培养基罗斯威尔公园纪念研究所
胎牛血清（FCS，热灭活）
冻存液（RPMI，20% FCS，10% 二甲基亚砜（DMSO））——现配并保持无菌
含 2% FCS 的 RPMI（现配或可储存至 1 个月）
带新刀片的手术刀
10 mL 注射器（无针头）
冻存管
50 mL 圆锥形离心管，耐压
离心机可容纳 50 mL 圆锥形离心管，并提供 400g 离心力
HEPES 缓冲液（1 M，细胞培养级）
磷酸盐缓冲液（PBS）
Pluronic-F68Thermo-Fisher24040-032
DNase-ISigma-Aldrich, St. Louis, MOD4527-10KU建议以 5 mg/mL 溶于 RPMI 中，于 -200 °C 保存
牛血清白蛋白（BSA）
分选缓冲液（PBS + 2% BSA + 25 mM HEPES + Pluronic –F68（1x））
CD64-FITC（22）Beckman Coulter, Miami, FL建议起始体积为 20 μL；建议进行滴定
CD30-PE（BerH83）BD Biosciences, San Jose, CA建议起始体积为 20 μL；建议进行滴定
CD5-ECD（BL1a）Beckman Coulter, Miami, FL建议起始体积为 10 μL；建议进行滴定
CD40-PerCP-eFluor 710（1C10）Ebiosciences, San Diego, CA建议起始体积为 5 μL；建议进行滴定
CD20-PC7（B9E9）Beckman Coulter, Miami, FL建议起始体积为 10 μL；建议进行滴定
CD15-APC（HI98）BD Biosciences, San Jose, CA建议起始体积为 20 μL；建议进行滴定
CD45 APC-H7（2D1）BD Biosciences, San Jose, CA可替换为 CD45-Krome Orange（J.33, Beckman Coulter），建议体积为 10 μL；建议进行滴定
CD95-Pacific Blue（DX2）Life Technologies, Grand Island, NY建议起始体积为 5 μL；建议进行滴定
CD2（5 μg；克隆号 RPA-2.10）Biolegend, San Diego, CA用于可选方案；建议进行滴定
CD54（10 μg；克隆号 84H10）Serotec, Oxford, United Kingdom用于可选方案；建议进行滴定
CD58（10 μg；克隆号 TS2/9）eBioscience, San Diego, CA用于可选方案；建议进行滴定
LFA-1（12 μg；克隆号 MHM23）Novus Biologicals, Littleton, CO用于可选方案；建议进行滴定
BD CS&T 微球BD Biosciences, San Jose, CA
BD Accudrop 微球BD Biosciences, San Jose, CA
BC Versa Comp 抗体捕获微球Beckman Coulter, Miami, FL补偿微球
配备 5 个激光器的 BD-FACS ARIA 特殊研究订单仪器BD Biosciences, San Jose, CA任何具备检测抗体组合中荧光染料能力的 BD-FACS Aria 仪器均可满足要求
WizardPromegaA2360
10 mM Tris-Cl 缓冲液NA
Qubit dsDNA HS 检测试剂盒Life Technologies, Carlsbad, CA
S2 超声破碎仪Covaris, Woburn, MA可使用替代产品
microTUBECovaris, Woburn, MA
低通量文库制备试剂盒Kapa Biosystems, Wilmington, MAKK8221
Sybr GreenSigma-Aldrich, St. Louis, MOS9430
Agencourt AMPure XP 微球Beckman Coulter, Miami, FL
生物分析仪Agilent Technologies, Santa Clara, CA
SeqCap EZ 外显子 v.3.0Roche Nimblegen6465684001
HiSeqIllumina
TruSeq 风格通用接头Integrated DNA Technologies (IDT), Coralville, IowaHPLC 纯化；AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGAT*C*T
TruSeq 风格索引接头Integrated DNA Technologies (IDT), Coralville, IowaHPLC 纯化；/5Phos/GATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCACNNNNNNATCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG
TruSeq 风格 PCR 引物 1Integrated DNA Technologies (IDT), Coralville, IowaAATGATACGGCGACCACCGAGA
TruSeq 风格 PCR 引物 2Integrated DNA Technologies (IDT), Coralville, IowaCAAGCAGAAGACGGCATACGAG
无核酸酶双链缓冲液Integrated DNA Technologies (IDT), Coralville, Iowa
BD FACSDIVA 软件BD Biosciences, San Jose, CA
BD Falcon 管BD Biosciences, San Jose, CA
BD 流式管BD Biosciences, San Jose, CA

参考文献

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Abrams, J. National Cancer Institute's Precision Medicine Initiatives for the new National Clinical Trials Network. American Society of Clinical Oncology educational book / ASCO. American Society of Clinical Oncology. Meeting. , 71-76 (2014).
  2. Gagan, J., Van Allen, E. M. Next-generation sequencing to guide cancer therapy. Genome medicine. 7, 80(2015).
  3. Matsuki, E., Younes, A. Lymphomagenesis in Hodgkin lymphoma. Seminars in cancer biology. 34, 14-21 (2015).
  4. Fromm, J. R., Kussick, S. J., Wood, B. L. Identification and purification of classical Hodgkin cells from lymph nodes by flow cytometry and flow cytometric cell sorting. Am J Clin Pathol. 126 (5), 764-780 (2006).
  5. Fromm, J. R., Thomas, A., Wood, B. L. Flow cytometry can diagnose classical hodgkin lymphoma in lymph nodes with high sensitivity and specificity. Am J Clin Pathol. 131 (3), 322-332 (2009).
  6. Roshal, M., Wood, B. L., Fromm, J. R. Flow cytometric detection of the classical hodgkin lymphoma: clinical and research applications. Advances in hematology. 2011, 387034(2011).
  7. Reichel, J., et al. Flow sorting and exome sequencing reveal the oncogenome of primary Hodgkin and Reed-Sternberg cells. Blood. 125 (7), 1061-1072 (2015).
  8. Kozarewa, I. A Modified Method for Whole Exome Resequencing from Minimal Amounts of Starting DNA. PLoS ONE. 7 (3), e32617(2012).
  9. Brunicardi, F. C. Schwartz's Principles of Surgery. , 10th ed, McGraw-Hill Education / Medical. (2014).
  10. Kantor, A. B., Roederer, M. FACS analysis of leukocytes. Handbook of Experimental Immunology. 2, Blackwell Scientific. (1996).
  11. Sanders, M. E. Molecular pathways of adhesion in spontaneous rosetting of T-lymphocytes to the Hodgkin's cell line L428. Cancer Res. 48 (1), 37-40 (1988).
  12. Biosciences. FACSDiva Software v6.0. , Available from: http://www.bdbiosciences.com/in/instruments/software/facsdiva/resources/overview.jsp (2007).
  13. Biosciences. FACSAria II User's Guide. Part No. 644832, Revision A. , (2009).
  14. Life Technologies. Qubit 3.0 Fluorometer, Catalog Number Q33216. , Available from: https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/Q33216 (2017).
  15. Roche Nimblegen. SeqCap EZ Library SR User's Guide ver. 4.1. , (2013).
  16. Illumina. HiSeq High-Throughput Sequencing System. , Available from: http://www.illumina.com/systems/hiseq_2500_1500.html (2016).
  17. Li, H., Durbin, R. Fast and accurate short read alignment with Burrows-Wheeler transform. Bioinformatics. 25 (14), 1754-1760 (2009).
  18. Li, H. The Sequence Alignment/Map format and SAMtools. Bioinformatics. 25 (16), 2078-2079 (2009).
  19. The Broad Institute. Picard Tools. , Available from: http://broadinstitute.github.io/picard/ (2016).
  20. Saunders, C. T. Strelka: accurate somatic small-variant calling from sequenced tumor-normal sample pairs. Bioinformatics. 28 (14), 1811-1817 (2012).
  21. Cingolani, P., et al. A program for annotating and predicting the effects of single nucleotide polymorphisms, SnpEff: SNPs in the genome of Drosophila melanogaster strain w1118; iso-2; iso-3. Fly (Austin). 6 (2), 80-92 (2012).
  22. Dobin, A. STAR: ultrafast universal RNA-seq aligner. Bioinformatics. 29 (1), 15-21 (2013).
  23. Thorvaldsdottir, H., Robinson, J. T., Mesirov, J. P. Integrative Genomics Viewer (IGV): high-performance genomics data visualization and exploration. Briefings in bioinformatics. 14 (2), 178-192 (2013).
  24. DNA copy number data analysis. v.R package version 1.34.0. , Available from: https://omictools.com/dnacopy-tool (2013).

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

重印与许可

申请许可以重复使用本 JoVE 文章的文本或图表

申请许可

标签

DNA

相关文章