味觉是一种重要的感觉过程，有助于生物体趋向有益物质并回避有毒物质。本方案描述了一种简单的摄食检测方法，用于测定黑腹果蝇（Drosophila）对特定化学化合物的味觉偏好。
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本文内容
摘要
摘要
动物对环境中气味和味道的感知对其生存至关重要。这些化学感觉最明显的作用是能够区分有益的食物来源和潜在有害的食物来源。味觉需要与化学物质发生直接物理接触，并通过表达在神经元表面的味觉受体传递信号。在昆虫中，这些味觉神经元分布在身体多个部位，使得味觉在多种不同行为中发挥重要作用。昆虫通常偏好含糖化合物，而会回避具有苦味的化合物。鉴于味觉在生物学上的基本重要性，人们迫切希望了解其背后所依赖的分子机制。本文介绍一种成年Drosophila味觉检测方法，可反映动物对特定呈味物质的偏好。该方法适用于任何遗传背景的动物，可用于检测其对特定可溶性化合物的味觉偏好。
引言
动物利用化学感应来区分有利环境与不利环境。这种感知能力对于确定最佳食物来源、避免有毒物质或选择最佳交配对象等行为至关重要1。化学感应通常分为两种感觉系统：嗅觉和味觉。这两类感觉的一个主要区别在于，嗅觉用于感知周围气态化学环境，而味觉则需要与非挥发性物质直接接触。这两种感觉模式均可引发神经反应，这些信号在大脑中被处理和解码，从而产生相应的趋近或回避行为2。因此，这些感觉对动物的生存至关重要。
果蝇 黑腹果蝇 是一种模式生物，其在研究昆虫如何感知气味和味觉方面的应用正日益受到关注。与其他模式系统相比，果蝇具有显著优势，这得益于可用于解析分子、细胞及行为通路的丰富遗传工具。过去15年的研究在鉴定参与嗅觉和味觉的特定细胞类型、神经元受体及信号传导机制方面尤为关键。如今，其强大的 果蝇 遗传学正被用于进一步阐明这些过程在单个神经元和单个神经环路水平上的编码机制3-6因此，能够提供易于评分的感官通路变化读数的检测方法对这些领域的持续发展至关重要。
尽管关于嗅觉信号在大脑中如何编码和处理已有大量研究，但对味觉通路中类似机制的理解却相对有限。本文介绍了一种可用于确定味觉偏好的实验方案 果蝇. 果蝇， 与哺乳动物类似，通常偏好甜味化合物而非苦味化合物。在本实验设计中，可使用这些食物来源的任意组合，以确定已知的遗传改变如何影响味觉选择。此外，也可利用该方法评估药理学干预策略对动物味觉偏好的影响。该检测方法操作简便且具有高度灵活性，是研究味觉感知本质的一种有效范式。 果蝇.
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方案
1. 饥饿处理
- 通过在标准果蝇小瓶底部放置一个用18.2 MΩ水充分浸湿的棉球来制备果蝇饥饿小瓶。或者，也可将一小条滤纸用18.2 MΩ水充分浸湿后斜置于小瓶内。
- 在CO2麻醉垫上收集约100只果蝇为一组，然后将果蝇转移至已准备好的小瓶中。
注意：使用年龄小于5天的果蝇效果最佳。然而，果蝇的确切年龄可作为实验变量加以控制，以研究其味觉偏好随时间的变化。 - 使用棉塞或泡沫塞密封小瓶，并将小瓶水平放置于环境可控的培养箱中。保持温度为25 °C，湿度高于70%。静置培养24小时，期间避免扰动小瓶。
2. 味觉偏好实验
- 在测试当天配制本实验所需的所有味觉刺激物。
注意：具体使用的味觉刺激物取决于所研究的实验问题。以下为本方案中使用的示例味觉刺激物。有关优化信息，请参见第4节。- 通过混合10 µl的100 mM蔗糖溶液、13 µl红色食用色素和977 µl的18.2 MΩ水，配制对照味觉刺激物（1 mM蔗糖）。
- 通过混合50 µl的100 mM蔗糖溶液、10 µl蓝色食用色素和940 µl的18.2 MΩ水，配制实验味觉刺激物（5 mM蔗糖）。
- 使用标准的100 mm × 15 mm塑料培养皿制备实验腔室，具体操作如下：
- 在培养皿边缘靠近12点钟位置放置3滴10 µl的对照味觉刺激物，在6点钟位置再放置3滴。确保各液滴之间的间距相近。
- 在培养皿边缘靠近3点钟位置放置3滴10 µl的实验味觉刺激物，在9点钟位置再放置3滴。确保各液滴之间的间距相近。
- 根据所需重复次数，重复步骤2.2.1和2.2.2。
- 将一管约100只饥饿处理的果蝇轻轻倒在CO2麻醉垫上，麻醉时间以刚好使所有果蝇完全麻痹为宜（约10秒）。用毛刷将果蝇转移至已准备好的实验腔室中央，并盖上培养皿盖。
注意：应避免过长的CO2暴露时间，以缩短恢复时间并减少对摄食行为的干扰。可改用冰浴（约5分钟）进行麻醉，以避免即使短暂暴露于CO2也可能引起的摄食行为影响。 - 将实验腔室放入不透明的纸板箱中。务必在纸板箱外标注所测试的实验条件和基因型。
- 将整个装置（即步骤2.4中的纸板箱内含实验腔室）置于25 °C、湿度至少为70%的培养箱中孵育2小时。
- 对所有重复样本重复执行步骤2.3至2.5。
- 孵育2小时后，将仍置于纸板箱中的实验腔室直接转移至-20 °C冰箱冷冻，直至准备进行定量分析。
3. 味觉偏好实验定量分析
- 让单个检测室升温至室温（约 5 分钟）。
- 在解剖显微镜下，使用毛刷或镊子根据动物腹部的颜色将其分组：红色、蓝色、紫色或无色（图 1）。
- 记录每组动物的数量。将无色动物视为未参与检测，因此在任何计算中均不包含这些动物。
- 根据以下公式之一计算偏好指数：
- 如果目标实验味觉刺激物添加至红色染料中，则使用公式 (Nred +0.5Npurple)/(Nred +Nblue + Npurple)。
- 如果实验味觉刺激物添加至蓝色染料中，则调整公式为 (Nblue +0.5Npurple)/(Nblue +Nred + Npurple)。
- 对所有实验条件和重复实验进行重复计算。
4. 味觉偏好实验的优化
- 通过以下方法实证确定食品着色剂指示物的使用浓度，以确保食品着色剂不会影响味觉检测的结果：
- 使用相同的基础化合物配制4种味觉刺激物（例如 5 mM蔗糖），如步骤2.1所述，但省略食用色素。
- 在其中一种呈味物质中加入1.3%的红色食用色素。其余3种呈味物质分别用不同浓度的蓝色食用色素配制，每管一种浓度（例如 0.6%、1% 和 1.3%
- 对每一对呈味物质完成步骤2.2至3.4：1.3%红色 vs. 0.6%蓝色；1.3%红色 vs. 1%蓝色；以及1.3%红色 vs. 1.3%蓝色。
- 重复步骤 4.1.1–4.1.3，使用不同百分比的蓝色食用色素，直至偏好指数平均值达到 0图2).
注意：作为起始参考，1.3% 的红色食用色素与 1% 的蓝色食用色素组合通常可获得良好效果。若无法找到与 1.3% 染料相匹配的满意蓝色食用色素浓度，则可保持蓝色食用色素浓度不变，重复步骤 4.1.1 至 4.1.3，调整红色食用色素的浓度进行优化。 - 使用相同优化浓度的食用色素分析所有待测条件。
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结果
以下显示了味觉偏好实验中一些典型的结果。在大多数实验中，腹部着色强度会存在一定程度的变化（图1）。无论腹部着色强烈或微弱，均被视为已发生摄食行为。因此，建议研究人员在对实验分组设盲的条件下对动物进行评分，以尽量减少潜在的偏倚。
选择不影响偏好实验结果的食用色素浓度也非常重要。图2展示了使用不同食用色素浓度所产生后果的一个示例。在此示例中，红色食用色素的浓度保持在1.3%，而蓝色食用色素的浓度则分别设置为0.6%、1%和1.3%。每种色素均添加至5 mM蔗糖溶液中，以确保实验中有较高比例的受试个体参与。随后对每种条件下的3个重复样本进行味觉偏好实验，并根据3.4.1节中的公式计算偏好指数。结果表明，1.3%红色色素与1%蓝色色素的组合对此类实验最为理想，表现为动物未表现出对任一颜色中蔗糖的明显偏好（偏好指数接近0.5）。当1.3%红色色素与仅0.6%蓝色色素配对时，动物明显倾向于选择含红...
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讨论
我们已描述了一种简单而有效的测定味觉偏好的实验方案 果蝇该检测方法的不同版本通常用于实验中，以确定味觉受体（GRs）在感知不同味质（苦、甜、酸、咸和鲜味）中的作用。 果蝇 基因组包含约60个基因，通过可变剪接编码出68种已鉴定的味觉受体8,9然而，其他蛋白质如离子型谷氨酸受体和TRP通道也被证实参与味觉过程10-13因此，昆虫在味觉辨别能力方面表现出极大的多样性。此外，与嗅觉受体不同，味觉受体表达于遍布果蝇全身的细胞中。表达不同味觉受体的神经元组合可存在于唇瓣、足、翅和产卵器上的感受器（sensilla）中。14因此， 果蝇 依赖味觉辨别能力来完成多种超出营养摄取范围的行为，包括求偶和产卵。
这种味觉分析技术可用于解决多种不同的实验问题。例如，由于味觉、求偶和产卵行为对许多动物而言至关重要，本方案可扩展应用于其他重要昆虫，如蜱虫和蚊子。此类拓展在疾病媒介控制和杀虫剂开发方面可能具有重要用途。此外，该检测方法还可用于正向遗传学筛选，正是这类筛选使果蝇（Dro...
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披露
作者声明不存在任何竞争性经济利益。
致谢
我们感谢 Tessier 实验室成员在本方案准备过程中对本文稿的仔细审阅和提出的宝贵建议。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 蓝色食用色素（水、丙二醇、FD&C 蓝 1 和红 40、丙基对羟基苯甲酸酯） | McCormick | N/A | |
| 无分隔冷冻盒（Cryo/Freezer Boxes） | Fisher | 03-395-455 | |
| Dumont #5 镊子 | Fine Science Tools | 11251-20 | |
| 冰醋酸 | Fisher | BP2401-500 | |
| Leica S6 E 体视变倍显微镜 0.63X-4.0X | W. Nuhsbaum, Inc. | 10446294 | |
| 培养皿（100 mm × 15 mm） | BD Falcon | 351029 | 若彻底清洗并干燥后可重复使用 |
| Quick-Snap 微量管 | Alkali Scientific Inc. | C3017 | |
| 红色食用色素（水、丙二醇、FD&C 红 40 和红 3、丙基对羟基苯甲酸酯） | McCormick | N/A | |
| 蔗糖 | IBI Scientific | IB37160 |
参考文献
- Herrero, P. Fruit fly behavior in response to chemosensory signals. Peptides. 38 (2), 228-237 (2012).
- Vosshall, L. B., Stocker, R. F. Molecular architecture of smell and taste in Drosophila. Annu Rev Neurosci. 30, 505-533 (2007).
- Harris, D. T., Kallman, B. R., Mullaney, B. C., Scott, K. Representations of Taste Modality in the Drosophila Brain. Neuron. 86 (6), 1449-1460 (2015).
- Hong, E. J., Wilson, R. I. Simultaneous encoding of odors by channels with diverse sensitivity to inhibition. Neuron. 85 (3), 573-589 (2015).
- Kain, P., Dahanukar, A. Secondary taste neurons that convey sweet taste and starvation in the Drosophila brain. Neuron. 85 (4), 819-832 (2015).
- Masek, P., Worden, K., Aso, Y., Rubin, G. M., Keene, A. C. A dopamine-modulated neural circuit regulating aversive taste memory in Drosophila. Curr Biol. 25 (11), 1535-1541 (2015).
- Charlu, S., Wisotsky, Z., Medina, A., Dahanukar, A. Acid sensing by sweet and bitter taste neurons in Drosophila melanogaster. Nat Commun. 4, 2042(2013).
- Clyne, P. J., Warr, C. G., Carlson, J. R. Candidate taste receptors in Drosophila. Science. 287 (5459), 1830-1834 (2000).
- Scott, K., et al. A chemosensory gene family encoding candidate gustatory and olfactory receptors in Drosophila. Cell. 104 (5), 661-673 (2001).
- Kim, S. H., et al. Drosophila TRPA1 channel mediates chemical avoidance in gustatory receptor neurons. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (18), 8440-8445 (2010).
- Koh, T. W., et al. The Drosophila IR20a clade of ionotropic receptors are candidate taste and pheromone receptors. Neuron. 83 (4), 850-865 (2014).
- Zhang, Y. V., Ni, J., Montell, C. The molecular basis for attractive salt-taste coding in Drosophila. Science. 340 (6138), 1334-1338 (2013).
- Zhang, Y. V., Raghuwanshi, R. P., Shen, W. L., Montell, C. Food experience-induced taste desensitization modulated by the Drosophila TRPL channel. Nat Neurosci. 16 (10), 1468-1476 (2013).
- Liman, E. R., Zhang, Y. V., Montell, C. Peripheral coding of taste. Neuron. 81 (5), 984-1000 (2014).
- Rodrigues, V., Cheah, P. Y., Ray, K., Chia, W. malvolio, the Drosophila homologue of mouse NRAMP-1 (Bcg), is expressed in macrophages and in the nervous system and is required for normal taste behaviour. EMBO J. 14 (13), 3007-3020 (1995).
- Tanimura, T., Isono, K., Yamamoto, M. T. Taste sensitivity to trehalose and its alteration by gene dosage in Drosophila melanogaster. Genetics. 119 (2), 399-406 (1988).
- Weiss, L. A., Dahanukar, A., Kwon, J. Y., Banerjee, D., Carlson, J. R. The molecular and cellular basis of bitter taste in Drosophila. Neuron. 69 (2), 258-272 (2011).
- French, A. S., et al. Dual mechanism for bitter avoidance in Drosophila. J Neurosci. 35 (9), 3990-4004 (2015).
- Deshpande, S. A., et al. Quantifying Drosophila food intake: comparative analysis of current methodology. Nat Methods. 11 (5), 535-540 (2014).
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